生物學中的組織培養(yǎng)

1、生物學中的組織培養(yǎng)一、組織培養(yǎng)(Tissue culture)的含義組織培養(yǎng)，簡單地說即把來自機體的細胞、組織或器官放于類似于體內(nèi)的體外環(huán)境中使其存活或/和生長、增殖。嚴格地區(qū)分，它又可分為細胞培養(yǎng)(cell culture )：指細胞在體外的生長、增殖，但培養(yǎng)中的細胞不再結(jié)合成組織；組織培養(yǎng)：指組織在體外存活生長，并保持其結(jié)構(gòu)和/或功能及進行分化；器官培養(yǎng)(Organ culture)：指器官的原基、全部或部分器官在體外的存活生長，并保持其結(jié)構(gòu)和/或功能及進行分化。但組織培養(yǎng)一詞又常泛地指各種體外培養(yǎng)。更廣義地說，組織培養(yǎng)可包括人及動物的組織培養(yǎng)，植物的組織培養(yǎng)以及病毒培養(yǎng)等。各種不同的組織

2、培養(yǎng)在方法上雖有其不同和特殊要求，但它們又有共同的基本原則和技術。本文主要從人和動物細胞培養(yǎng)的角度加以介紹。二、組織培養(yǎng)技術的出現(xiàn)和發(fā)展早在19世紀末就開始了對活細胞的體外觀察與保存工作。1885年Roux 用生理鹽水培養(yǎng)雞的神經(jīng)板，發(fā)現(xiàn)它可在鹽水中生活一段時間。 1887年 Arnold用一種巧妙的方法培養(yǎng)白細胞，他將赤楊木的髓質(zhì)薄片浸于蛙的體液中，然后種植到蛙的皮下，當將髓片取出置于鹽水中時，可觀察到白細胞從髓片上向鹽水內(nèi)移動并能較長時期保持它的生活力。1903年Jlly分別將皮膚及白細胞培養(yǎng)于腹水及血清中，細胞存活可達一周到一個月，并看到了細胞分裂。但真正的組織培養(yǎng)應歸功于1907年Ha

3、rrison的努力，他為探討神經(jīng)纖維的真正來源，從蛙胚中分離出一部分神經(jīng)管，培養(yǎng)在一滴蛙的淋巴液中，成功地看到了神經(jīng)纖維的末端不停地進行阿米巴運動，其中一根神經(jīng)纖維在25分鐘之內(nèi)長到20微米，另一根在50分鐘內(nèi)長到25微米，最長的達到了200微米。這一發(fā)現(xiàn)不僅解決了當時爭論不休的神經(jīng)纖維的起源問題，也是在后來組織培養(yǎng)中懸滴培養(yǎng)法的開始。1912年Carrel發(fā)現(xiàn)雞胚浸出液對多種細胞生長有高度促進作用，他將7天雞胚心臟的組織塊培養(yǎng)在血漿和雞胚提取液的混合物中，當細胞生長出暈后再把它分成兩分進行培養(yǎng)，在當時沒有抗菌素，所以細菌污染是一個最大的困難，但由于Carrel是一個有成就的實驗外科學家，有豐

4、富的無菌操作知識，所以在他的努力下雞胚細胞的培養(yǎng)連續(xù)維持了34年之久。雖然由于經(jīng)常加入新鮮的胚胎浸出液而使人懷疑是否帶入了新的細胞，但他使用的培養(yǎng)液，采用的無菌技術，以及后來設計的培養(yǎng)瓶(卡氏瓶)等都是對組織培養(yǎng)的重要貢獻。特別是他的連續(xù)培養(yǎng)，為后來的傳代培養(yǎng)奠定了基礎。大約與此同時，在Carrel等人工作的影響下，一些學者開始了細胞培養(yǎng)中的營養(yǎng)成分，培養(yǎng)液的滲透壓，酸堿度等因素的研究。從而設計出了能長期維持動物組織、細胞生存的各種人工培養(yǎng)液，其中1950年Morgan等人經(jīng)過大量研究設計的“199”培養(yǎng)液至今仍廣泛用于人及哺乳動物細胞的培養(yǎng)。1943年Earle用致癌物20-甲基膽蒽處理來源

5、于C3H小鼠的結(jié)締組織培養(yǎng)物，獲得了能回種于小鼠體內(nèi)而生長成肉瘤的長期培養(yǎng)的細胞系，定名為L細胞系。1951年Gey成功地由人的宮頸癌組織建立了能在體外連續(xù)長期培養(yǎng)的Hela細胞系。這些細胞系至今仍在世界各國廣為應用。我國細胞學工作者在組織培養(yǎng)方面也有一定貢獻。如早在1953年鮑鑒清就培養(yǎng)了皮膚、睪丸、卵巢、羊膜、腹膜等組織。陳瑞銘(1957年)設計了一種擦鏡紙的器官培養(yǎng)法，成功地培養(yǎng)了大鼠的肝、胰、腦、垂體、甲狀腺、腎上腺等器官。何申等(1959年)建立了來源于人體的骨軟骨肉瘤細胞株。三、組織培養(yǎng)的基本條件1 無菌及滅菌由于要維持細胞在體外長時間生長、繁殖，所以在培養(yǎng)過程中的全部用具及操作過

6、程必須保證無菌，一旦有細菌污染細胞則不能繼續(xù)存活。因此所用器具應首先進行嚴格清洗，然后再進行高壓滅菌或干烤滅菌。對不能用高壓或干烤滅菌的液體可用除菌濾器除菌。過去的操作環(huán)境一般在無菌室(密封，使用前用紫外線殺菌)進行。近年多應用國產(chǎn)潔凈工作臺(借助空氣過濾及高速吹風除菌)進行操作。亦可二者結(jié)合應用。2 培養(yǎng)基(medium)人工培養(yǎng)基的成分主要含有各種氨基酸，維生素，糖和無機鹽等，并使其有與體液相等的滲透壓，同時加入適量的碳酸氫鈉，以調(diào)節(jié)其酸堿度，使pH維持在左右。目前常用的人工培養(yǎng)基種類很多，如：“199”、“RPMI1640”、伊格(Eagle)、費歇(Fischer)等等。它們之間的區(qū)別

7、主要在含有氨基酸、維生素等的數(shù)量和種類上有所不同。在應用時可根據(jù)所培養(yǎng)的細胞類型及自己的經(jīng)驗而選擇。但是，目前無論使用哪種培養(yǎng)基一般都要加入520的動物血清，最常用者為初生的小牛血清，其次，馬血清、人血清等亦有應用。由于對血清的成分還不完全清楚，所以它對培養(yǎng)細胞的作用機理也還不十分了解。近來對無血清培養(yǎng)亦有文獻報道，但這一問題尚在研究之中。當然，理想的人工培養(yǎng)基最好完全模擬體內(nèi)環(huán)境，不過目前尚未達到。3 培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿液體培養(yǎng)常用長方形培養(yǎng)瓶，有100ml，30ml， 15ml不等，此外還有扁圓形的卡氏瓶以及適用于微量培養(yǎng)的多孔微量培養(yǎng)板等。在二氧化碳培養(yǎng)箱中進行開放培養(yǎng)時多用培養(yǎng)皿，同時它也

8、被用于半固體培養(yǎng)。國內(nèi)所用培養(yǎng)瓶(皿)均采用優(yōu)質(zhì)中性玻璃制成，便于洗涮及反復應用。但國外現(xiàn)已普遍采用塑料制品。4 溫度及二氧化碳用培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)，一般放于37恒溫箱中即可，目前國外已普遍將細胞接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，在含510的二氧化碳的空氣環(huán)境中進行培養(yǎng)。一定量的二氧化碳有利于酸堿度的維持及細胞生長。二氧化碳培養(yǎng)需要放在二氧化碳培養(yǎng)箱中。二氧化碳培養(yǎng)箱，它除可維持37恒溫之外，還可維持一定的二氧化碳濃度，雖然近年來國內(nèi)已有產(chǎn)品，但價格仍較昂貴，不易推廣使用。用真空干燥器充以含510二氧化碳的空氣來代替二氧化碳培養(yǎng)箱可以達到同樣目的，這種方法目前已為國內(nèi)許多實驗室所采用。四、組織培養(yǎng)方法的基本類型1

9、液體培養(yǎng)(Liquidculture)使細胞在液體培養(yǎng)基中生長，目前應用最廣。以細胞在培養(yǎng)瓶中的存在方式區(qū)分，它又分為兩種：單層培養(yǎng)(monolayer culture)：培養(yǎng)的細胞貼附于培養(yǎng)瓶(皿)底面的壁上，長成一層單層細胞的薄片。懸浮培養(yǎng)(suspension culture)：培養(yǎng)的細胞懸浮于培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液中，不貼于瓶壁。亦有的培養(yǎng)物一部分細胞貼壁生長，另一部分細胞懸浮生長。以培養(yǎng)的目的區(qū)分，用液體培養(yǎng)法(包括單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng))又有以下幾種：原代培養(yǎng)(Primary culture)：即將直接取自機體的組織塊或細胞如：血細胞、胸腔或腹腔的游離細胞或?qū)⒔M織取出后在體外制成的分散細胞放

10、入培養(yǎng)瓶(皿)中進行培養(yǎng)，在進行傳代之前稱為原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的細胞不斷增殖，細胞密度增加，如不傳代一般大部分細胞在短期內(nèi)死亡，存活的細胞亦不能進行正常增殖。原代培養(yǎng)可作為建立細胞系或細胞株的開始，亦可進行短期的實驗研究。傳代培養(yǎng)(Subculture)：把原代培養(yǎng)的細胞分開接種于新的培養(yǎng)瓶(皿)中，稱為“傳代”(Passage)，每分開接種一次為一代。一般所說的培養(yǎng)細胞的“代數(shù)”即由此計算而來。克隆培養(yǎng)(Clone culture)：從原代或傳代培養(yǎng)的細胞中分離出單個細胞并使其增殖或使單個細胞增殖后再進行分離，稱為克隆培養(yǎng)。細胞系(Cell line)和細胞株(Cell strain)的培養(yǎng)

11、：把原代培養(yǎng)的細胞連續(xù)傳代即稱為細胞系。從原代或傳代培養(yǎng)的細胞中選擇出具有特殊性質(zhì)或特征的細胞，使其克隆化，并在以后的連續(xù)培養(yǎng)中保持這種特殊性質(zhì)或特征，即稱為細胞株。2 半固體培養(yǎng)(Semisolid culture)在培養(yǎng)液中加入左右的瓊脂，使培養(yǎng)基成為半固體的膠凍狀態(tài)，細胞在其中增殖而不脫離原位。從而由一個細胞增殖而來的細胞聚集在一起，形成一個集落。它可用于對增殖細胞的計數(shù)，進行細胞克隆的選擇以及對正常細胞惡變鑒定的指標。同時更廣泛地用于對造血干細胞的培養(yǎng)。五、組織培養(yǎng)在生物學研究中的地位和應用我們知道生物學的研究對象是有生命的生物，而那些構(gòu)成生命物質(zhì)的蛋白質(zhì)、核酸、脂類、糖類及其它分子都

12、不能單獨地完成生命過程，只有當這些分子按一定方式構(gòu)成細胞之后才能表現(xiàn)出生命現(xiàn)象。因此，細胞不僅是構(gòu)成生物機體的基本組成單位，也是研究一切生命現(xiàn)象和本質(zhì)的基本材料。在組織培養(yǎng)技術未完善之前，用于生物學研究的細胞主要來自整體動物，其缺點在于對細胞本身只能進行死后觀察，同一組織中的不同細胞不易分開，并且常夾雜著其它組織成分，以及實驗周期長，材料來源不便等。而用體外培養(yǎng)的細胞則可在細胞水平直接觀察細胞的生長、增殖、分化等動態(tài)過程，從而研究它們在各種因素作用下的變化規(guī)律。同時它又可將實驗條件直接作用于細胞，而不受體內(nèi)神經(jīng)、體液等因素的干擾。特別是對不能直接用人體進行實驗的研究，可將所要研究的人體細胞取下來通過組織培養(yǎng)進行研究。組織培養(yǎng)不僅是細胞學研究中的一種重要方法，也是生物學許多學科研究中的一項基本條件和技術。如：在腫瘤學研究中，應用細胞培養(yǎng)可以研究引起細胞癌變的因素和原理，研究殺滅癌細胞的藥物；在免疫學中可用培養(yǎng)細胞生產(chǎn)各種病毒疫苗及抗體等；在遺傳學研究中首先要通過細胞培養(yǎng)才能制出供進行分析的染色體標本。特別是在一些新型的生物學科的研究中，如：細胞工程研究中的細胞融合，細胞的核移植以及基因工程研究中的基因移植等都需要利用培養(yǎng)的細胞進行?？梢灶A料這些研究成果將有助于解決諸如像腫瘤的發(fā)生，遺傳性疾病的