硫苷脂和燒傷后血清刺激大鼠中性粒細(xì)胞產(chǎn)生活性氧

1、    硫苷脂和燒傷后血清刺激大鼠 中性粒細(xì)胞產(chǎn)生活性氧        摘要目的：研究L-選擇素配體硫苷脂和燒傷后血清對(duì)大鼠中性粒細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的影響。方法：分別用硫苷脂、燒傷后血清、燒傷后血清加硫苷脂刺激分離的大鼠中性粒細(xì)胞，用細(xì)胞色素C法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中超氧陰離子濃度，用熒光物質(zhì)東莨菪苷原測(cè)定細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)氧化氫濃度，用熒光探針Fura-2/AM測(cè)定胞內(nèi)游離鈣濃度。結(jié)果：硫苷脂、燒傷后血清刺激后，細(xì)胞產(chǎn)生的超氧陰離子、過(guò)氧化氫和胞內(nèi)鈣離子濃度度均明顯增加，燒傷后血清

2、刺激后再用硫苷脂刺激，三者的濃度不再增加。結(jié)論：硫苷脂、燒傷后血清可能通過(guò)鈣信號(hào)傳導(dǎo)而使中性粒細(xì)胞產(chǎn)生活性氧增加，引起細(xì)胞的某些功能改變。主題詞燒傷； 中性白細(xì)胞； 氧；鈣中分類號(hào)R644.02文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1000-4718(2000)08-0721-02MeSHBurns; Neutrophils; Oxygen; Calcium 嚴(yán)重?zé)齻蓪?dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合癥的發(fā)生，白細(xì)胞粘附在全身炎癥反應(yīng)綜合癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。粘附分子選擇素介導(dǎo)白細(xì)胞粘附，同時(shí)它還是一信號(hào)分子1。選擇素的生物學(xué)作用中是否有活性氧參與，燒傷后的情況又是怎樣，目前尚不清楚。本研究利用分離的大鼠中性粒細(xì)胞，觀

3、察L-選擇素配體硫苷脂和燒傷后血清對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中活性氧產(chǎn)生和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響，以了解L-選擇素在燒傷后中性粒細(xì)胞粘附中的作用。材料和方法一、中性粒細(xì)胞分離用持續(xù)灌注法收集SD大鼠血細(xì)胞，即用30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后，仰臥位固定，經(jīng)正中切口進(jìn)胸，剪去部分前胸壁，充分暴露心臟，將IL冷PBS/EDTA(AMERSCO公司)灌洗液經(jīng)左心室緩慢灌入，剪開(kāi)右心室壁，使血液和灌洗液流出。收集胸腔中灌洗液，550 g離心10 min，去上清液。隨后用淋巴細(xì)胞分離液(上海華精生物高科技有限公司)分離大鼠中性粒細(xì)胞，該法獲得的細(xì)胞活力在97%以上(臺(tái)盼藍(lán)液法)，中性粒細(xì)胞約占88%2。

4、分離的細(xì)胞保存在DMEM(Gibco公司)培養(yǎng)液中。二、大鼠燒傷后6 h血清制備SD大鼠用戊巴比妥鈉(30 mg/kg ip)麻醉，背部去毛，用恒溫水燙儀(第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院燒傷中心研制)100水燙12 s，制成30% 度燒傷模型。在燒傷后6 h取血分離血清，56水浴30 min滅活補(bǔ)體，冰凍儲(chǔ)存，備用。三、實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為5組：第1組，對(duì)照組，細(xì)胞不刺激；第2組，硫苷脂(400 g/100 L)刺激細(xì)胞；第3組，正常血清(100 L)刺激細(xì)胞；第4組，燒傷后6 h血清(100 L)刺激細(xì)胞；第5組，燒傷后6 h血清(100 L)刺激細(xì)胞后，硫苷脂(400 g/100 L)再刺激細(xì)胞。四、檢

5、測(cè)用細(xì)胞色素C(Sigma公司)法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中超氧陰離子濃度，細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)氧化氫濃度檢測(cè)用熒光物質(zhì)東莨菪苷原(Sigma公司)測(cè)定3。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度用熒光探針Fura-2/AM(Calbiochem公司)檢測(cè)。五、統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果用±s表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)。結(jié)果硫苷脂刺激后細(xì)胞產(chǎn)生超氧陰離子和過(guò)氧化氫濃度非常明顯高于對(duì)照組(P0.01)。正常血清對(duì)細(xì)胞無(wú)刺激作用。燒傷后6 h血清刺激后，細(xì)胞產(chǎn)生的超氧陰離子和過(guò)氧化氫濃度非常明顯高于對(duì)照組(P0.01)，但在此基礎(chǔ)上再用硫苷脂刺激，產(chǎn)生的量不再增加，和單用燒傷后血清刺激組相比無(wú)明顯差異(P0.05，表1)。細(xì)胞在硫苷脂刺激后胞內(nèi)鈣離子濃度

6、明顯高于對(duì)照組(P0.01)。正常血清刺激不能使胞內(nèi)鈣離子濃度增加，用燒傷后6 h血清刺激，胞內(nèi)鈣離子濃度明顯增加(P0.01)。但燒傷后血清刺激后的細(xì)胞再用硫苷脂刺激，鈣離子濃度不再明顯增加(P0.05，表1)。表1大鼠中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧和胞內(nèi)鈣離子濃度Tab 1 Alterations of the reactive oxygen and Ca2i in isolated rat neutrophils (n=5, ±s)GroupO?2(nmoles/1×106 cells)H2O2(nmoles/1×106 cells)Ca2+i(nmol/L)10.

7、1±0.10.2±0.158.1±5.620.9±0.1*1.5±0.2*155.6±50.2*30.2±0.10.3±0.167.2±8.841.2±0.3*1.4±0.2*98.5±17.3*51.2±0.8*1.5±0.3107.3±27.3* P0.01, vs group 1; P0.01, vs group 3 討論反應(yīng)性氧族和反應(yīng)性氮族通過(guò)其分布在細(xì)胞外的配體，在調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)中起重要作用，許多學(xué)者將其作為信號(hào)分子。它們可參與細(xì)胞因子

8、、生長(zhǎng)因子、激素的作用和分泌；離子轉(zhuǎn)動(dòng)；轉(zhuǎn)錄；神經(jīng)調(diào)節(jié)和凋亡4。這可能與調(diào)節(jié)NF-B、激活蛋白(AP)-1有關(guān)。信號(hào)分子H2O2即可通過(guò)ERK與JNK/SAPK兩條途徑來(lái)傳導(dǎo)信號(hào)5。L-選擇素在血中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、大多數(shù)T、B細(xì)胞及NK細(xì)胞的一亞群中有表達(dá)，它通過(guò)與分布在內(nèi)皮細(xì)胞表面的配體結(jié)合，介導(dǎo)白細(xì)胞在血管內(nèi)皮上的接觸和滾動(dòng)；通過(guò)與白細(xì)胞上配體結(jié)合，介導(dǎo)白細(xì)胞間粘附；并介導(dǎo)淋巴細(xì)胞歸巢。L-選擇素及配體PSG-1還能介導(dǎo)細(xì)胞的“內(nèi)翻外”信號(hào)傳導(dǎo)1。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，硫苷脂使大鼠中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的超氧陰離子、過(guò)氧化氫及胞內(nèi)鈣離子濃度明顯增加。這提示，L-選擇素交聯(lián)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)(包括鈣離子釋放

9、)，最終導(dǎo)致細(xì)胞活性氧產(chǎn)生增加。燒傷后血清中含有大量的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，如PGE2、LTB4、IL-2、TNF、C1q，它們對(duì)機(jī)體有刺激作用。燒傷后血清能激活細(xì)胞NADPH氧化酶，使超氧陰離子和過(guò)氧化氫產(chǎn)生增加，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度也增加。燒傷后血清也能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，使活性氧產(chǎn)生增加。但燒傷后血清刺激后的PMN再用硫苷脂刺激，超氧陰離子、過(guò)氧化氫產(chǎn)量及胞內(nèi)鈣離子濃度均不再明顯增加。這可能是燒傷后血清刺激后，PMN表面的L-選擇素有脫落。這種脫落現(xiàn)象在激活或趨化因子如LPS、TNF-、PMA刺激后均發(fā)生，其具體機(jī)理不清，可能會(huì)促進(jìn)隨后進(jìn)行的中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞緊密接觸時(shí)的粘附6。燒傷后體內(nèi)的中性

10、粒細(xì)胞有無(wú)L-選擇素脫落，燒傷后的中性粒細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)是否有L-選擇素參與，仍待進(jìn)一步研究?；痦?xiàng)目 上海市醫(yī)學(xué)領(lǐng)先專業(yè)基金資助倪?。ń夥跑?5醫(yī)院， 上海 200052）于寶軍（第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院燒傷科）楊紅蓮（第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院外科）陳玉林（第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院燒傷科）郇京寧（第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院燒傷科）劉訓(xùn)龍（解放軍85醫(yī)院， 上海 200052）參考文獻(xiàn)1倪俊，陳玉林. 選擇素與創(chuàng)傷膿毒癥J. 國(guó)外醫(yī)學(xué)創(chuàng)傷與外科基本問(wèn)題分冊(cè)， 1998， 19(3)： 133136.2丁自強(qiáng)，李少華，吳中立. 血小板激活抑制因子介導(dǎo)過(guò)氧化氫引起的白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附J. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)， 199

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