PCR技術(shù)的基本原理

1、PCR技術(shù)的基本原理PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應作準備；模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的

2、半保留復制鏈重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘， 23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。(Plateau)。 到達平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。PCR的反應動力學 PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數(shù)上升。反應最終的DNA 擴增量可用Y(1X)n計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值。 反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴增

3、的DNA 片段不再呈指數(shù)增加，而進入線性增長期或靜止期， 即出現(xiàn)“停滯效應” ，這種效應稱平臺期數(shù)、PCR 擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟爭等因素。大多數(shù)情況下，平臺期的到來是不可避免的。PCR擴增產(chǎn)物 可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5'端之間，是需要擴增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中， 以兩條互補的DNA為模板，引物是從3'端開始延伸， 其5'端是固定的，3' 端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產(chǎn)物片段”

4、。進入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)時， 由于新鏈模板的5'端序列是固定的， 這就等于這次延伸的片段3'端被固定了止點， 保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內(nèi)、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加， 而“長產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加， 幾乎可以忽略不計， 這使得PCR的反應產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析  1. Polymerase Chain Reaction 具體內(nèi)容點擊： 聚合酶鏈式反應，簡稱PCR。又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外

5、引物定向酶促擴增技術(shù)。 由美國科學家PE（Perkin Elmer珀金-埃爾默）公司遺傳部的Dr. Mullis發(fā)明，由于PCR技術(shù)在理論和應用上的跨時代意義，因此Mullis獲得了1993年化學諾貝爾獎。 是一種體外快速擴增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，數(shù)小時內(nèi)可使目的基因片段擴增到數(shù)百萬個拷貝的分子生物學技術(shù)。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物

6、結(jié)合，為下輪反應作準備；模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。 所有的DNA的復制都是從一個固定的起始點開始的，而DNA聚合酶只能延長已存在的DNA鏈，不能從頭合成DNA鏈

7、，新DNA的復制是如何形成的？經(jīng)大量實驗研究證明，DNA復制時，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由聚合酶從RNA引物3端開始合成新的DNA鏈。引物科技名詞定義中文名稱：引物 英文名稱：primer 定義1：在聚合作用的起始時，可以刺激合成另一種大分子，并與反應物以共價鍵形式連接的序列。在核酸化學中，引物是一段短的單鏈RNA或DNA片段，可結(jié)合在核酸鏈上與之互補的區(qū)域，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點，核酸聚合酶可由其3端開始合成新的核酸鏈。體外人工設計的引物被廣泛用于聚合酶鏈反應、測序和探針合成等。 所屬學科：生物化學與分子生物學（一級學科）；總論（二級學科） 定義2

8、：在多聚酶鏈式反應中，用于引導脫氧核糖核酸合成的一段核苷酸序列。 所屬學科：水產(chǎn)學（一級學科）；水產(chǎn)生物育種學（二級學科） 定義3：（1）DNA復制時，由引物酶催化合成的DNA復制的RNA引導序列。（2）體外人工合成DNA中，可與模板結(jié)合的單鏈核苷酸片段。 所屬學科：細胞生物學（一級學科）；細胞遺傳（二級學科） 定義4：含游離3'-羥基并引發(fā)聚合反應的寡核苷酸序列。 所屬學科：遺傳學（一級學科）；分子遺傳學（二級學科） 本內(nèi)容由全國科學技術(shù)名詞審定委員會審定公布 百科名片   引物引物（primer），是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復制的起始點，在核酸合成反

9、應時，作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發(fā)點而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3-OH上，核苷酸以二酯鏈形式進行合成，因此引物的3-OH，必須是游離的。目錄類型 引物設計原則 1. 1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設計。 2. 2.引物長度一般在1530堿基之間。 3. 3.引物GC含量在40%60%間，Tm值最好近72 4. 4.引物3端要避開密碼子的第3位。 5. 5.引物3端不能選擇A，最好選擇T。 6. 6. 堿基要隨機分布。 7. 7. 引物自身及引物之間不應存在互補序列。 8. 8. 5 端和中間G值應相對較高3 端較低 9. 9.引物的5端可以修飾，而3端不可修飾。 10. 10.

10、擴增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。 11. 11. 引物應具有特異性。常用引物設計軟件類型 引物設計原則 1. 1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設計。 2. 2.引物長度一般在1530堿基之間。 3. 3.引物GC含量在40%60%間，Tm值最好近72 4. 4.引物3端要避開密碼子的第3位。 5. 5.引物3端不能選擇A，最好選擇T。 6. 6. 堿基要隨機分布。 7. 7. 引物自身及引物之間不應存在互補序列。 8. 8. 5 端和中間G值應相對較高3 端較低 9. 9.引物的5端可以修飾，而3端不可修飾。 10. 10. 擴增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。 11. 11. 引物應具有特異

11、性。常用引物設計軟件展開編輯本段類型存在有自然中生物的DNA復制引物（RNA引物）和聚合酶鏈式反應(PCR)中人工合成的引物（通常為 DNA引物）。一般所說引物，指DNA引物，以下簡稱引物。 編輯本段引物設計原則引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補。 在PCR（聚合酶鏈式反應）技術(shù)中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根據(jù)這一序列合成引物，利用PCR擴增技術(shù)，目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈，引物與單鏈相應互補序列結(jié)合，然后在DNA聚合酶作用下進行延伸，如此重復循環(huán)，延伸后得到的產(chǎn)物同樣可以和引物結(jié)

12、合。 PCR引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。如前述，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。對引物的設計不可能有一種包羅萬象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設計。 1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設計。DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。 2.引物長度一般在1530堿基之間。引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過長會導致其延

13、伸溫度大于74，不適于Taq DNA 聚合酶進行反應。 3.引物GC含量在40%60%間，Tm值最好近72GC含量（composition）過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm值510。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為5580，其Tm值最好接近72以使復性條件最佳。 4.引物3端要避開密碼子的第3位。如擴增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的

14、第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。 5.引物3端不能選擇A，最好選擇T。引物3端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3端最好選擇T。 6. 堿基要隨機分布。引物序列在模板內(nèi)應當沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發(fā)（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不應超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。

15、 7. 引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。 兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3 端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross dimer）的形成。引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應盡量使其G值不要過高（應小于4.5kcal/mol）。否則易導致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行。 8. 5 端和中間G值應相對較高3 端較低G值是指DN

16、A 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性，G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應當選用5 端和中間G值相對較高，而3 端G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3 端的G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應。（不同位置的G值可以用Oligo 6軟件進行分析） 9.引物的5端可以修飾，而3端不可修飾。引物的5 端決定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5 端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。 引物的延伸是從3

17、端開始的，不能進行任何修飾。3 端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能。 10. 擴增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。某些引物無效的主要原因是擴增產(chǎn)物單鏈二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件（比如RNAstructure）可以預測估計mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（G°）小于58.6l kJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。 11. 引物應具有特異性。引物設計完成以后，應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。 值

18、得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因為產(chǎn)物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。 做Real Time時,用于SYBR Green I法時的一對引物與一般PCR的引物,在引物設計上所要求的參數(shù)是不同的。引物設計的要求： 避免重復堿基，尤其是G. Tm=58-60度。 GC=30-80%. 3'端最后5個堿基內(nèi)不能有多于2個的G或C. 正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。 PCR擴增產(chǎn)物長度： 引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80

19、-250bp之間都可；80150 bp最為合適（可以延長至300 bp）。 引物的退火溫度要高，一般要在60度以上； 要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。 而且引物設計時應該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。 做染料法最關(guān)鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預防工作。對于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想準備-尋找合適的引物非常不容易。 關(guān)于BLAST的作用應該是通過比對，發(fā)現(xiàn)你所設計的這個引物，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并在GENEBANK中公開的不物種基因序列當中，除了和你的目標基因之外，還有沒有和其他物種或其他序列當中存在相同的序列，如和你的目標序列之外的序列相同的序列，則可能擴出其他序列的產(chǎn)物，那么這個引物的特異性就很差，從而不能用。 編輯本段常用引物設計軟件Oligo 6 Oligo 6是目前使用最為廣泛的一款引物設計軟件，除了可以簡單快捷地完成各種引物和探針的設計與分析外，還具有很多其      他同類軟件所不具有的高級功能： 已知一個PCR引物的序列，搜尋和設計另一個引物的序列； 按照不同的物種對MM子的偏好性設計