基因工程：第七章(共5頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上第七章 克隆基因的表達7.1 基因表達的含義生物的遺傳信息是以基因的形式儲存在DNA分子上的，將DNA分子所承載的遺傳信息轉(zhuǎn)變?yōu)橛商囟ò被犴樞驑?gòu)成的多肽或蛋白質(zhì)分子的過程，即為基因的表達（gene expression）?；虮磉_的過程為：利用各種先進的基因?qū)爰夹g(shù)及細胞培養(yǎng)方法已實現(xiàn)了外源基因在動植物及酵母等真核宿主細胞中的表達。利用真核細胞作宿主表達系統(tǒng)的優(yōu)點是：能識別和除去外源基因中的內(nèi)含子，加工形成成熟的mRNA，即帶內(nèi)含子的天然基因是可以利用的；真核細胞將表達的蛋白糖基化，而大腸桿菌表達的蛋白是無糖基化的，糖基化對某些表達蛋白的免疫原性影響很大。真核細胞作

2、宿主表達系統(tǒng)尚存在以下幾個問題：轉(zhuǎn)化真核細胞的效率低；表達效率不夠高；細胞培養(yǎng)（動植物）工藝較復雜，成本高；選擇標記及選擇系統(tǒng)較少?？傮w而言，真核細胞作為表達宿主尚不成熟，有待于進一步發(fā)展、完善。目前普遍采用原核生物作為表達宿主，原核生物（大腸桿菌）繁殖速度快，培養(yǎng)簡單，因此一些用傳統(tǒng)和常規(guī)方法不能或難以大量生產(chǎn)的有生理活性的蛋白，如果采用“工程菌”來生產(chǎn)就方便得多。7.2 外源基因在大腸桿菌中表達的基本條件基因的編碼區(qū)域內(nèi)必須無插入序列（無內(nèi)含子），因為原核細胞中缺乏拼接加工系統(tǒng)；基因必須置于大腸桿菌啟動子的控制之下，并能有效地為大腸桿菌RNA聚合酶所識別和轉(zhuǎn)錄；所生成的mRNA必須穩(wěn)定，且

3、轉(zhuǎn)譯效率高；表達產(chǎn)物不會被宿主細胞的蛋白酶迅速降解。7.3 影響基因表達的主要因素7.3.1 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄指遺傳信息從DNA分子轉(zhuǎn)移到RNA分子的過程，是以DNA分子中的一條鏈（有意義鏈、轉(zhuǎn)錄鏈）為模板，在轉(zhuǎn)錄酶的催化下，進行的一種聚合反應。轉(zhuǎn)錄酶即依賴于DNA的RNA聚合酶。大腸桿菌的RNA聚合酶由五個亞基_組成，分子量約46萬。完整的RNA聚合酶，即_稱為全酶（holoenzyme）；沒有_亞基的RNA聚合酶稱為核心酶（coreenzyme）。_亞基（_因子）容易同核心酶解離，其功能是使核心酶能穩(wěn)定地結(jié)合到DNA的啟動子上，故又稱為起始因子。真核生物有三種不同的RNA，因而其RNA聚合酶也有三

4、種，分別參與不同類型的RNA分子的合成。由RNA聚合酶催化的轉(zhuǎn)錄過程可分為起始、延長和終止三個步驟。7.3.1.1 啟動子標志基因轉(zhuǎn)錄起始的位點稱啟動子。在大腸桿菌中，啟動子被RNA聚合酶的因子所識別。啟動子是一段DNA序列，常位于基因或操縱子編碼順序的上游，RNA聚合酶結(jié)合在上面。1. 原核細胞的啟動子原核細胞的啟動子在轉(zhuǎn)錄起始點的上游有兩個高度保守的區(qū)域：位于轉(zhuǎn)錄起始點上游約10個bp的-10區(qū)域，TATAAT序列（pribnow box），也稱-10序列。-10序列的實際位置在不同啟動子中略有變動，其不同堿基的出現(xiàn)頻率為：T89A89T50A65A65T100 。-10序列有助于DNA局

5、部雙鏈解開，因為-10序列含有較多的A-T對，所以雙鏈分開所需的能量較低。中心約在-35位置的TTGACA序列，也稱為-35序列或識別區(qū)。各堿基出現(xiàn)的頻率為：T83T83G81A61C69A52 。-35序列提供RNA聚合酶識別的信號。這兩個區(qū)域?qū)τ跊Q定啟動子的強度非常重要，事實上很小的差異對啟動子指導轉(zhuǎn)錄的效率有重大影響。一般啟動子序列與保守序列相似程度越高，啟動子就越強。強啟動子是能維持高頻率轉(zhuǎn)錄的啟動子，通?？刂颇切┘毎枰浯罅哭D(zhuǎn)譯產(chǎn)物的基因轉(zhuǎn)錄；而弱啟動子具有相對較低的轉(zhuǎn)錄效率，指導那些僅需要其少量轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物的基因轉(zhuǎn)錄。利用基因工程技術(shù)，可將由弱啟動子所控制的基因放在強啟動子的下游，從

6、而獲得高效表達。兩個保守區(qū)之間的DNA對啟動子的功能也有影響，各啟動子都需要一些最適的間隙，通常認為間隙為17 bp的啟動子功能較強。2. 真核細胞啟動子中可以找到三個保守區(qū)：位于-12至-32 bp之間的TATA框，序列為TATAATATA，其功能可能為DNA雙鏈開始解開并決定轉(zhuǎn)錄的起點位置。位于-70至-80 bp區(qū)域的CAAT框，序列為GGTCAATCT，其主要作用可能與RNA聚合酶的結(jié)合有關(guān)。位于更上游約-70至-100 bp處的GC框，序列為GGGCGG，也稱為增強子（enhancer），其作用為促進基因的轉(zhuǎn)錄，對基因的表達可產(chǎn)生顯著的增強作用。增強子有時位于基因3端下游區(qū)或在內(nèi)含子

7、中。CAAT框和GC框均為上游因子（upstream elements），它們對轉(zhuǎn)錄的起始頻率有較大的影響。真核生物的啟動子極為復雜，不同啟動子之間的差異較大。例如5s rRNA基因，啟動子在基因下游，且在基因內(nèi)部：又如爪蟾tRNAMet基因，啟動子分成兩部分：真核生物與原核生物的基因結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯過程均有明顯差異，大腸桿菌的RNA聚合酶不能識別動物啟動子順序，真核細胞的啟動子在原核細胞中功能很差，所以要得到真核細胞蛋白的有效表達，應將真核基因放在原核細胞的強啟動子控制之下。3. 常用于表達載體的啟動子：PLac ：乳糖啟動子，是控制Lac Z基因轉(zhuǎn)錄的序列。Lac啟動子可被IPTG誘導，加入

8、該試劑到培養(yǎng)基后，將使表達載體中Lac啟動子下游插入的基因開始轉(zhuǎn)錄，表達產(chǎn)物為包含半乳糖苷酶的融合蛋白。Ptrp ：色氨酸啟動子，通常是編碼參與色氨酸生物合成過程中的幾種酶的基因簇上游序列。trp啟動子被色氨酸抑制，但易被吲哚丙烯酸誘導，也可用色氨酸饑餓誘導，所合成的蛋白質(zhì)產(chǎn)量高于PLac表達載體系統(tǒng)。PL ：噬菌體左向啟動子，負責 DNA分子轉(zhuǎn)錄的啟動子之一。PL是一種可被大腸桿菌RNA聚合酶識別的強啟動子，該啟動子被 cI基因產(chǎn)物所抑制，用 PL構(gòu)建的表達載體上結(jié)合一個溫敏型阻遏物基因（ cI857），在較低溫度（低于30）下cI蛋白可抑制PL，在較高溫度（42）時cI蛋白失活，導致克隆基

9、因的轉(zhuǎn)錄。Ptac ：由Ptrp和PLac雜合而成，啟動效果比二者均強，仍可被IPTG誘導。目前市售的Ptac有兩類（PtacI和PtacII）。上述啟動子都是誘導型強啟動子，表達能力強，但菌生長不好。7.3.1.2 終止子提供轉(zhuǎn)錄停止信號的DNA序列稱為終止子，它可被RNA聚合酶識別并停止合成mRNA。通常終止信號是一小段DNA片段，它的RNA轉(zhuǎn)錄本上堿基對可自身相互配對形成柄-環(huán)結(jié)構(gòu)。目前已檢測了20多種終止序列，其一般特性為：有一個逆向重復的堿基序列，可表示為：ABCDEF-XYZ-FEDCBA，其中A和A，B和B等均為互補堿基對，故可發(fā)生鏈內(nèi)的堿基配對（轉(zhuǎn)錄時雙鏈解開），在RNA轉(zhuǎn)錄本

10、上形成柄-環(huán)（stem and loop）結(jié)構(gòu)。臨近環(huán)端的假柄區(qū)段（有時完全在柄內(nèi)）的G+C堿基含量豐富。終止序列有時存在高A+T區(qū)段（有時不存在這種區(qū)段），這種結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄成相應的RNA，則會產(chǎn)生出68個U堿基（U末端序列）。終止子有兩種不同的類型，一種只取決于DNA的堿基順序，另一種需要終止蛋白質(zhì)的參與。依賴于蛋白質(zhì)的終止反應，對一些調(diào)節(jié)機理而言是十分重要的。協(xié)助RNA聚合酶識別終止信號的輔助因子（蛋白質(zhì)）稱為終止因子（termination factors）。有些終止子的作用可被特異的因子所阻止，使RNA聚合酶得以越過終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，這稱為通讀（readthrough），這類引起抗終止作用的

11、蛋白質(zhì)叫抗終止子因子（antitermination factors）。在克隆基因的末端，存在一個轉(zhuǎn)錄終止區(qū)是十分重要的，這是因為：若干非必需的轉(zhuǎn)錄本的合成，會使耗細胞消耗巨大的能量，用于制造大批不必要的蛋白質(zhì)；在轉(zhuǎn)錄本上有可能形成一些不希望其出現(xiàn)的二級結(jié)構(gòu)，從而降低轉(zhuǎn)譯效率；有時會出現(xiàn)啟動子阻塞現(xiàn)象，克隆基因啟動子所開始的轉(zhuǎn)錄，有時會干擾另一個必要的基因或調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的存在，可使上述這幾種不利的現(xiàn)象得以避免。7.3.2 轉(zhuǎn)譯（翻譯）轉(zhuǎn)譯是指按mRNA信息，由氨基酸合成酶、結(jié)構(gòu)蛋白、激素、抗體等各種功能蛋白的過程。原核生物的轉(zhuǎn)譯過程包括多肽鏈合成的起始、延長和終止三個步驟。1.

12、轉(zhuǎn)譯起始序列mRNA有效地轉(zhuǎn)譯依賴于mRNA的穩(wěn)定性及結(jié)合到核糖體上的能力。大腸桿菌mRNA的核糖體結(jié)合位點是轉(zhuǎn)譯的起始密碼子及SD序列，要獲得良好的表達，關(guān)鍵是起始密碼子以及SD序列必須處在易接觸的部位。細菌的起始密碼子（initiation codon, initiator）通常是AUG，它轉(zhuǎn)譯為n-甲?；琢虬彼?；少數(shù)情況下是GUG，轉(zhuǎn)譯為纈氨酸。真核生物的起始密碼子總是AUG，并轉(zhuǎn)譯為甲硫氨酸（其在DNA中的相應順序為ATG）。所謂SD序列是由Shine-Dalgarno首先提出，為細菌核糖體有效結(jié)合和轉(zhuǎn)譯起始所需要的序列。它以不同長度（39個bp）組成，包含5-UAAGGAGGU-3

13、的全部或其中的一部分，位于mRNA 5-末端不轉(zhuǎn)譯的前導區(qū)段內(nèi)，其起點距轉(zhuǎn)譯起始密碼子AUG約311個堿基。這個SD序列與16s核糖體RNA的3-末端堿基AUUCCUCCACUAG（反SD序列）互補，控制轉(zhuǎn)譯的起始。2. 影響mRNA轉(zhuǎn)譯效果的因素：SD序列與反SD序列的互補程度：互補程度高，則表達強。SD序列與AUG之間的間隔距離（spacer），使用不同的啟動子，表達不同的基因，其最佳間隔不一樣。20 bp到13 bp這一段序列中不要有二級結(jié)構(gòu)（發(fā)卡結(jié)構(gòu)）。連接在SD序列后面的4個堿基的改變，會對轉(zhuǎn)譯效率發(fā)生很大的影響，如果這個區(qū)域由4個A組成，其轉(zhuǎn)譯作用最為有效；而當其被4個C或G替代，

14、則轉(zhuǎn)譯效率僅為最高值的2550%。直接位于起始密碼子AUG左側(cè)的堿基三聯(lián)體的組成，對轉(zhuǎn)譯效率也有重要影響，以半乳糖苷酶mRNA的轉(zhuǎn)譯為例，三聯(lián)體為UAU或CUU時，轉(zhuǎn)譯最有效，而若為UUC或UCA時，則轉(zhuǎn)譯水平下降20倍。在起始密碼子AUG后面的核苷酸序列對核糖體結(jié)合也有一定影響。3. 轉(zhuǎn)譯后的修飾與加工在很多情況下，由mRNA轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)，最初合成的肽鏈需經(jīng)過轉(zhuǎn)譯后的加工和修飾才能成為有活性的功能蛋白。在真核細胞中，有時需將前體蛋白降解為功能蛋白，有時需要發(fā)生某種修飾，如進行糖基化變?yōu)樘堑鞍椎?。而細菌細胞中沒有這一過程，這就可能造成克隆基因在細菌中合成的功能蛋白不具有與原來完全相同的生物活性

15、。克隆基因合成的蛋白質(zhì)常常遇到新的宿主細胞中蛋白酶的迅速降解，尤其是短肽。實驗證明，在細菌中真核基因以融合蛋白表達比非融合蛋白更為穩(wěn)定。所謂融合蛋白是指它的氨基端是原核細胞序列，羧基端是真核細胞序列，這種融合蛋白仍具有真核細胞的抗原性，可用作抗原。該融合蛋白包括位于氨基端的原核蛋白（通常為半乳糖苷酶或內(nèi)酰氨酶的一部分），能被蛋白酶或溴化氰裂解的特殊序列，以及目的蛋白（多肽）。一般融合蛋白要經(jīng)過后加工，切除原核細胞序列，才表現(xiàn)出活性，所以在多肽前設計一個特殊序列，如Met（甲硫氨酸），用溴化氰裂解，打斷Met與其他氨基酸之間的肽鍵，即可將原核序列切除掉。注意，該方法的前提是多肽中無Met。融合蛋

16、白的有用性質(zhì)：許多融合蛋白在細菌中較為穩(wěn)定，可保護基因產(chǎn)物不被降解；有些融合蛋白用化學方法處理后可以釋放出有生物活性的真核肽，如人體胰島素等；有些融合蛋白可以用作抗原，如制備口蹄疫疫苗等。融合蛋白要比多數(shù)大腸桿菌的菌體蛋白大，因此在蛋白質(zhì)凝膠電泳中易于鑒定?？蓪⑷诤系鞍讞l帶從凝膠中切割下來，凍干，碾成粉末，即可用作抗原。為了合成融合蛋白，常采取與表達載體上編碼半乳糖苷酶或內(nèi)酰氨酶的基因相連接的方法，構(gòu)建成雜合基因。pUR278292這些Lac Z融合載體在Lac Z基因的3端有適應所有三種讀框的克隆位點：BamH I、Sal I、Pst I、Xba I、Hind III和Cla I。在適當?shù)目?/p>

17、隆位點插入DNA片段，即可產(chǎn)生由DNA片段編碼的并有半乳糖苷酶活性的融合蛋白。7.3.3 其他因素1. 質(zhì)?？截悢?shù)及穩(wěn)定性對表達效率的影響：細胞中的核糖體數(shù)量，與任何一種mRNA分子數(shù)目相比，都是大大超量的。提高克隆基因表達效率的途徑之一，是增加相應的mRNA分子的數(shù)量。而影響mRNA分子合成速率的因素有兩種：(1) 啟動子強度；(2) 基因的拷貝數(shù)。對于第一種情況，可采用強啟動子；對于第二種情況，可將基因克隆到高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體上。隨著重組體克隆基因表達水平的上升，寄主細胞的生長速率便相應地下降，同時形態(tài)上也會出現(xiàn)一些明顯的變化，如細胞纖維化、脆弱性增加等。如果細菌由于突變而失去了重組質(zhì)粒、或無法表達重組質(zhì)粒、或質(zhì)?？截悢?shù)大大降低，那么這樣的突變體菌株便會有很高的生長速度，迅速成為培養(yǎng)物種的優(yōu)勢菌株；而具有重組質(zhì)粒的寄主細胞，最終會被“稀釋”掉，使克隆基因無法得到表達。由缺陷性分配引起的質(zhì)粒丟失現(xiàn)象，叫做質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性。天然質(zhì)粒具有一段分配功能區(qū)par，能保證質(zhì)粒分子在每次細胞周期中都能準確地進行分離，并均等地分配到子代細胞中去。而在pBR322等質(zhì)粒中，這個par區(qū)已經(jīng)缺失，所以在其寄主細胞分裂時，pBR322質(zhì)粒只能作隨機的分離。盡管pBR322質(zhì)粒仍然是高拷貝數(shù)的，而且產(chǎn)生無質(zhì)粒細胞的幾率也極小，