胃舒散對(duì)消炎痛所致大鼠小腸損傷的保護(hù)作用

1、胃舒散對(duì)消炎痛所致大鼠小腸損傷的保護(hù)作用    【摘要】  目的： 研究胃舒散對(duì)消炎痛所致大鼠小腸損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法： 皮下注射消炎痛(10mg/kg)制作大鼠小腸損傷模型。用光鏡、掃描電鏡和透射電鏡觀察不同劑量3?0、1?5、0?75g/(kg·d)胃舒散對(duì)小腸損傷的影響, 同時(shí)檢測(cè)小腸黏膜髓過(guò)氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量以及血清NO含量。結(jié)果：消炎痛引起明顯的小腸黏膜損傷，伴有NO、MPO、MDA含量增加及SOD活性下降(P<0?05,P<0?01)。胃舒散劑量依賴性地

2、減少小腸黏膜損傷指數(shù), 提高了胃組織SOD活性(P<0?05)、 降低了MPO、 MDA含量(P<0?05)，但對(duì)血清NO水平無(wú)明顯影響(P>0?05)。結(jié)論：氧自由基及NO參與了消炎痛所致小腸黏膜的損傷，胃舒散對(duì)此病變有明顯保護(hù)作用，其機(jī)制與抗氧化作用有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  小腸損傷 消炎痛 胃舒散 一氧化氮 超氧化物歧化酶 丙二醛   AbstractObjective:To study the protective effect of Weishusan on small intestinal lesions induced by indomethac

3、in in rats. Methods: Wistar rats were injected indomethacin(suspension 10 mg/kg)subcutaneously, and the small intestine was examined for lesions 24 hours later. The different doses3?0、1?5、0?75 g/(kg·d)of Weishusan were administered i.g. twice, intestinal mucosal changes were observed by quantit

4、ative histology，scanning electron microscopy and transmisson electron microscopy.  Superoxide dismutase(SOD)、myeloperoxidase(MPO)activities and malondialdehyde(MDA)levels in intestinal tissues and nitric oxide(NO)levels in serum were determined. Results: Severe lesions in the jejunum and ileum

5、were caused by indomethacinand the NO、MPO and MDA contents were markedly increased(P<0?05). Weishusan dose_dependently prevented the intestinal lesions(P<0?05), enhanced SOD activities(P<0?05)and decreased MPO and MDA levels(P<0?05) but not affected NO levels(P>0?05). Conclusion: Oxyg

6、en free radicals and NO may play important roles in intestinal lesions induced by indomethacin. Weishusan can protect the small intestine by antioxidation mechanism.     Key Wordsintestinal lesion; indomethacin; Weishusan; nitric oxide; superoxide dismutase; malondialdehyde  

7、0; 近年，隨著老年人口的增多，非甾體類消炎藥(NSAID)在防治冠心病、風(fēng)濕性骨關(guān)節(jié)炎等疾病中應(yīng)用愈來(lái)愈廣泛，其導(dǎo)致的胃腸疾病亦逐年增多。胃舒散是我院自行研制的中西藥復(fù)方散劑，多年臨床應(yīng)用顯示對(duì)胃炎、消化性潰瘍及胃腸功能紊亂等有良好的療效1，2，但是否對(duì)藥物引起的小腸損傷有治療作用尚不清楚。本項(xiàng)目通過(guò)檢測(cè)有關(guān)生化指標(biāo)并借助光鏡、電鏡、生化技術(shù)觀察胃舒散的保護(hù)作用，旨在探討消炎痛致小腸損傷的機(jī)理并為臨床尋找新的治療方案。     1材料與方法     1?1 動(dòng)物與藥物Wistar大鼠汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。體質(zhì)量(220&#

8、177;35)g，雌雄各半40只，分籠飼養(yǎng)，自由飲水(過(guò)濾除菌的自來(lái)水)。胃舒散由我院藥劑科生產(chǎn)(批號(hào)：粵藥制字H03050164)。     1?2 模型制備及實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食、水2h。模型制作：將消炎痛粉溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%碳酸氫鈉溶液內(nèi)，按10mg/mL濃度配成細(xì)混懸液，實(shí)驗(yàn)時(shí)按10mg /kg的劑量1次皮下注射，24h后斷頸處死動(dòng)物。分組：胃舒散治療組(在注射消炎痛前30min及注射后8h分別給予不同濃度但容量相同的胃舒散溶液，分2次灌胃)，胃舒散中劑量組(1?5g/kg，即按成人劑量15倍給藥)，胃舒散高劑量組3?0g/(kg·d)和胃舒散低

9、劑量組0?75g /(kg·d)。模型對(duì)照組用等量的體積分?jǐn)?shù)0?85%的NS灌胃，正常對(duì)照組皮下注射NS，亦給等量的0?85% NS灌胃。注射消炎痛后大鼠禁食不禁水，在第2次灌胃前仍需禁水2h。     1?3光鏡檢查大鼠處死后剖腹，沿腸系膜附著的對(duì)側(cè)剪開(kāi)小腸，在回腸中段6cm處取組織，用4等滲NS沖凈腸內(nèi)容物及黏液，體積分?jǐn)?shù)10%的中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，蘇木精_伊紅染色，光鏡下觀察，按NEC法進(jìn)行小腸損傷評(píng)分3。     1?4電鏡觀察掃描電鏡：將大鼠小腸組織放入含透明質(zhì)酸酶和_糜蛋白酶(pH 5

10、6)溶液中，在振蕩器上持續(xù)振蕩，去除黏膜面表層黏液，體積分?jǐn)?shù)2?5%的戊二醛和體積分?jǐn)?shù)2%的四氧化鋨雙重固定，常規(guī)乙醇系列脫水，醋酸異戊脂過(guò)渡，在HCP_2型臨界點(diǎn)干燥儀(日立公司，日本)上干燥，噴金后在JSM_6360LA掃描電鏡(JEOL公司，日本)下觀察。透射電鏡：將小腸在冷的 4%的戊二醛_磷酸鹽(pH 7?4)中切成小塊，預(yù)固定2h，1%的鋨酸后固定1h，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，LKB_2088型超薄切片機(jī)(LKB公司，瑞典)切片，醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色后，在H_800型電鏡(日立公司，日本)下觀察。     1?5生化指標(biāo)檢測(cè)取回腸中段組織，制成勻漿并離心，取上

11、清液進(jìn)行檢測(cè)。SOD測(cè)定采用改良的亞硝酸鹽法，在DU650型分光光度計(jì)(Beckman公司，美國(guó))上測(cè)定，使空白管OD值下降50%的SOD量定為酶活力1個(gè)亞硝酸鹽單位(NU/mg)。NO測(cè)定用NO酶法，設(shè)空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管，測(cè)定管內(nèi)加入0?3mL待測(cè)血清，各管混勻放置10min，(35004000)r/min離心10min，取上清液0?8mL，加入顯色劑0?4mL，混勻，15min后測(cè)其吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線查找相應(yīng)NO濃度(NU/mL)。MPO測(cè)定見(jiàn)參考文獻(xiàn)4(U/g)。MDA測(cè)定按硫代巴比妥酸縮合法，試劑盒由南京聚力生物有限公司提供。蛋白質(zhì)測(cè)定采用Lowry法。   

12、  1?6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料及損傷指數(shù)用±s表示，用SPSS11?5統(tǒng)計(jì)軟件，行單側(cè)ANOVAE及t檢驗(yàn)分析。     2 結(jié)果     2?1光學(xué)顯微鏡觀察正常對(duì)照組上皮細(xì)胞排列整齊，形態(tài)基本正常，未見(jiàn)細(xì)胞明顯損傷，少數(shù)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，損傷指數(shù)0?17±0?05。模型對(duì)照組小腸黏膜固有層水腫并伴有腸系膜緣炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小腸絨毛頂端上皮下可見(jiàn)囊狀間隙，呈廣泛黏膜炎癥并伴縱向潰瘍(深淺不一、點(diǎn)狀、線狀)，沿小腸壁環(huán)周?chē)呦虻臐兩僖?jiàn)，尤以中段及遠(yuǎn)端小腸病變明顯，損傷指數(shù)2?31±0?75，明顯高于正

13、常對(duì)照組(P<0?01)。胃舒散高、中劑量組小腸黏膜損傷指數(shù)分別為1?28±0?47和1?35±0?50，與模型組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0?01，P<0?05)。胃舒散小劑量組損傷指數(shù)為 1?65±0?58，與模型組比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0?05)，表明高、中劑量胃舒散對(duì)小腸損傷具有保護(hù)作用。     2?2掃描電鏡觀察正常對(duì)照組小腸黏膜絨毛約150m×50m，呈條柱狀排列，表面光滑、完整，有片狀皺折(圖1A，封3)。模型對(duì)照組小腸上皮表面破損明顯，有縱向潰瘍(圖1B，封3)。胃舒散中、高劑量組小腸黏膜損

14、傷明顯減輕，僅見(jiàn)點(diǎn)狀潰瘍，周邊上皮結(jié)構(gòu)完整(圖1C，封3)。     2?3 透射電鏡觀察正常對(duì)照組小腸黏膜為單層柱狀上皮，其間夾有少量杯狀細(xì)胞，上皮游離面有豐富的微絨毛，上皮細(xì)胞間除游離端為緊密連接外，多數(shù)為中間連接和相嵌連接，胞質(zhì)豐富，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多。模型對(duì)照組上皮細(xì)胞極性消失，杯狀細(xì)胞顯著增多，黏膜柱狀上皮細(xì)胞體積縮小，可見(jiàn)細(xì)胞凋亡小體，核有固縮、溶解現(xiàn)象，異染色質(zhì)邊集成半月?tīng)睢０|(zhì)內(nèi)線粒體斷脊、空泡變性，溶解，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，血管普遍擴(kuò)張，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)破裂(圖2A，封3)。胃舒散中、高劑量組小腸黏膜上述損傷則較輕，無(wú)核膜斷裂溶解，線粒體斷

15、脊，溶解少見(jiàn)(圖2B，封3)。     2?4胃舒散對(duì)大鼠血液NO、 小腸組織MPO、 SOD、MDA水平的影響從表中可見(jiàn)，模型對(duì)照組NO、MPO、MDA水平均明顯升高(P<0?05)，胃舒散中、高劑量組可顯著降低MPO、 MDA的含量(P<0?05)，但對(duì)NO活性無(wú)明顯影響(P>0?05)；模型對(duì)照組SOD含量顯著低于正常對(duì)照組(P<0?01)，胃舒散中、高劑量組則可增加SOD活性，與模型對(duì)照組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0?05)。表1胃舒散對(duì)大鼠血液NO、小腸組織MPO、SOD、MDA 水平的影響   &#

16、160;3討論     全球有約3500萬(wàn)人/d使用NSAID，美國(guó)約有因NSAID引發(fā)的不良胃腸反應(yīng)而住院者12萬(wàn)人/d5。NSAID大部分呈脂溶形式，極易吸收，可直接破壞黏膜屏障，造成細(xì)胞內(nèi)pH下降，滲透壓上升，細(xì)胞腫脹乃至死亡。與此同時(shí)，它還可抑制前列腺素的產(chǎn)生，使受損傷的胃腸黏膜不能及時(shí)修復(fù)，最終出現(xiàn)組織損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，消炎痛能引起明顯的小腸黏膜損傷，上皮表面呈現(xiàn)深淺不一的縱向潰瘍，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致6。中、高劑量組胃舒散能顯著降低腸黏膜的損傷指數(shù)，證實(shí)胃舒散對(duì)消炎痛引起的急性小腸損傷具有治療作用。氧自由基在阿斯匹林、乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷中的作用已得

17、到證實(shí)，然而，消炎痛致小腸損傷的研究國(guó)內(nèi)資料甚少。研究表明，在炎癥產(chǎn)生過(guò)程中，炎性細(xì)胞可通過(guò)“呼吸爆發(fā)”而產(chǎn)生大量氧自由基。MPO存在于吞噬細(xì)胞顆粒中，有弱的過(guò)氧化氫酶活性，可產(chǎn)生自由基7。組織中SOD則具有清除超氧陰離子自由基的能力，一旦自由基產(chǎn)生過(guò)多或組織抗氧化能力減退，細(xì)胞則易發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化損傷并伴隨其代謝產(chǎn)物 MDA增加，因此，MPO、SOD與MDA常被用作衡量組織氧化代謝的相關(guān)指標(biāo)3，8。在腸缺血_再灌注損傷過(guò)程中常引起SOD活性下降，MDA水平增高9。消炎痛可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞在微血管內(nèi)皮粘附，使局部血流減少，并引起血管收縮，而供血不足是產(chǎn)生自由基的主要原因之一10。我們觀察到模型對(duì)照

18、組小腸黏膜毛細(xì)血管充血、水腫及破裂，黏膜固有層有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，血管損傷明顯部位的組織病變較嚴(yán)重，并伴有MPO活性增加及MDA水平增高，說(shuō)明自由基參與了此病變的過(guò)程，與文獻(xiàn)報(bào)道一致710。高、中劑量胃舒散可降低MPO活性及MDA水平，阻遏小腸組織SOD水平的下降，說(shuō)明胃舒散具有清除自由基的功能。NO在胃腸黏膜損傷中的作用近年較受關(guān)注。在多種疾病發(fā)生、發(fā)展中呈現(xiàn)“雙刃”作用，即生理狀態(tài)下它可作為一種內(nèi)源性活性物質(zhì)發(fā)揮保護(hù)作用，如介導(dǎo)胃腸平滑肌的舒張，維持腸黏膜微循環(huán)屏障功能，降低微循環(huán)阻力，減輕血小板活化因子引起的腸損害，對(duì)WBC粘附和滲出起化學(xué)屏障作用，減少腸上皮通透性及促進(jìn)急性損傷后上皮

19、修復(fù)。病理情況下，NO作為一種重要的炎癥介質(zhì)，又具有細(xì)胞殺傷毒性與促炎作用11。一般認(rèn)為，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)主要分布于巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞中，生理狀態(tài)下并不表達(dá)，在內(nèi)毒素和某些細(xì)胞因子的刺激下它才進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，催化生成大量NO。NO可直接引起細(xì)胞毒作用或通過(guò)氧自由基氧化生成毒性更大的ONOO-，而后者作為一種強(qiáng)氧化劑具有強(qiáng)烈地抑制細(xì)胞線粒體氧化呼吸作用，導(dǎo)致能量代謝障礙而致細(xì)胞死亡12。Chen等13觀察到消炎痛可引起腸黏膜MPO增加及損傷加重，同時(shí)伴有誘導(dǎo)型iNOS表達(dá)增加。給予NG_硝基_L_精氨酸甲基酯(L_NAME)抑制內(nèi)源性NO合成則顯著減少M(fèi)PO活性并緩解小腸損傷。作者

20、認(rèn)為消炎痛引起腸黏膜損傷的機(jī)理與NO有關(guān)。研究還證實(shí)NO與超氧自由基O2均起損傷作用，而且具有相加的效果14。本文模型對(duì)照組MPO及NO水平增高，黏膜損傷加重，與上述作者的研究結(jié)果一致。胃舒散組NO水平雖有改變但與模型對(duì)照組比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在消炎痛引起的小腸損傷中，NO只起部分作用，胃舒散的治療作用與NO無(wú)明顯關(guān)系。由于我們檢測(cè)的是血液中而非組織中的NO含量，這種升高的NO究竟是產(chǎn)生保護(hù)作用還是起到損傷作用有待進(jìn)一步研究。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在防治胃腸損傷方面有重要價(jià)值，如大黃具有清熱、抗炎、通便的特性，常用于治療腸道疾患。李新宇等9在研究中發(fā)現(xiàn)大黃素可抑制iNOS基因表達(dá)，調(diào)節(jié) NO的釋放，防治大

21、鼠缺血再灌注所致的肺損傷并減輕腸損傷。文獻(xiàn)報(bào)道，具有健脾、活血功能的中藥，可改善微循環(huán)狀態(tài)15。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到，有效劑量的胃舒散組小腸病損輕，尤其是毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)較完整，細(xì)胞線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器腫脹、脫顆粒少見(jiàn)。據(jù)推測(cè)胃舒散具有細(xì)胞保護(hù)作用，其制劑中木香、大黃、石菖蒲、雞骨香、甘草等健脾理氣、活血解毒之成分，可能通過(guò)改善黏膜微循環(huán)狀態(tài)，增加局部組織供氧和改善能量代謝以及抗氧化作用而減少腸損傷。   【參考文獻(xiàn)】  1吳靈飛， 王炳周， 馮家琳， 等. 根除幽門(mén)螺桿菌對(duì)消化性潰瘍合并的胃炎及胃泌素的影響J. 臨床消化病雜志， 2004， 16(6): 250-252.

22、 2吳靈飛， 鄭宗茂， 李國(guó)平， 等. 胃舒散對(duì)功能性消化不良的療效與幽門(mén)螺桿菌的關(guān)系J. 世界華人消化雜志, 2002， 10(3): 275-278. 3Hammerman C， Goldschmidt D， Caplan MS，et al. Protective effect of bilirubin in ischemia_reperfusion injury in the rat intestineJ. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 2002,35(3): 344-349. 4吳靈飛， 鄧長(zhǎng)生. L_SOD對(duì)DDC誘發(fā)大鼠急性胃粘膜損傷的保護(hù)作用J. 中

23、國(guó)病理生理雜志,1994,10(3)： 302-305. 5Ettarh RR, Carr KE. Morphometric analysis of the small intestinal epithelium in the indomethacin_treated mouseJ.J Anat,1996, 189(Pt 1): 51-56. 6Ettarh RR, Carr KE. Structural and morphometric analysis of murine small intestine after indomethacin administrationJ. ScandJ

24、Gastroenterol,1993, 28(9): 795-802. 7Bertrand V, Guessous F, Le_Roy AL, et al. Copper_indomethacinate associated with zwitterionic phospholipids prevents enteropathy in rats: effect on inducible NO synthaseJ. Dig DisSci, 1999, 44(5): 991-999. 8Erdogan H， Fadillioglu E， Yagmurca M， et al.Protein oxid

25、ation and lipid peroxidation after renal ischemia_reperfusion injury: protective effects of erdosteine and N_acetylcysteineJ. Urol Res, 2006, 34(1): 41-46. 9李新宇， 景丙文， 陳德昌， 等. 大黃對(duì)大鼠腸缺血再灌注所致肺損傷過(guò)程中腫瘤壞死因子、 一氧化氮和磷脂酶的影響J. 中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué)， 1999， 11(2): 71-73. 10Karadi O, Abdel SOM, Bodis B, et al. Preventive effect of atropine on indomethacin_ind