新型混合取代環(huán)糊精毛細管電泳對藥物的手性分離

1、新型混合取代環(huán)糊精毛細管電泳對藥物的手性分離應(yīng)津津1，梅潔1，肖玉秀1作者簡介：應(yīng)津津，女，碩士研究生 * 通訊作者：肖玉秀，女，教授 Tel: (027) 68759990 E-mail: yuxiuxiao，任勇2（1.武漢大學(xué)藥學(xué)院，武漢430072；2.南京師范大學(xué)藥物超分子材料及應(yīng)用實驗室，南京210046）藥物超分子材料及應(yīng)用實驗室摘要:目的考察新型混合取代環(huán)糊精衍生物羥丙基-磺丁基-b-環(huán)糊精(HP-SBE-b-CD) 對四種堿性藥物的對映體分離，并比較其與單一取代環(huán)糊精衍生物手性識別能力的強弱。方法采用毛細管區(qū)帶電泳模式，研究HP-SBE-b-CD對手性藥物的拆分，探討環(huán)糊精濃

2、度和取代度、緩沖液的pH值和濃度、有機改性劑含量以及分離電壓對堿性藥物對映體手性分離的影響；比較HP-SBE-b-CD、羥丙基-b-環(huán)糊精 (HP-b-CD) 與磺丁基-環(huán)糊精 (SBE-b-CD) 手性拆分能力的強弱。結(jié)果電泳條件為Tris-磷酸鹽緩沖液(pH 2.5, 60 mmol·L 1)，運行電壓18 kV，有機改性劑甲醇含量15%時，四種堿性藥物達到較好分離；手性識別能力大小SBE-b-CD > HP-SBE-b-CD > HP-b-CD。結(jié)論本實驗對HP-SBE-b-CD手性拆分的初步探究可為混合取代環(huán)糊精衍生物的應(yīng)用和具有高手性分離能力的衍生化環(huán)糊精的合成

3、提供重要依據(jù)。關(guān)鍵詞: 手性分離；羥丙基-磺丁基醚-b-環(huán)糊精；毛細管電泳；結(jié)合常數(shù)Chiral separation of drugs by capillary electrophoresis with a new mixed-substituted cyclodextrinABSTRACT: OBJECTIVE To investigate the enantioseparation of four basic drugs using capillary electrophoresis (CE) with a new mixed-substituted derivative of cycl

4、odextrin，hydroxypropyl-sulfobutylether-b-cyclodextrin (HP-SBE-b-CD), and compare the chiral recognition ability of HP-SBE-b-CD with that of mono-substituted derivatives. METHODS The effects of concentration and substitution degree (SD) of HP-SBE-b-CD, concentration and pH value of electrophoretic bu

5、ffer, the organic modifier, separation voltage on enantioseparation of basic drugs were investigated; also, the chiral separation abilities of HP-SBE-b-CD, hydroxypropyl-b-cyclodextrin (HP-b-CD) and sulfobutylether-b-cyclodextrin (SBE-b-CD) were compared. RESULTS Good separation was achieved under t

6、he following conditions: running buffer, 60 mmol·L 1 Tris-phosphate buffer(pH 2.5); running voltage , 18 kV ; organic modifier, 15% methanol (v/v). The ability of chiral separation: SBE-b-CD > HP-SBE-b-CD > HP-b-CD. CONCLUSIONThe initial investigation on the new HP-SBE-b-CD was carried ou

7、t, providing import basis for the application of mixed-substituted CD derivatives and the synthesis of new CD derivatives with high chiral recognition ability. KEY WORDS: chiral separation; hydroxypropyl-sulfobutylether-b-cyclodextrin; capillary electrophoresis; binding constant環(huán)糊精 (CD) 及其衍生物是毛細管電泳

8、(CE) 中最常用的手性選擇劑1。相比于天然環(huán)糊精，環(huán)糊精衍生物在水溶性和與客體分子的配位能力上有很大提高，而且?guī)щ姯h(huán)糊精能分離電中性和帶電的手性藥物。因此，改性環(huán)糊精用于手性藥物的拆分研究是一項具有挑戰(zhàn)意義的課題。目前大部分的環(huán)糊精衍生物是單一取代基產(chǎn)物，近年來又發(fā)展出混合取代基衍生物的制備方法。新合成的羥丙基-磺丁基-環(huán)糊精 (HP-SBE-CD) ，是將兩種不同的親水基團直接引入-環(huán)糊精的混合取代衍生物，水溶性好，包合藥物能力較強2。為考察混合取代環(huán)糊精衍生物的手性拆分能力，本實驗采用毛細管區(qū)帶電泳模式，以HP-SBE-CD為手性選擇劑分離四種堿性藥物，探討環(huán)糊精濃度及取代度、緩沖液pH

9、值及濃度、有機改性劑含量、電壓等因素對藥物對映體分離的影響，并從理論上對CZE環(huán)糊精手性拆分的主體選擇性進行初步探討。同時將該混合取代的環(huán)糊精與目前廣泛使用的電中性的羥丙基-環(huán)糊精 (HP-CD)和負電荷的磺丁基-環(huán)糊精 (SBE-CD) 作比較，探討三者的手性識別能力。1儀器與試劑CAPEL-105型毛細管電泳儀 (Lumex，俄羅斯)。外消旋體阿替洛爾、鹽酸阿普洛爾、鹽酸醋丁洛爾 (MP，法國)，鹽酸普萘洛爾 (Sigma，德國)，三羥甲基氨基甲烷 (Tris-base，Amresco，美國)，HP-SBE-CD (取代度SD分別為HP：SBE = 6：1.5，5.5：3.0，3.4：3.

10、1，1.18：3.5)、HP-CD (SD = 2)、SBE-CD (SD = 6.4) (南京師范大學(xué))，去離子水，其余試劑均為分析純。2 實驗方法2.1 溶液的配制Tris-H3PO4緩沖液：精密稱取Tris，加水溶解完全，用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.50，再以水定容至100 mL，得一定濃度的Tris- H3PO4緩沖液，備用。環(huán)糊精儲備液：精密稱取一定質(zhì)量的各種環(huán)糊精，加水溶解完全，再以水定容至10 mL，配成濃度為50 mmol·L 1的環(huán)糊精母液，待用時用Tris- H3PO4緩沖液稀釋。所有樣品及緩沖溶液使用前均通過0.45 µm濾膜過濾并超聲脫氣。2.2 毛細管電泳

11、條件毛細管50 cm×50 m (有效長度41 cm)；操作電壓18 kV；檢測波長214或224 nm；壓力進樣30 mbar×5 s。兩次運行間依次用0.l mol·L1 NaOH沖洗1 min，水沖洗1 min，電泳緩溶液沖洗2 min。兩對映體之間的分離度Rs用下面公式計算： (1) 式中和代表兩對映體的遷移時間，和代表兩對映體的半峰寬。3 結(jié)果與討論3.1 環(huán)糊精濃度對分離的影響實驗考察了HP-SBE-CD (SD = 5.5:3.0) 濃度(0.5-16 mmol·L 1)對四種堿性藥物分離的影響。結(jié)果表明，各藥物對映體達到分離時所需的環(huán)糊精

12、濃度相差較大：普萘洛爾 < 阿普洛爾 < 阿替洛爾 < 醋丁洛爾；由于CD濃度的選擇與它和藥物形成的絡(luò)合物的穩(wěn)定常數(shù)有關(guān)，穩(wěn)定常數(shù)越大，所需手性試劑的濃度越低；反之則越高，而穩(wěn)定常數(shù)是衡量CD與藥物結(jié)合能力大小的指標，由此可推斷HP-SBE-CD與藥物對映體包結(jié)能力強弱順序為：普萘洛爾 > 阿普洛爾 > 阿替洛爾 > 醋丁洛爾，這可能與藥物的結(jié)構(gòu)有關(guān)3。普萘洛爾因分子結(jié)構(gòu)中兩個苯環(huán)顯示出高親油性，使其和環(huán)糊精間有更高的親和力，以致藥物與環(huán)糊精的疏水空腔匹配良好。阿普洛爾也有較高的分離度，因為鄰位上的長碳鏈和普萘洛爾的第二個苯環(huán)有相似的空間相互作用。醋丁洛爾之

13、所以分離效果最差是因為對位上取代的長碳鏈阻礙分子與環(huán)糊精外圍的基團相互作用，降低了絡(luò)合物的穩(wěn)定狀態(tài)。本實驗以阿替洛爾和醋丁洛爾為例，測定不同環(huán)糊精濃度下兩個對映體的遷移時間，計算出對映體與環(huán)糊精的結(jié)合常數(shù)，從理論上對環(huán)糊精手性拆分的最佳濃度及主體選擇性進行了初步探討。設(shè)不加環(huán)糊精時兩對映體的遷移率為，為結(jié)合物的遷移率，為經(jīng)電流校正后兩對映體的表觀遷移率。 (2)由l/CD對作一直線，截距與斜率之比即為對映體與CD的結(jié)合常數(shù)K4。求得阿替洛爾的K1和K2值分別為56.7、62.3，醋丁洛爾的K1和K2值分別為44.6、47.5，并可粗略得出醋丁洛爾所需的最佳CD濃度 (約21.7 mmol

14、83;L 1) 比阿替洛爾所需的 (約16.8 mmol·L 1) 高(5)。由此可以看出，新合成的HP-SBE-CD與阿替洛爾對映體的結(jié)合常數(shù)較大，說明阿替洛爾與HP-SBE-CD空腔的匹配程度較好。3.2 緩沖液pH值對分離的影響研究了50 mmol·L 1 Tris-H3PO4電泳緩沖液pH值在2.5-7.0范圍內(nèi)變化時對藥物手性拆分的影響。由圖1可知，pH為2.5最適合這四種堿性藥物的分離。在低pH情況下，電滲流很小，帶負電的HP-SBE-CD與帶正電的堿性藥物作用時間增長，從而使對映體更好地分離。且此pH值接近H3PO4的pKa值 (2.1) ，緩沖溶液具有較大的

15、緩沖容量從而可減小在電泳過程中由電解作用所引起的pH變化。3.3 緩沖液濃度對分離的影響實驗探究了Tris濃度變化 (20-100 mmol·L 1) 對藥物手性分離的影響。當濃度為60 mmol·L 1時，藥物的分離效果最好。在焦耳熱可以忽略的情況下，增加緩沖液的濃度，則有更多正電的Tris+與毛細管壁上的硅羥基反應(yīng)，可以降低電滲流，從而改善 Rs。但電解質(zhì)濃度過高，焦耳熱增加，分離度和柱效都降低。3.4 有機改性劑對分離的影響在毛細管電泳中，有機溶劑常作為改性劑添加到緩沖液中來改變分離。實驗選用甲醇作為改性劑，探討其含量（0-20%，v/v）對分離的影響。實驗表明在緩沖

16、溶液中加適量的甲醇可以提高分離度，但當甲醇含量增大到20%時分離度降低。這是因為甲醇一方面與環(huán)糊精、對映體可能形成三元包合物，促進包合作用，有利于對映體的拆分；另一方面可能與對映體競爭選擇劑，降低了選擇劑-藥物之間的絡(luò)合作用力。因此，有機溶劑對藥物對映體分離的影響取決于哪方面占主導(dǎo)地位。本實驗以15%的含量為最佳。3.5 分離電壓對分離的影響為了優(yōu)化分離電壓以達到良好的手性拆分效果，實驗考察了15 kV-25 kV電壓對手性分離的影響。隨著分離電壓增大，電場強度增大，離子的遷移速度增加，從而導(dǎo)致對映體與環(huán)糊精的相互作用時間縮短，分離度降低。且電壓的升高，導(dǎo)致產(chǎn)生的焦耳熱增多而降低分離度。綜合考

17、慮遷移時間和分離度，18 kV為較優(yōu)的分離電壓。3.6 環(huán)糊精取代度對分離的影響環(huán)糊精衍生物的取代度不同，對手性藥物的分離效果有很大差異6。實驗選取了四種不同取代度的HP-SBE-CD，羥丙基：磺丁基的取代度分別為6:1.5，5.5:3.0，3.4:3.1，1.18:3.5，考察取代度對分離的影響。圖2和表1顯示連接到環(huán)糊精上的磺丁基基團的個數(shù)顯著影響藥物的手性分離。這是因為磺酸基團在很寬的 pH值范圍內(nèi)均解離帶負電，磺丁基基團的個數(shù)增加，導(dǎo)致環(huán)糊精所帶的負電荷增多，使環(huán)糊精與帶正電荷的藥物間靜電作用力增強，分離度大大改善。另外，負電性的環(huán)糊精在毛細管電泳中的電泳遷移方向與電滲流相反，隨著取代

18、度變化，環(huán)糊精的有效負電荷增加，其電泳遷移率減慢，與藥物結(jié)合后遷移時間明顯延長。3.7 與其它環(huán)糊精衍生物的比較本實驗將新型的HP-SBE-CD (SD：HP：SBE =3.4:3.1) 與已普遍使用的中性HP-CD (SD = 2) 、負電性的SBE-CD (SD = 6.4) 作為手性添加劑，比較單一取代與混合取代環(huán)糊精衍生物的手性識別能力。當阿替洛爾被成功分離時 (分離度為1.06)， 所需的HP-SBE-CD和SBE-CD濃度分別為8 mmol·L 1、2 mmol·L 1；醋丁洛爾分離度為1.20時，需要16 mmol·L 1 HP-SBE-CD或3 m

19、mol·L 1 SBE-CD。而HP-CD濃度達到16 mmol/L仍無法分離對映體。因此可以初步判斷對堿性藥物對映體的手性拆分能力強弱為SBE-CD > HP-SBE-CD > HP-CD。手性識別能力的差別主要與環(huán)糊精的帶電荷數(shù)及結(jié)構(gòu)有關(guān)。前兩者分子中均含磺丁基，使環(huán)糊精帶負電，與帶正電荷的藥物分子之間存在靜電作用力；負電的環(huán)糊精電泳遷移率與電滲流反向，分析窗口增大，藥物與環(huán)糊精的作用時間延長，有利于對映體的分離。因此帶電的手性選擇劑在選擇性上較電中性的手性選擇劑更為有效。在總?cè)〈认嗤那疤嵯?，羥丙基和磺丁基存在競爭關(guān)系，相當于羥丙基取代了一部分磺丁基而由SBE-C

20、D衍變?yōu)镠P-SBE-CD，環(huán)糊精分子所帶的有效電荷數(shù)減小，與藥物的靜電作用力減弱，手性識別能力減小。而且被磺丁基取代與被羥丙基取代相比環(huán)糊精分子的口徑更大，可使客體分子更容易與環(huán)糊精形成包合物，這就使SBE-CD對對映體的分離選擇性更高。根據(jù)上述分析推斷：若保持HP-SBE-CD與SBE-CD中磺丁基的取代度一致，則HP-SBE-CD中羥丙基的取代可能通過氫鍵等作用改變環(huán)糊精的空腔大小及環(huán)糊精與磺丁基、緩沖液等相互作用而顯示截然不同的分離能力。由于實驗室HP-SBE-CD的取代度有限，目前未能開展實驗來驗證該推論，有待日后進一步研究。本實驗對HP-SBE-b-CD手性拆分能力的初步探究可為混

21、合多取代環(huán)糊精衍生物對藥物對映體的分離提供理論依據(jù)，并為合成具有高手性分離能力的衍生化環(huán)糊精提供一定的參考。參考文獻1 Vespalec R, Boek P. Chiral Separations in Capillary Electrophoresis J. Chem Rev, 2000, 100:3715-3753.2 Nanjing Normal University. Hydroxypropyl-sulfobutyl-b-cyclodextrin, the preparation method, the analytical method and the pharmaceutical

22、application thereof:World, WO 2007/051358 A1 P. 2007-05-10.3 Vargas M G, Heyden Y V, Maftouh M, et al. Rapid development of the enantiomeric separation of b-blockers by capillary electrophoresis using an experimental design approach J. J Chromatogr A, 1999, 855:681-693.4 Salvador, Varesio E, Dreux M, et al. Binding constant dependency of amphetamines with various commercial methylated beta-cyclodextrinsJ. Electrophoresis, 1999, 20:2670-2679.5 Lin X L, Zhu C F, Hao A Y. Evaluation of newly synthesized derivative of cyclodextrin for the capil