口腔扁平苔蘚中Caspase

1、口腔扁平苔蘚中Caspase作者：時(shí)間：2007-11-22 11:34:00 作者：姚希，沈麗佳，殷操，謝思明 【關(guān)鍵詞】 扁平苔癬 Expressions of Caspase3, TNF and TNFR and their relationship with cell apoptosis in oral lichen planus【Abstract】 AIM: To examine the expressions and distribution of Caspase3, TNF and TNFR and their relationship to apoptosis in oral

2、lichen planus (OLP). METHODS: Immunohistochemical staining with SP method and TUNEL technique were used to detect the expressions of Caspase3, TNF and TNFR in 33 cases of OLP and 7 cases of normal oral mucosa specimens (the controls). RESULTS: Compared with the controls, OLP was increased in apoptos

3、is index (AI) of epithelial cells and decreased in AI of lymphocytes (both P0.05). The expression of Caspase3 in all OLP cases was significantly higher than that in the normal group both in the epithelial layer and in the lamina propria (P0.025). Compared with that in the normal group, TNF expressio

4、n in all OLP cases was decreased in the epithelial layer and increased in the lamina propria (both P0.025), while TNFR expression was increased in the epithelial layer and decreased in the lamina propria in all OLP cases (both P0.025). TNF expression was significantly increased in the lamina propria

5、 in the erosion group compared with the nonerosion group (P0.05). A positive correlation was observed between Caspase3 expression and AI in the epithelial cells (r=0.631, P0.05). Expressions of TNF and TNFRI were significantly correlated to AI both in the epithelial layer and in the lamina propria.

6、CONCLUSION: The accelerated apoptosis of keratinocytes and the inhibition of lymphocyte apoptosis may coexist in OLP, which may contribute to the formation and progression of OLP.【Keywords】 lichen planus, oral; Caspase3; tumor necrosis factor; TNFR; apoptosis【摘要】 目的： 探討口腔扁平苔蘚（OLP）中Caspase3, TNF和TNFR

7、的表達(dá)意義及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系. 方法： 采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL法）、SP免疫組化方法檢測33例OLP及7例正?？谇火つぃ▽φ战M）中Caspase3, TNF和TNFR的表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況. 結(jié)果： OLP中上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）明顯高于正常對照組(P0.05)，而固有層的AI明顯低于正常對照組(P0.05). OLP的上皮層和固有層Caspase3陽性表達(dá)明顯高于正常對照組(P0.025). OLP中上皮層TNFRI及固有層TNF陽性表達(dá)明顯高于正常對照組(P0.025)，而上皮層TNF及固有層TNFRI陽性表達(dá)則明顯低于正常對照組(P0.025)

8、，糜爛型組固有層中TNF陽性表達(dá)明顯高于非糜爛型組(P0.05). OLP上皮層Caspase3陽性表達(dá)與其自身AI呈正相關(guān)（r=0.631, P0.05)；TNF/TNFRI表達(dá)與OLP上皮及固有層細(xì)胞的AI密切相關(guān). 結(jié)論： OLP中同時(shí)存在角質(zhì)細(xì)胞凋亡亢進(jìn)及固有層淋巴細(xì)胞凋亡的減少，這種凋亡的異?？赡芘cOLP的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān).【關(guān)鍵詞】 扁平苔癬，口腔；Caspase3；腫瘤壞死因子；TNFR；細(xì)胞凋亡0引言口腔扁平苔蘚（oral lichen planus, OLP）是臨床上常見的口腔黏膜非感染性疾病，在臨床上主要表現(xiàn)為口腔黏膜的白色斑塊或條紋，其病理特征為上皮下固有層淋巴細(xì)胞帶狀浸

9、潤及基底層細(xì)胞液化變性. OLP的發(fā)病機(jī)制尚無定論. 近期研究表明，OLP為細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，且與細(xì)胞凋亡異常相關(guān)1. 我們通過原位檢測OLP中Caspase3, TNF和TNFR蛋白的表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況，探討Caspase3, TNF和TNFR在OLP發(fā)生發(fā)展中的作用及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系.1對象和方法1.1對象收集廣州暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院及廣東省口腔醫(yī)院2001/2004年間口腔門診OLP患者活檢標(biāo)本33（男7，女26）例，均是2 mo內(nèi)未經(jīng)激光、激素、免疫調(diào)節(jié)治療的原發(fā)病例. 患者年齡2271（平均45）歲. 16例取自舌部黏膜，14例取自頰黏膜，3例取自下唇黏膜. 非糜爛型24例

10、，糜爛型9例. 另取7例因口腔外傷或整形手術(shù)切除的正常黏膜作為對照組. 根據(jù)臨床表現(xiàn)結(jié)合HE染色，按WHO的OLP病理診斷標(biāo)準(zhǔn)，由兩位臨床病理醫(yī)師分別獨(dú)立診斷，以兩人一致的結(jié)果為最終判斷. 根據(jù)臨床表現(xiàn)結(jié)合病理診斷，將33例OLP分為2組： 糜爛型9例，非糜爛型24例. 試劑： 小鼠抗人Caspase3 mAb（濃縮型）購自NeoMarkers公司，工作濃度是150. 小鼠抗人TNF和TNFRI mAb（濃縮型）購自Santa Cruz公司，工作濃度分別是1400及1100. TUNEL試劑盒為基因公司產(chǎn)品. SP試劑盒、DAB顯色劑均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司.1.2方法患者活檢標(biāo)本4 m

11、厚連續(xù)石蠟切片，65烘烤，脫蠟、水化后微波修復(fù)抗原，免疫組化SP法檢測目標(biāo)抗原, 從33例OLP中隨機(jī)選取15例（將33例隨機(jī)編號，取偶數(shù)，末例舍去）， TUNEL法原位檢測15例OLP和全部正常黏膜的凋亡細(xì)胞. SP法操作步驟嚴(yán)格按照SP試劑盒說明書進(jìn)行，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，PBS代替一抗作為替代對照，用已知陽性片做陽性對照. TUNEL法操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，DAB顯色，PBS替代TUNEL反應(yīng)液作替代對照.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 全部數(shù)據(jù)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，Caspase3, TNF和TNFR的表達(dá)結(jié)果采用非參數(shù)等級資料秩和檢驗(yàn)MannWhitney

12、 Test，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取雙側(cè)=0.025（因涉及2次重復(fù)比較問題，故調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)，=/2, 取0.05）. TUNEL法實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn). AI與Caspase3, TNF和TNFR表達(dá)的相關(guān)性及TNF和TNFR之間表達(dá)的相關(guān)性，采用Spearman等級相關(guān)分析.2結(jié)果2.1細(xì)胞凋亡情況在口腔黏膜上皮層及固有層均可見凋亡細(xì)胞，核呈棕褐色，輪廓清楚、致密. 經(jīng)兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)（經(jīng)方差齊性檢驗(yàn),各組間總體方差齊同），OLP中上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于正常對照組（P0.05），凋亡細(xì)胞多位于基底層或基底上層，而正常對照組中的凋亡細(xì)胞多位于表層及棘層. 口腔扁平苔蘚中固有層的細(xì)胞凋

13、亡指數(shù)明顯低于正常對照組（P0.05），凋亡細(xì)胞多位于固有層深層（圖1A，表1）.表1口腔扁平苔蘚與正常對照組中細(xì)胞凋亡指數(shù)的比較（略）aP0.05 vs正常黏膜組.2.2Caspase3表達(dá)情況OLP中Caspase3的陽性率上皮層和固有層均為100%，上皮層主要表達(dá)于基底細(xì)胞和棘細(xì)胞的胞質(zhì)，亦可見胞核著色，基底細(xì)胞層及近基底細(xì)胞層陽性細(xì)胞為中度陽性表達(dá)，棘細(xì)胞層陽性細(xì)胞為弱陽性表達(dá) (圖1B); 固有層近基底膜的淋巴細(xì)胞和部分炎性細(xì)胞胞質(zhì)和胞核均呈強(qiáng)陽性或中度表達(dá). 正常組上皮層陽性率為100%，均為弱表達(dá)；固有層陽性率為28.6%(2/7)，為個(gè)別細(xì)胞弱陽性表達(dá). 和正常組相比，OLP患

14、者上皮層角化細(xì)胞和固有層淋巴細(xì)胞表達(dá)Caspase3明顯增強(qiáng)（P0.025，表2）.表2口腔扁平苔蘚與正常對照組中Caspase3的表達(dá)水平（略）aP0.025 vs正常黏膜組. 上皮層，固有層分別指上皮層角化細(xì)胞和固有層淋巴細(xì)胞.表3口腔扁平苔蘚與正常對照組中的TNF和TNFR的表達(dá)水平（略）aP0.025 vs正常黏膜組, bP0.05 vs非糜爛型組.2.4OLP中Caspase3, TNF和TNFR的表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系OLP上皮細(xì)胞Caspase3陽性表達(dá)強(qiáng)弱與上皮細(xì)胞的AI呈正相關(guān)（r=0.631, P0.05）. TNF/TNFRI與OLP上皮層及固有層細(xì)胞的AI有相關(guān)性，Spe

15、armanA： 口腔扁平苔蘚中固有層淋巴細(xì)胞中可見胞核被染成棕黃色的凋亡細(xì)胞 TUNEL 400；B： 口腔扁平苔蘚上皮層基底細(xì)胞Caspase3表達(dá)陽性 SP 400； C： 口腔扁平苔蘚上皮細(xì)胞胞質(zhì)TNF陽性表達(dá) SP400；D：口腔扁平苔蘚固有層淋巴細(xì)胞胞質(zhì)TNFRI 陽性表達(dá) SP 400.圖1口腔扁平苔蘚中TUNEL法陽性染色及Caspase3, TNF和TNFRI蛋白的陽性表達(dá)（略）等級相關(guān)分析顯示OLP固有層淋巴細(xì)胞TNF 陽性表達(dá)與上皮細(xì)胞的AI呈正相關(guān)（r=0.971, P0.05），與其自身的凋亡則呈負(fù)相關(guān)（r=-0.533, P0.05）. OLP上皮細(xì)胞TNFRI陽性表

16、達(dá)與上皮細(xì)胞的AI呈正相關(guān)（r=0.583, P0.05）；固有層淋巴細(xì)胞TNFRI陽性表達(dá)與其自身的AI呈正相關(guān)（r=0.699, P0.05）.3討論OLP為細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，病變的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞凋亡異常相關(guān)1. 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OLP上皮細(xì)胞的凋亡指數(shù)比正常對照組高，與Hirota等2報(bào)道的結(jié)果一致. 凋亡的上皮細(xì)胞多分布于萎縮型的OLP，這可能是因?yàn)榇罅可掀ぜ?xì)胞的凋亡導(dǎo)致了上皮層的萎縮、變薄，提示OLP上皮萎縮的改變可能與凋亡相關(guān)；同時(shí)觀察到在凋亡的上皮細(xì)胞較密集的OLP病例，多出現(xiàn)較明顯的基底細(xì)胞液化變性，故推測OLP基底層上皮細(xì)胞的液化變性與凋亡有關(guān). 而觀察到OLP固有層

17、淋巴細(xì)胞的凋亡指數(shù)比正常對照組有所降低則提示OLP固有層中淋巴細(xì)胞的凋亡受到抑制，細(xì)胞不能經(jīng)歷正常的凋亡過程而聚集在OLP的固有層中.Caspase家族是細(xì)胞發(fā)生凋亡的關(guān)鍵酶類，Caspase3是最重要的效應(yīng)型Caspase. 本研究結(jié)果表明，OLP患者口腔黏膜上皮表達(dá)Caspase3明顯增強(qiáng)（P0.05）， 提示OLP中Caspase家族的級聯(lián)反應(yīng)是在OLP上皮層的生發(fā)層內(nèi)被激活的，胞核陽性表達(dá)是由于在細(xì)胞成熟、衰老、死亡時(shí)，Caspase3從胞質(zhì)易位到胞核. Nakagawara等3在退化凋亡神經(jīng)母細(xì)胞瘤中報(bào)道了相似情況，由此推測胞核中的Caspase3可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)，但具體機(jī)制不清.

18、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析還提示，Caspase3在OLP上皮層細(xì)胞凋亡中起重要作用；而固有層淋巴細(xì)胞的生命活動(dòng)更為復(fù)雜，TNFTNFRI通路可能不僅僅介導(dǎo)細(xì)胞凋亡.腫瘤壞死因子（TNF）是由于其能引起腫瘤組織出血性壞死而得名，TNF和TNFRI與相關(guān)分子結(jié)合，激活Caspase3而最終導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡4. Erdem等5檢測到OLP患者血清中的TNF水平明顯比正常對照組高，SimarkMattsson等6發(fā)現(xiàn)OLP的T細(xì)胞有TNF mRNA的表達(dá). 本研究結(jié)果提示，OLP上皮細(xì)胞的凋亡異?？赡苁峭ㄟ^TNFTNFRI 介導(dǎo)的凋亡通路實(shí)現(xiàn)的，OLP固有層中的淋巴細(xì)胞表達(dá)TNF，通過結(jié)合上皮細(xì)胞表面的TNFRI

19、 誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡；OLP固有層淋巴細(xì)胞的凋亡可能也是由TNFTNFRI介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的，但是由于TNFRI表達(dá)的減少，導(dǎo)致TNF沒有足夠的受體結(jié)合而不能正常發(fā)揮作用，抑制了細(xì)胞凋亡，這也說明靶細(xì)胞表面TNFRI的質(zhì)與量直接影響TNF的敏感性. 沈麗佳等7-8的研究結(jié)果表明，OLP中的上皮細(xì)胞和固有層淋巴細(xì)胞都是TNF潛在來源，當(dāng)OLP中上皮細(xì)胞表達(dá)TNF及固有層淋巴細(xì)胞表達(dá)TNFRI減少時(shí)，TNFTNFRI介導(dǎo)淋巴細(xì)胞的凋亡途徑受阻，淋巴細(xì)胞得以“逃逸”正常的凋亡而聚集于OLP的固有層中. 本實(shí)驗(yàn)中，OLP固有層淋巴細(xì)胞TNF的表達(dá)還與其自身的AI呈負(fù)相關(guān)，因?yàn)門NF與受體結(jié)合后，介導(dǎo)的不止是凋亡

20、通路，還有可能激活NFB通路，從而產(chǎn)生有利于細(xì)胞生存的信號，導(dǎo)致細(xì)胞增殖. 這也說明了TNFTNFRI細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的復(fù)雜性，其選擇死亡或生存信號的機(jī)制有待進(jìn)一步探討.本研究中糜爛型OLP固有層淋巴細(xì)胞TNF的表達(dá)明顯高于非糜爛組，說明TNF在OLP中除了誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的凋亡外，還可能通過抑制細(xì)胞的生長或通過細(xì)胞毒作用，損傷上皮細(xì)胞，導(dǎo)致臨床上出現(xiàn)上皮萎縮、糜爛等表現(xiàn). TNF表達(dá)的高低對于OLP臨床診斷及治療的指導(dǎo)意義還有待進(jìn)一步探討.【參考文獻(xiàn)】1 Neppelberg E, Johannessen AC, Jonsson R. Apoptosis in oral lichen planus J. Eu