細胞培養(yǎng)用液

1、Chapter 4 動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng) 體外培養(yǎng)細胞的生物學(xué)特征體外培養(yǎng)細胞的生物學(xué)特征 細胞培養(yǎng)用液細胞培養(yǎng)用液 細胞的基本培養(yǎng)技術(shù)細胞的基本培養(yǎng)技術(shù) 細胞系和細胞株的建立細胞系和細胞株的建立 細胞的凍存、復(fù)蘇和運輸細胞的凍存、復(fù)蘇和運輸Section 2：細胞培養(yǎng)用液細胞培養(yǎng)用液水和平衡鹽溶液水和平衡鹽溶液 天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基 無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基 其它常用液其它常用液 培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制一、水和平衡鹽溶液一、水和平衡鹽溶液1. 蒸餾水蒸餾水玻璃蒸餾器制備的三次蒸餾水玻璃蒸餾器制備的三次蒸餾水盡量減少開啟次數(shù)盡量減少開啟次數(shù)存放時間不宜過長，一般不要

2、超過存放時間不宜過長，一般不要超過2周周最好現(xiàn)制現(xiàn)用最好現(xiàn)制現(xiàn)用2. 平衡鹽溶液平衡鹽溶液（balanced salt solution, BSS ） 主要是由無機鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細胞滲透主要是由無機鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細胞滲透壓平衡，保持壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。 主要用于取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配制其他試主要用于取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配制其他試劑等。劑等。 Ringer、PBS、Hanks or D-Hanks（無鈣、鎂離子）（無鈣、鎂離子） 配制離散細胞的消化液和洗滌液配制離散細胞的消化液和洗滌液時，宜用鈣、鎂離

3、子時，宜用鈣、鎂離子含量低的或無鈣、鎂離子的溶液含量低的或無鈣、鎂離子的溶液 可配制成可配制成10濃度的貯存液，用時稀釋濃度的貯存液，用時稀釋 高壓滅菌，冰箱保存高壓滅菌，冰箱保存 渾濁或沉淀時，應(yīng)重新配制渾濁或沉淀時，應(yīng)重新配制如：如：平衡鹽溶液：無平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液的緩沖液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加新鮮配置的三蒸水或去離子水水至加新鮮配置的三蒸水或去離子水水至1000 ml二、天然培養(yǎng)基二、天然培養(yǎng)基n培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長

4、的溶液，分長的溶液，分天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基和和合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基。蛙胚延髓組織蛙胚延髓組織培養(yǎng)在青蛙淋培養(yǎng)在青蛙淋巴凝塊內(nèi)巴凝塊內(nèi) 血清中的主要成分：血清中的主要成分： 多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等） 多種金屬離子多種金屬離子 激素激素 促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、 膠原等膠原等 各種生長因子各種生長因子 其它不明成分其它不明成分n優(yōu)點：優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好n缺點：缺點： 來源受限。來源受限。 成分復(fù)雜，成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗

5、結(jié)果的分析實驗結(jié)果的分析。 易發(fā)生支原體污染易發(fā)生支原體污染三、人工合成培養(yǎng)基三、人工合成培養(yǎng)基 常用種類：常用種類： RPMI 1640；DMEM；MEM；Eagle；199等等合成培養(yǎng)液的成分合成培養(yǎng)液的成分 氨基酸氨基酸 幾乎所有細胞在缺少谷氨酰胺時，細胞生長不良幾乎所有細胞在缺少谷氨酰胺時，細胞生長不良而死亡。谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置而死亡。谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置20度保存，度保存，用前加入培養(yǎng)液內(nèi)。用前加入培養(yǎng)液內(nèi)。含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4 4度貯存度貯存2 2周以上周以上時，應(yīng)重新加入谷氨酰胺時，應(yīng)重新加入谷氨酰胺 碳水化合物碳水化合物 維生素維生素

6、 無機離子無機離子 其他其他培養(yǎng)時要加血清！培養(yǎng)時要加血清！四、無血清培養(yǎng)基四、無血清培養(yǎng)基 無血清細胞培養(yǎng)基的使用保證了實驗結(jié)果的準確性、可無血清細胞培養(yǎng)基的使用保證了實驗結(jié)果的準確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細胞污染，簡化了提純和鑒定重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細胞污染，簡化了提純和鑒定各種細胞產(chǎn)物的程序。各種細胞產(chǎn)物的程序。 1975年，年，Sato首次成功地用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體首次成功地用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細胞株，近細胞株，近20多年來已報道了幾十種細胞系在無血清培多年來已報道了幾十種細胞系在無血清培養(yǎng)基中成功地生長和增殖。養(yǎng)基中成功地生長和增殖。 無血清培養(yǎng)基的主要研制策略無血清培

7、養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充各：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充各種必需因子，如種必需因子，如激素、生長因子激素、生長因子 、結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白 、貼壁和貼壁和擴展因子擴展因子 等。等。 無血清培養(yǎng)基的組成無血清培養(yǎng)基的組成 基礎(chǔ)培養(yǎng)液基礎(chǔ)培養(yǎng)液 替代血清的附加成分替代血清的附加成分（細胞外基質(zhì)、激素、生長因子等）（細胞外基質(zhì)、激素、生長因子等） 向無清培養(yǎng)液中能促進細胞系生長的補加物都是獨向無清培養(yǎng)液中能促進細胞系生長的補加物都是獨特的特的。適用于某種細胞株的培養(yǎng)液，很可能不適合。適用于某種細胞株的培養(yǎng)液，很可能不適合另一種細胞株的生長。即使同源組織的不同細胞株，另一種細胞株的生長。即使同源組織的

8、不同細胞株，所需補加物也不同。所需補加物也不同。 無血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。無血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。 目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時還需添加目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時還需添加血清血清 。五、其它常用液五、其它常用液消化液消化液 胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液 EDTA溶液溶液pH調(diào)整液調(diào)整液 NaHCO3液液 HEPES液液抗生素液抗生素液 消化液消化液（可含（可含0.02%EDTA） 胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。粘蛋白及糖蛋白，影響細胞

9、骨架，從而使細胞分離。 胰蛋白酶液濃度越高，作用越強胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。，但超過一定限度會損傷細胞。 胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的的D-Hanks或或PBS緩沖液配制；緩沖液配制；常用的胰蛋白酶液濃度是常用的胰蛋白酶液濃度是0.25 。用濾器過。用濾器過濾除菌。濾除菌。 胰蛋白酶液消化時間胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。分鐘。 用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用 0.02%EDTA溶液溶液 亦稱亦稱Versen液。液。 化學(xué)鰲合劑，對細胞有一定的離解作用?；瘜W(xué)鰲合劑，

10、對細胞有一定的離解作用。 EDTA：乙二胺四乙酸二鈉：乙二胺四乙酸二鈉 pH調(diào)整液調(diào)整液 NaHCO3液：液：常用濃度常用濃度7.4%、5.6%、3.7%。三蒸水配制，。三蒸水配制，過濾除菌，塞緊瓶塞保存。過濾除菌，塞緊瓶塞保存。 HEPES （N-2-hydroxy-ethylpiperazine-N-ethanesulfonic acid）液：液：一種氫離子緩沖劑，可較長時間一種氫離子緩沖劑，可較長時間保持緩沖作用。可按所需濃度（一般保持緩沖作用?？砂此铦舛龋ㄒ话?050mM）直接加入配）直接加入配制的培養(yǎng)液中。制的培養(yǎng)液中。 HEPES是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸是一種弱酸

11、，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸（MW=238.31），對細胞無毒性），對細胞無毒性 HEPES不是起維持不是起維持pH恒定的作用，而是起恒定和抵恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速抗快速pH變化的，所以調(diào)整變化的，所以調(diào)整pH常常用常常用NaHCO3溶液。溶液。 抗生素液抗生素液n 在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制由于操作不慎所致的微生物污染。由于操作不慎所致的微生物污染。n通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)最終使用濃最終使用濃度度為為青霉素青霉素100單位單位/ml、鏈霉素、鏈霉素100微克微克

12、/ml（雙抗）（雙抗）。n可根據(jù)不同的污染物選擇抗生素：如，制霉菌素可根據(jù)不同的污染物選擇抗生素：如，制霉菌素 n一般配制成母液，用時稀釋?。ㄒ话闩渲瞥赡敢海脮r稀釋?。ǔ砍?？） 計算：計算：100ml培養(yǎng)基加培養(yǎng)基加50ul PS，母液濃度應(yīng)配成多少？，母液濃度應(yīng)配成多少？P每瓶每瓶80萬萬U，可配（），可配（）ml母液？相應(yīng)加入（）克母液？相應(yīng)加入（）克S？六、培養(yǎng)基的配制六、培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)液的種類培養(yǎng)液的種類 生長培養(yǎng)液生長培養(yǎng)液基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基 80%-90%血清血清 10%-20%抗生素（青霉素抗生素（青霉素100單位單位/ml和鏈霉素和鏈霉素100g/ml） 維持液維持

13、液基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基 95% -98%血清血清 2%-5% 血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。 常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血清、兔常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好胎牛血清質(zhì)量最好。 優(yōu)質(zhì)血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細優(yōu)質(zhì)血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。菌、支原體、病毒污染。 血清的滅活（消除補體活性）血清的滅活（消除補體活性）：56 ，30 分鐘分鐘 血清的消毒：血清的消毒：過濾除菌過濾除菌 培養(yǎng)基的配制舉例培養(yǎng)基的配制舉例 RPMI-1640培養(yǎng)粉培養(yǎng)粉 1袋袋碳酸氫鈉碳酸氫鈉 2.0 g青、鏈霉素青、鏈霉素 各各100單位毫升單位毫升加三蒸水加三蒸水 至至 1000ml, 過濾除菌。過濾除菌。 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH值至值至7.2 加血清（終濃度加血清（終濃度 10） 培養(yǎng)基粉末中一般都加入了酚紅（當溶液酸性時培養(yǎng)基粉末中一般都加入了酚紅（當溶液酸性時pH小小于于6.8呈