反義核酸藥物的研究現狀

1、反義核酸藥物的研究現狀獸醫(yī)學院藥理05研 王冬梅 2005227018摘要 反義藥物以其合理設計藥物的可能性和精確的特異引了人們的注意，但反義藥物的研究并非如人們最初預想的那樣簡單。本文從其特異性，穩(wěn)定性，透過靶細胞的能力，作用強度，活性判定，給藥途徑，安全性和毒性，生產成本等諸方面對反義藥物的研究現狀，現存問題進行了綜述。相信伴隨這些問題的解決，反義藥物很可能成為藥典的一部分，給疾病的治療帶來益處。關鍵詞 反義寡核苷酸；反義藥物；基因治療反義核酸藥物即反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotide，ODNs)其核苷酸序列可與靶mRNA或靶DNA互補，抑制或封閉該基因的轉錄和表

2、達，或誘導RNaseH識別并切割mRNA，使其喪失功能。反義核酸藥物是藥理學的新領域或革命，即:新的藥物反義寡核苷酸；新的藥物受體mRNA；新的受體結合方式Watson-Crick雜交；新的藥物受體結合后反應：(1)RNaseH介導的靶RNA的降解；(2)抑制DNA的復制和轉錄及轉錄后的加工和翻譯等。應該說，ODNs治療比傳統(tǒng)的治療有更高的特異性。從70年代末到現在二十年過去了，反義核酸藥物已從實驗室研究進入市場。特別是第一個反義核酸藥物Fomivirsen上市后，人們對反義療法更為重視。ODNs可以作為研究工具，用于對一些特定蛋白和基因的生理功能的研究，也可作為治療藥物用于病毒性疾病、心血管

3、系統(tǒng)疾病!癌癥和感染性疾病等許多疾病的治療。然而，開發(fā)這些藥物并非易事，首先，消除單個基因的能力還需要進一步的證實，而且一些不期望產生的非反義作用逐漸顯現出來。雖然，某些非反義作用也肯定有治療價值，但由于非反義作用通常是不可預知的，因此，難以以此來合理設計藥物。目前的研究現狀及存在的問題主要有以下幾個方面：一、 ODNs能否以序列依賴的方式調節(jié)特異蛋白的功能反義核酸藥物盡管存在一些非特異的作用，但仍能在體內外結合到特異的RNA上，選擇性地減少靶基因的產生而產生藥理學作用。為了解決這一問題，科學家通常需要設計多個針對不同RNA區(qū)域的ODNs，找出作用較強和選擇性較高的ODNs；另外，在設計反義化

4、合物時，注意選擇特別易于遭受攻擊的靶基因或靶點；此外，反義ODN的長度也與特異性有關，一般來說，越長其特異性越高，大于17個堿基的寡核苷酸與非靶基因雜交的可能性不大，但在體內經過代謝過程可能使鏈長度縮短，仍有可能與非靶基因結合。目前，反義ODN的長度多為1520個堿基，一般可在統(tǒng)計學上保證其特異性?？傊?，經過認真的選擇，設立合適的對照并作出劑量反應曲線，通過大量和仔細的實驗，ODNs作為有效的研究工具和治療藥物是可能的。需要提及的是，理論上靶基因或靶序列在基因組里只出現一次，但目前還從未證實反義核酸藥物具有只敲除一個基因的能力。另外，一些ODNs的作用來自于它的非反義作用，這似乎是不利的，但只

5、要該作用有益，而且有高的治療指數，仍然有臨床應用價值。如抗凝血酶的寡核苷酸，就以其非反義機制產生作用，現在該藥正在進行臨床前的實驗。還有另一個非反義寡核苷酸，即整合酶的抑制劑也正作為抗HIV藥用于臨床實驗。二、Ns在體內的穩(wěn)定性反義寡核苷酸必須不被內源性核酸酶降解，并被送到靶細胞內才能產生最大的效應。ODNs雖能用病毒載體轉入細胞內，但考慮到安全性和臨床的應用，促使人們研究和開發(fā)非病毒轉移系統(tǒng)，即對ODNs作化學修飾和結構改造?；瘜W修飾可以增加反義ODN的穩(wěn)定性。方法主要有：(1)改變立體構型，如由天然的糖苷鍵改為A型；(2)ODN的磷酸二酯鍵被甲基!乙基和硫等化學基團取代和修飾；(3)ODN

6、的末端修飾，如連接疏水基團膽固醇；(4)肽核酸(peptidenucleicacids，PNAs)用多肽取代磷酸二酯鍵，肽核酸在化學上與肽和蛋白質更為接近，是一類非常有希望的基因治療藥物，最近有許多研究進展。開發(fā)PNA作為治療藥物在不久的將來可能產生突破，PNA的反義活性已在培養(yǎng)的神經細胞甚至在大鼠腦內注射后得到證實。在化學修飾中，硫代磷酸寡核苷酸(phosphorothioateoligodeoxy2nucleotide，PS2ODN)是最為廣泛應用的，現在進入臨床的所有ODNs幾乎都是PS2ODN，稱第一代反義藥物，它有良好的溶解性、雜交性和穩(wěn)定性，并能誘導RNaseH。在細胞系的研究中，

7、證實它可以抑制靶mR2NA的表達長達2448小時。若重復給藥或加以其它修飾，則可延長其作用時間。在整體情況下，PS-ODN的血漿半衰期(T1/2A和T1/2B)依給藥的劑量和動物種屬的不同，可以持續(xù)數分鐘至數小時不等。其排泄主要通過尿。它的代謝過程比較復雜，但大部分降解產物似乎都是由3外切核酸酶產生的。應用多種化學修飾將更為有益。最近的研究證實，雜合型和嵌合體結構的反義寡核苷酸表現出與PS-ODN類似的組織分布，但體內穩(wěn)定性可明顯提高，如T1/2延長。正在研究的第二代反義藥物主要是嵌合體結構，以PS-ODN為核心，兩翼核苷酸序列上核糖的2位被其它基團所修飾，已顯示良好的前景。第二代寡核苷酸的優(yōu)

8、越之處在于：對核酸酶的抗性增高；其誘導RNaseH酶剪切的活性得到保持和提高；其生物活性與PS-ODN相當，且大大改善了由PS-ODN所造成的毒副作用(主要由于降低了寡核苷酸骨架的多陰離子性質)。 三、ODNs的體內過程及其穿透細胞的能力反義分子必需能以一定的數量接近靶組織，并穿入細胞膜進入細胞內方能產生作用。目前對ODNs與血漿成分的相互作用，它在組織中的分布和細胞內的蓄積的機制了解甚少。PS-ODNiv，ip和皮下給藥后能迅速從血漿分布到除腦以外的外周組織。在肝!腎的蓄積濃度最高。其它組織如腸!脾!皮膚和骨髓也可達到高濃度。早期(約在給藥后2小時)與細胞外成分結合的ODNs和一些細胞內的O

9、DNs可以出現。后期，ODNs可以大量出現在細胞內，如在腎臟的近曲小管上皮細胞內?，F有的研究結果證實，ODNs是可以進入細胞的，但機制尚不清楚。不同的ODNs進入細胞的方式可能有所不同，在哺乳動物細胞，ODNs可以通過主動過程進入細胞內，如通過受體的介導或通過細胞內吞作用進入細胞內與膜結合的囊胞中，此外也有其它方式。1992年，Bid2ker等從CHO成纖維細胞(HL60)和其它一些細胞類型的細胞膜上分離到一種80kD的蛋白，該蛋白可以特異的結合PS-ODN。類似的已分離到的受體蛋白還有79kD和90kD等。不同的ODNs進入細胞的難易程度不同，硫代磷酸-ODN難于透過細胞膜，在細胞內達到平衡

10、的時間比未修飾的ODNs長，且細胞內的蓄積量也較少。但用脂質體包裹，用低密度脂蛋白，或增加反義藥物中的含G量，或用新戊酰羥甲基暫時屏蔽PS-ODN的負電荷等方法均有可能增加ODNs透過細胞的能力。此外，應用抗體!肽!碳水化合物和維生素也可以增加ODNs接近靶細胞的能力。另外，我們知道常規(guī)應用的ODNs和肽核酸不易通過血腦屏障(BBB)，它僅允許分子量<600Da的親脂性分子的通透。偶聯streptavidin(SA)和轉鐵蛋白受體OX26單抗的細胞轉移系統(tǒng)可作為通用載體轉運單生物素化的肽、ODNs或PNAs到表達轉鐵蛋白受體的組織。OX26單抗通過BBB上的轉鐵蛋白受體的transcyt

11、osis轉運反義核酸藥物進入血腦屏障。3生物素化的磷酸二酯(PO)-ODN可完全保護ODN抵抗血清和細胞的3核酸外切酶，促進核酸酶H的偶聯和激活，在Alzheimers病和HIV-AIDS的模型中，這些轉移系統(tǒng)顯著增加細胞攝取PO-ODNs并加強其反義效應。但生物素化的PO-ODNs和PO-PS-ODN雜交體易于在體內被核酸內切酶降解。也有報道在3末端生物素化的PS-ODNs在體內代謝穩(wěn)定，并抵抗核酸外切酶和內切酶的降解，然而由于這些低聚物與血漿蛋白有強的結合，難于轉移到腦內。另外由OX26-SA作轉移載體的PS-ODNs也很少能通過靜脈給藥跨越BBB轉運進入腦。而PNAs不僅抵抗核酸外切酶/

12、內切酶及蛋白酶的降解，而且發(fā)現這些分子在氨基末端被生物素化并由OX26-SA作轉移系統(tǒng)后，其腦的攝取水平可與嗎啡相比?？傊?，多項實驗證實PNA-OX26-SA偶聯體可保持對靶mRNA的有效識別并使之滅活，提示PNA-OX26-SA偶聯體是轉移藥物到腦組織的最好的反義分子。值得注意的是，在培養(yǎng)細胞中觀察到的現象與整體給藥的情況并不一致。如反義PS-ODN為多聚陰離子，不易透過細胞膜，體外實驗常需要脂質體的包裹導入細胞，但在動物實驗中，反義藥物能順利的到達靶器官，其機制還不清楚。四、抑制靶基因的表達能力ODNs是否能接近靶基因，與靶基因雜交?回答這個問題很復雜，但認為在某些細胞是可以的。粗略估計在

13、一個細胞內mRNA的濃度為20nmol/L(可以表達約1萬個拷貝的靶基因)。藥理學劑量的ODNs為36mg/kg，在腎臟和肝臟可以達到515和15Lmol/L。有些組織可能會<0.051Lmol/L(如腦)，但在某些細胞內，其濃度可增加到10倍以上。理論上，這樣的濃度遠超過實際mRNA的濃度，ODNs如能接近靶基因，應能抑制靶基因的表達。 ODNs進入細胞后可分布于胞質和核內，也可少量結合在細胞膜上。這取決于ODNs的種類!性質以及進入細胞的方式。而與其長度!序列和細胞系無關。多數研究報道表明PS-ODN以時間依賴的方式從液泡中分布進入胞質和核內。脂質體包裹的方式有助于PS-ODN進入細

14、胞核。將PS-ODN微量注射入細胞質，將最終定位在細胞核。若PS-ODN僅定位在內含體中，將降低其在活性部位胞質和核內的反義效率。五、加ODNs的作用強度至少有三種機制可以增加ODNs在體內的作用強度：加強其與受體的親和力降低其與非受體的相互作用；增加其轉移到位于亞細胞結構中受體的效率?；瘜W修飾可以使ODNs與靶mRNA的親和力增加，這些修飾也同時降低ODNs與其它蛋白質的相互作用，從而達到前兩種目的。但加強其轉移到細胞內的效率仍無太大的進展。六、判斷活性ODNs如上所述，對于一個mRNA來說不是所有的靶點都是容易達到的。一般認為，設計反義藥物選擇的靶點一般為mRNA的5端起始密碼AUG周圍和

15、核糖體的裝配部位，反義藥物容易達到，活性較高。但研究表明mRNA的其它位置亦可成為設計的靶點，尤其是3.端的非翻譯區(qū)。Monia等選擇C-rafmRNA的5端、3端以及編碼區(qū)的34個位置作靶點設計反義藥物，結果作用于3非翻譯區(qū)的ISIS5132的活性最強。目前，RNA高親和力靶點的判定全憑經驗隨機篩選ODNs，比較盲目，既不經濟，也不知是否真的拿到了高親和力的ODNs。鑒定的方法需要改進，比較理想的是應用計算機手段，但由于對RNA結構了解的限制，近年之內難有大的進展。七、口服及其它給藥途徑的研究現行ODNs采取非口服給藥方式。但口服給藥對于疾病的長期治療可能更為方便。1995年，Agrawal

16、及其同事應用2氧位甲基硫代磷酸酯寡核苷酸，使其在消化道的穩(wěn)定性加強，口服的生物利用度增加。如對ODNs作進一步的化學修飾，口服給藥將是可行的。當然也應研究除口服以外的其它非注射給藥途徑。病灶周圍的局部用藥，可能會產生更為明顯的優(yōu)越性，提高局部的藥物濃度從而增加特異性并降低毒性，同時降低藥物的成本。實際上，目前反義核酸藥物已能通過多種途徑給藥，包括氣溶膠的吸入、滴鼻、iv和腹腔注射。八、降低毒性關于毒性問題，目前尚未很好的解決。生命受到威脅的AIDS病和癌癥病人通常可以耐受一定程度的非特異毒性。反義藥物的毒性依發(fā)生的原因不同可分為兩類：一種是以藥效學為基礎的毒性，是其反義作用過強或與非靶基因產生

17、反義作用而導致的毒性，應盡量避免設計與非靶基因雜交的反義寡核苷酸。另一種毒性是ODNs與其它分子(如蛋白)相互作用的結果，可能有序列特異性也可能與序列無關。多數PS-ODN的毒性是由于此種原因所致，由于它們的生物物理性質相似，毒性譜也相似。主要有：補體激活、凝血時間延長、肝腎毒性、致死性的血液動力學改變等。提高反義寡核苷酸的特異性，對其進行化學修飾，或封閉硫代磷酸鏈中的多陰離子，或采用局部給藥的方式等將有可能增加其特異性，從而減少劑量，降低其毒性。此外，選擇良好的釋藥系統(tǒng)將增加作用強度而降低不良反應，最終也將降低藥物的消耗和費用。目前正在開發(fā)新的ODNs，在這方面將有所改進，以產生更特異的作用

18、。九、展望總之，ODNs的未來取決于上述問題的解決，及臨床實驗的成功結果。隨著基因組序列信息的不斷增加，科學家需要有效的研究方法以迅速證實靶基因的生物功能，并希望能開發(fā)出與靶基因相互作用的有效治療藥物。ODNs是最能邏輯解決這些問題的工具，也是合理設計和開發(fā)藥物的重要途徑。另外，反義核酸藥物在臨床上有較強的發(fā)展?jié)摿?，因為從化學合成開始到臨床前藥動學及毒理學研究的設計，都是從分子靶到分子靶。Science雜志1998年7月報道了第一個通過FDA咨詢委員會的反義藥物即用于治療AIDS病人巨細胞病毒感染的視網膜炎的fomivirsen(或稱Vitravene)，它雖需要直接注射入眼內，但有超過其它一

19、些抗病毒藥物的優(yōu)點：作用靶點限局，僅造成輕微的不良反應，如眼內壓升高和炎癥，這些不良反應一般是短暫的，并可通過局部使用甾體激素得到緩解。Fomivirsen的上市可以說是開發(fā)反義藥物的一個里程碑。相信不久的將來反義藥物很可能成為藥典的一部分，給疾病的治療帶來益處，反義藥物的發(fā)展具有光明的前景。參考文獻1 CrookeST. Oligonucleotide analogs might be de-signed to bind to mRNA. Anticancer drug Des,1997,12:311313.2 Branch AD. A good antisense molecule is hard to find. Trends Biochem Sci, 1998, 23:4550.3 Birikh KR， Heaton PA， Eckstein F. The structure, function and application of the hammerhead ri-bozyme.Eur J Biochem，1997，245:116.4 Akhtar S， Agrawal S. In vivo studies with anti-sense oligonucleotides. Trends Phamacol Sci， 1997