肝損傷動物模型研究進展

1、肝損傷動物模型研究進展    【關鍵詞】  肝疾?。?#160;毒物， 四氯化碳； 醋氨酚； 疾病模型，動物論文既是探討問題進行科學研究的一種手段，又是描述科研成果進行學術交流的一種工具.  肝損傷是各種肝臟疾病的病變結果，對肝損傷的防治目前仍是一個嚴峻的課題。通過建立實驗性肝損傷動物模型，研究肝病的發(fā)生機制，篩選保肝藥物，探索保肝作用原理，具有重要的現(xiàn)實意義?，F(xiàn)將近年來國內(nèi)外對實驗性肝損傷動物模型分類、作用原理、造模方法及其優(yōu)缺點等研究進展作綜述和探討。   &#

2、160;1  化學性肝損傷動物模型    1.1  四氯化碳（carbon tetrachloride, CCl4）  CCl4導致肝損傷的主要機制目前認為與其自身和自由基代謝產(chǎn)物有關()。CCl4代謝產(chǎn)生的自由基進入機體后，在肝臟經(jīng)細胞色素P450激活，生成三氯甲基自由基和三氯甲基過氧自由基，攻擊肝臟細胞膜上的磷脂分子，使得細胞膜、內(nèi)質網(wǎng)膜發(fā)生氯烷化和脂質過氧化，損傷細胞膜、細胞器；還能與膜脂質和蛋白質大分子進行共價結合，影響蛋白質代謝，并且破壞膜結構和功能的完整性，鈣離子

3、內(nèi)流增加，影響細胞正常生理功能，最終導致肝細胞胞質中的可溶性酶滲出，細胞死亡1。    CCl4所致肝損傷可分為急性和慢性。急性肝損傷：賴力英等應用4 mL/kg CCl4劑量灌胃可誘發(fā)SD大鼠急性肝功能衰竭，死亡率達85 %2。慢性肝損傷：Zhang等采用2 mL/kg CCl4腹膜內(nèi)注射SD大鼠，每周2次，持續(xù)9周可伴有肝細胞壞死和明顯炎癥的肝硬化3。CCl4導致肝損傷是經(jīng)典模型之一，能準確反應肝細胞功能、代謝及形態(tài)學變化，重復性好且經(jīng)濟。但CCl4同時還損傷動物的心、脾、肺、腎、腦等器官，另外，蒸汽

4、和液體可由呼吸道、皮膚吸收，對人體也有一定毒性，操作時應注意。A clear conscience is a sure card.      1.2  萘基異硫氰酸酯(Naphthylisot hiocyanate, ANIT)  ANIT是一種間接肝毒劑，其主要損害是通過膜脂質過氧化反應，致使肝細胞變性、壞死、胞內(nèi)血清谷丙轉氨酶(ALT）大量溢入血流，同時還導致膽管上皮細胞腫脹壞死，引起毛細膽管增生及小葉間膽管周圍產(chǎn)生炎癥，從而造成膽管阻塞，形成明顯的膽汁淤積，并伴隨以點狀壞死為主的

5、肝實質細胞損害，產(chǎn)生梗阻性黃疸，出現(xiàn)高膽紅素血癥和膽汁分泌減少(醫(yī)藥學/臨床醫(yī)學論文 )。    黃正明等采用ANIT 100 mg/kg灌胃48 h后，ALT、谷草轉氨酶(AST)升高明顯，尤其是總膽紅素升高更明顯，成功誘導Wistar大鼠的急性黃疸型肝炎4。ANIT誘發(fā)大鼠和小鼠的肝損傷模型，可獲得多項異常指標，模型復制簡便易行，重現(xiàn)性好，ANIT對動物機體氧化自由基反應系統(tǒng)的影響對抗氧化型保肝藥物的研究具有重要意義，是退黃藥物研究的理想模型，因此可用于篩選和研究新型保肝藥及利膽藥。   &

6、#160;1.3  D氨基半乳糖(Dgalactosamine, DGaln )  DGaln是一種肝細胞磷酸尿嘧啶核苷干擾劑，通過競爭生成二磷酸尿苷半乳糖使磷酸尿苷耗竭,導致肝細胞的RNA和漿膜蛋白合成障礙，限制細胞器的再生及酶的生成和補充，使細胞器受損，引起肝細胞變性、壞死；另外DGaln還可以與肝實質細胞膜特異性結合，影響其完整性，引起肝細胞內(nèi)Ca2+增多，Mg2+減少，抑制線粒體功能，激活磷脂酶，加速氧化自由基的產(chǎn)生，因此Mg2+/Ca2+的比例失調也是DGaln導致肝細胞不可逆損害的因素之一；加上使肝臟谷胱甘肽減少，并激活庫

7、普弗釋放TNF引起細胞凋亡5。It is right to put everything in its proper use.      李梅等篩選DGaln造模的最佳劑量，比較DGaln造成的大、小鼠急性肝損傷模型的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)DGaln 500 mg/kg誘導的大鼠急性肝損傷模型肝組織形態(tài)變化顯著且死亡率低，更適用于保肝新藥的篩選與評價6。DGaln形成的急性肝功能衰竭模型是研究病毒性肝炎的發(fā)病機制及有效治療藥物理想的實驗動物模型，其優(yōu)點是該模型的病變僅限于肝臟，不涉及其它器官，癥狀、生物化學、組織學表現(xiàn)接近人，給藥方便

8、，重復性好，終點明確，具有可逆性，不造成環(huán)境污染及人體傷害，不需特殊的實驗操作保護措施，對肝衰竭、肝性腦病、人工肝支持系統(tǒng)的評價研究有重要價值，但價格昂貴導致應用受限。    1.4  二甲基亞硝胺(Dimethylnitrosamine,DMN)  DMN是常見的致肝癌劑，它通過微粒體代謝，其中間產(chǎn)物與細胞核酸、蛋白質等結合可造成細胞內(nèi)大分子損傷，誘發(fā)大鼠肝竇壁肝星狀細胞的活化，導致過多增多和沉積，引起肝纖維化形成；同時促進竇內(nèi)皮細胞形成肝竇毛細血管化，加重肝損傷，促進肝纖維化的發(fā)展7。A useful trad

9、e is a mine of gold.      DMN肝損傷動物模型可分急性肝損傷動物模型和肝纖維化動物模型。急性肝損傷模型：Horn等采用DMN 5 mg/kg劑量誘導亞急性肝毒性8。肝纖維化模型：Li等予DMN(10 L/kg)腹腔注射Wistar大鼠，每周2次，持續(xù)4周，成功誘導了肝纖維化模型9。DMN所致的肝纖維化大鼠模型病變類似于人類肝纖維化病變，并且肝纖維化形成率高、死亡率低、造模周期短、肝纖維化形成后病變相對穩(wěn)定等特點，主要用于肝硬化形成的形態(tài)學改變、機理、生化指標的異常改變和門脈高壓機制的研究，

10、還用于肝硬化向肝癌轉化機制的研究10。缺點為DMN毒性大，易揮發(fā)，排泄物在24 h內(nèi)含毒物，易污染環(huán)境和影響周圍人群。    1.5  硫代乙酰胺( thioacetamide，TAA)  TAA具有直接肝毒性作用，攝入后可經(jīng)肝細胞內(nèi)細胞色素P450混合功能氧化酶代謝為TAA硫氧化物，干擾細胞核內(nèi)RNA轉移，影響蛋白質合成和酶活力，增加肝細胞核內(nèi)DNA合成及有絲分裂，促進肝硬化發(fā)展，同時激活肝細胞磷脂酶A2，破壞肝細胞膜，形成腸源性內(nèi)毒素血癥，導致大面積肝細胞破壞，并可使ALT、AST明顯增高。

11、TAA小劑量誘發(fā)肝細胞凋亡，大劑量導致脂質氧化和小葉中央壞死、損傷程度與TNF和內(nèi)毒素水平正相關，可被羥自由基清除劑緩解11。In a great river great fish are found; but take heed lest you be drowned.      TAA常用于制作急性肝損傷、肝纖維化和肝性腦病模型：王春妍等采用皮下注射TAA 600 mg/kg制作大鼠急性肝損傷動物模型12。Wang等采用4%的TAA溶液以0.2 g·kg-1·d-1劑量腹腔注射，每日3次，持

12、續(xù)10周制作成大鼠肝纖維化模型，可用于治療肝硬化藥物的研發(fā)13。TAA致肝損傷模型過程相對簡單易行致肝細胞損傷反應好，且具有良好的可行性和重復性、肝纖維化組織接近人類，制備成功率高等優(yōu)點，常用于制作肝纖維化和急性肝功能衰竭模型。    2  藥物性肝損傷模型    2.1  醋氨酚(acetaminophen,PAPA)  PAPA亦名對乙酰氨基酚、撲熱息痛，經(jīng)體內(nèi)P450代謝可生成活性中間代謝物N乙酰對苯醌亞胺(NAPQI)，NAPQI具強大的氧化作用，

13、使生物膜系統(tǒng)發(fā)生脂質過氧化，干擾細胞內(nèi)的能量代謝，導致肝細胞變性壞死，同時誘導肝組織細胞中高表達Fas/FasL和穿孔素/顆粒酶，活化細胞死亡程序，導致肝細胞壞死14。PAPA引起肝障礙還與肝臟谷胱甘肽含量減少有關。    PAPA加熱下溶于生理鹽水，給小鼠300500 mg/kg一次性腹腔注射，也可配成質量濃度為2.5%的混懸液經(jīng)口灌胃，制成急性肝損傷模型15。PAPA常用于制作急性肝功能衰竭模型，其誘導的急性肝功能衰竭模型與人急性肝功能衰竭的臨床特點、組織學表現(xiàn)相似，是較理想的急性肝功能衰竭模型。PAPA肝損傷動物模型也可用于因各種原因導致

14、谷胱甘肽含量減少而引起肝細胞損傷的治療藥物篩選。趙世鋒等對雜種家犬采用多次皮下注射醋氨酚的方法建立急性肝損傷模型有以下特點：具有較好的重復性、可復制性和穩(wěn)定性；有明顯的肝臟損傷特異性對其他重要臟器無損害；對實驗人員危害較小16。    2.2  其他  四環(huán)素（Tetracycline）導致肝損傷的機制仍未明確，祿保平等應用四環(huán)素10倍劑量（2 250 mg/kg），灌胃18 h成功制得急性肝損傷模型17?？菇Y核藥物異煙肼具有肝毒性，祿保平等認為異煙肼的肝損傷機制與其代謝產(chǎn)物乙酰異煙肼

15、和肼二者引起的自由基脂質過氧化反應有密切關系，應用2倍劑量（180 mg/kg）異煙肼灌胃后18 h，成功誘導急性肝損傷模型18，由于家兔對異煙肼敏感多選用家兔動物模型，異煙肼引起肝損傷動物模型多用于藥物性肝炎的研究。    3  免疫性肝損傷動物模型    3.1  卡介苗（bacillus calmetteguerin vaccine,BCG）加脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）  BCG的損

16、傷機制可能是小鼠注射BCG后導致多核中性粒細胞或巨噬細胞(肝內(nèi)庫普弗細胞)聚集于肝臟并被致敏，繼而用低劑量LPS攻擊，促進其釋放大量對肝細胞有毒性作用的細胞因子，如白三烯、TNF、IL1和NO等，NO作為自由基，可以與O2反應生成超氧化亞硝酸陰離子(ONOO)以及其他自由基引起脂質過氧化造成肝細胞損害19。Call no man happy until he dies.      SheaBudgell等以BCG漿液每只0.2 mL（含5×106菌）注射小鼠尾靜脈，致敏后10 d，再尾靜脈注射LPS每只7.5

17、60;g，成功誘導小鼠肝損傷模型20。邱英鋒等確定BCG菌數(shù)5.0×107+ LPS 劑量30 g/kg聯(lián)合最佳，能夠充分造成大鼠急性肝損傷21。BCG和LPS肝損傷動物模型簡便易行，且造成的大鼠急性肝損傷與病毒性肝炎發(fā)病機制有較大相似，可用于對病毒性爆發(fā)性肝炎的研究。    3.2  異種血清  異種血清誘導的免疫性肝纖維化其發(fā)生機制尚未明確。異種血清腹腔注射法，可選用豬、牛、羊等血清，其中以豬血清最為常用。豬血清每次0.5 mL腹腔注射SD或Wistar大鼠，每

18、周2次，12周后肝內(nèi)廣泛纖維組織增生，假小葉形成，有典型肝硬化表現(xiàn)22。異種血清誘導的肝纖維化模型簡便、經(jīng)濟、成功率高、病變單純以及與人類病程相似，但有自愈傾向，造模周期較長，且牛和羊血清引起的動物死亡率較高。Politeness costs nothing and gains everything.      3.3  刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）  ConA是植物凝集素，作為一種T細胞絲裂原，有促進有絲分裂的作用，可以激活T淋巴細胞，分泌大量細胞因子，肝實質可見大量淋

19、巴細胞浸潤，主要以CD4+T淋巴細胞為主，引起特異性肝損傷23。A clear conscience is a sure card.      Dawei等研究發(fā)現(xiàn)小鼠靜脈注射ConA(20 mg/kg)后68 h可制成急性免疫性肝損傷模型24。李鴻立等采用小鼠尾靜脈注射1 mol/L ConA (12.5 mg/kg)，每周1次，連續(xù)6周，成功制出肝纖維化模型，常規(guī)病理切片HE染色示肝小葉破壞，結構紊亂，肝壞死明顯25。ConA肝損傷模型特點：制作簡便快速，無需預先致敏；有劑量依賴性

20、，肝損害隨藥物劑量加大而加重；具有肝臟損傷特異性未發(fā)現(xiàn)肺、脾、心等肝外器官損傷26。ConA肝損傷動物模型對于治療自身免疫性肝炎的藥物篩選具有重要意義。    免疫系統(tǒng)在肝炎的發(fā)病過程中有重要作用，尤其是慢性肝炎、肝硬化、乙醇中毒性及藥物性肝損傷，雖然免疫性肝損傷模型類似于人類肝炎后肝纖維化的形成機制、病理生理過程，但仍有一定差距，主要是由于缺乏病毒復制和肝實質持續(xù)損傷的過程，因此此類模型僅有利于從免疫學角度探討發(fā)病機制和評價藥物療效。    4  酒  精 

21、60;  酒精對肝損害的機制尚未完全闡明，可能是炎癥和免疫病理共同作用的結果，蛋白質和各種營養(yǎng)物質缺乏會加重酒精的肝損害。高濃度的酒精引起急性肝損傷產(chǎn)生大量毒性代謝產(chǎn)物和乙醛，并釋放腎上腺素引起肝臟血管收縮肝竇內(nèi)壓升高和肝細胞缺氧，導致空泡變性肝細胞溶解壞死27。    酒精所致肝損傷可分為性肝損傷和慢性肝損傷。急性肝損傷：小鼠或大鼠以5060 度白酒或體積分數(shù)為50%60%的乙醇一次性經(jīng)口灌胃4.06.0 g/kg，24 h內(nèi)可成功造成大鼠急性酒精性肝損傷模型28。慢性酒精性肝損傷：趙敏等予50%的乙醇

22、灌胃30 d 即可出現(xiàn)酒精性脂肪肝模型，60 d可見肝臟纖維化改變。該造模方法具有肝纖維化出現(xiàn)率高、造模方便、價格低廉特點，而且模型穩(wěn)定造模方法簡單、快速、易于操作，可以進行重復實驗，增加樣本量29。    5  其  他    缺血再灌注導致的肝組織細胞損傷主要與氧自由基的生成和鈣超載有關，主要用于制作急性肝功能衰竭模型以研究肝移植、細胞移植和人工肝治療效果。另外，營養(yǎng)和代謝性肝損傷模型、寄生蟲性肝纖維化模型、感染性肝損傷模型(病毒性肝炎、沙門

23、菌、大腸桿菌等誘發(fā))亦有不少報道30?！緟⒖嘉墨I】  1 Lesage G D, Benedetti A, Glaser S, et al. Acute carbon tetrachloride feeding selectively damages large, but not small，cholangiocytes from normal rat

24、60;liver J. Hepatology,1999，29(2)：307319.2 賴力英，楊 旭，許向青，等. 四氯化碳誘導大鼠急性肝功能衰竭動物模型的建立J.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2005，15(11)：16551657.3 Zhang L J，Yu J P，Li D，et al . Effects of cytokines on carbon tetrachlorideinduced hepa

25、tic fibrogenesis in rats J. World J Gastroenterolog，2004，10(1)：7781.4 黃正明，楊新波，曹文斌，等. 化學性以及免疫性肝損傷模型的方法學研究J. 解放軍藥學學報，2005，21(1)：4246.5 李宏濤，陳國民. D氨基半乳糖研究的回顧和展望J. 肝臟，2004，9(3)：209210.6 李 梅,谷淑玲,馬騰飛. D氨基半乳糖致小鼠、大鼠肝損傷模型的實驗性研究J.&

26、#160;徐州醫(yī)學院學報，2007，27(2)：8688.7 李春輝. 二甲基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝纖維化發(fā)生機理的研究D. 延邊大學醫(yī)學院，2003.8 Horn T L，Bhattacharjee A，Schook L B. Altered Hepatic mRNA expression of apoptotic genes during Dimethylnitrosamine Exposure J

27、. Toxicological Sciences，2000，57(2)：240.9 Li C H，Piao D M，Xu W X，et al. Morphological and serum hyaluronic acid，laminin and type IV collagen in dimethylnitrosamineinduced hepatic fibros

28、is of rats J. World J Gastroenterol，2005，11（48）：76207624.10 王憲波，劉 平，陸 雄，等. 二甲基亞硝胺大鼠肝纖維化形成中門脈壓力的動態(tài)變化J. 世界華人消化雜志，2002，10(4)：401405.11 Bruck R,Shirin H,Aeed H,et al. Prevention of hepatic cirrhosis 

29、in rats by hydroxyl radical scavengersJ. J Hepatol， 2001，35(3)：457464.12 王春妍，楊世忠，江海艷. 急性肝損傷大鼠腸源性內(nèi)毒素血癥形成機理及其作用的實驗研究J. 臨床肝膽病雜志，2007，23(2)：109111.13 Wang T，Shankar K，Ronis M，et al. Potentiation of thioacetami

30、de liver injury in diabetic rat is due to induced CYP2E1 J. J Pharm Exp Ther，2000，294(2)：473.14 朱方琴，顧 偉，董 昕. 醋氨酚中毒致大鼠肝細胞的凋亡J. 中國急診醫(yī)學雜志，2003，12(6)：397399.15 劉彥雙,朱淑霞,王永利. 急性肝損傷模型的研究進展J. 河

31、北醫(yī)藥，2007，29(6)：613614.16 趙世峰，薛毅瓏，李新建. 醋氨酚誘發(fā)急性肝損害模型的建立J. 中華實驗外科雜志，2000，17(2)：192.17 祿保平，楊曉娜，許家燕. 應用四環(huán)素灌胃建立急性肝損傷模型J. 南京醫(yī)科大學學報，2006，26(8)：671675.18 祿保平，楊曉娜，許家艷. 異煙肼灌胃建立小鼠急性肝損傷模型的研究J. 中國醫(yī)藥生物技術，2007，2(4)：286290.19 陳象青，王欽茂，方華武，等. 白芍總苷和當歸提取物對小鼠免疫性肝損傷的保

32、護作用J.承德醫(yī)學院學報，2004，21(1)：810.20 SheaBudgell M，Dojka M，Nimmo M. Marginal zinc deficiency increased the susceptibility to acute lipopolysaccharideinduced liver injury in rats J. Exp Biol Med (M

33、aywood)， 2006，231：553558.21 邱英鋒，繆曉輝，蔡 雄. 卡介苗加脂多糖建立的大鼠急性免疫性肝損傷模型的研究J.西北國防醫(yī)學雜志，2004，25(5)：345347.22 程明亮，楊長青. 肝纖維化的基礎研究及臨床M. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：366367.23 Kaneko Y，Harada M，Kawano T，et al. Augmentation of V14 NKT cellmediated cytotoxicity by interleukin 4 in an autocrine mechanism resulting in t