肝癌細胞受照后代生長特性及放射敏感性變化

1、肝癌細胞受照后代生長特性及放射敏感性變化中華放射腫瘤學雜志 2000年第2期第9卷 論著作者：石衛(wèi)民陳龍華單位：廣州，第一軍醫(yī)大學南方醫(yī)院放射治療中心510515關鍵詞：HepG2細胞系；放射敏感性；p53【摘要】目的 探討肝癌細胞照射后存活后代生長特性及放射敏感性的變化。 方法人肝癌細胞株HepG2和其照射后存活后代體外培養(yǎng)，測定其群體倍增時間、放射敏感性和p53的表達水平。結果HepG2的群體倍增時間為（96.0±6.8）h,克隆形成率為（13.0±1.5）%，SF2為0.41±0.05。HepG2照射后存活后代群體倍增時間為（124.8 ±12.2

2、）h（t=3.572, P0.05），克隆形成率為（5.0±0.6）%（t=8.537, P0.01），SF2為0.65±0.08（t=3.811, P0.05），p53表達水平無差別（t=0.778, P0.05）。結論 肝癌細胞照射后存活后代生長延緩，放射敏感性降低，但與p53的表達無關。Radiosensitivity and growth characteristics of filial generation from irradiated hepatocarcinoma cellsSHI WeiminCHEN Longhua（Department of Radi

3、ation Oncology, Nanfang Hospital,First Military Medical University, Guangzhou 510515,China）【Abstract】ObjectiveTo investigate the change of radiosensitivity and growth features of the surviving progeny from the irradiated hepatocarcinoma cells. MethodsTo cultured human hepatocarcinoma cellsHepG2 and

4、the progeny of irradiated HepG2, plating efficiency(PE), population doubling time(PDT),radiosensitivity index SF2 and the expression level of p53 were measured. ResultsThe PDT of HepG2 was (96.0±6.8)hrs,PE (13.0±1.5)%，SF2 0.43±0.06.The PDT of the filial cells was (124.8 ±12.2)hrs

5、（t=3.572, P0.05），PE (5.0±0.6)%（t=8.537, P0.01），SF2 0.65±0.08（t=3.811, P0.05）. There was no statistical difference in the expression level of p53 between HepG2 and its progeny（t=0.778, P0.05）.Conclusions In the present study,growth delay and declined radiosensitivity are confirmed in the pr

6、ogeny of irradiated hepatocarcinoma cells while these changes are not correlated to the p53 expression.【Key words】HepG2 cell line;Radiosensitivity;p53肝癌細胞對放射線有相當?shù)拿舾行裕伟┓派渲委熀蟪埩舨≡?。放射治療后復發(fā)的肝癌細胞的放射敏感性目前并不清楚，本研究擬應用體外實驗方法初步評價肝癌細胞照射后存活后代放射敏感性的變化，旨在為臨床放射治療提供參考資料。1材料與方法1.1細胞培養(yǎng)：人肝癌細胞株HepG2為本院消化研究所保存。HepG2照射

7、后存活后代為HepG2經2Gy照射后存活細胞傳代15代的細胞。所有細胞在含10%小牛血清的RPMI 1640（GIBCO）培養(yǎng)基中，37，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.2細胞群體倍增時間（population doubling time,PDT）：指數(shù)生長期的細胞經質量濃度為2.5g/L胰蛋白酶消化成單細胞后，1×105個細胞接種于直徑6cm培養(yǎng)皿中，分別于培養(yǎng)48，72，96，120，144h時消化，計數(shù)。實驗重復3次，取均數(shù)，繪制細胞指數(shù)生長曲線，計算細胞群體倍增時間。1.3克隆形成實驗：處于指數(shù)生長期的細胞經質量濃度為2.5g/L 胰蛋白酶消化后，按照射劑量將102105個細胞

8、接種于直徑3cm培養(yǎng)皿中，分別給予010Gy單劑量照射，培養(yǎng)1214 d后終止培養(yǎng)，甲醇固定，Giemsa染色，鏡下計數(shù)超過50個細胞的克隆，計算細胞存活分數(shù)（SF）。每個劑量點設3個平行樣品，實驗重復3次，取均數(shù)。以線性二次方程S=e?-(D+D2)及多靶單擊模型S=1-(1-e-KD)N擬合細胞存活曲線，計算細胞敏感性參數(shù)，SF2，D0，N。1.4流式細胞儀檢測細胞p53蛋白表達水平：細胞p53蛋白的流式細胞儀檢測按Ribeiro的方法1。即：細胞生長至60%匯聚時用胰蛋白酶或EDTA消化，PBS漂洗后重懸于1mL預冷的PBS中，用體積份數(shù)為0.70甲醇固定。每份樣品5×105個

9、細胞與1g/mL一抗（鼠抗人p53蛋白，國產）在冰上共同孵育1h,PBS漂洗2次，與FITC標記的二抗（羊抗鼠IgG，國產）于冰上共同孵育30min, 最后PBS漂洗2次，流式細胞儀（Epics Elite，Couter Corporation,USA)檢測熒光強度，分析細胞抗原表達強度。1.5統(tǒng)計方法：用SPSS 8.0統(tǒng)計軟件，細胞指數(shù)生長及細胞存活曲線用平方回歸擬合，各組細胞參數(shù)用均數(shù)±標準差±s，兩組間比較用t檢驗。2結果2.1照射后存活后代的克隆形成率降低：HepG2的克隆形成率為（13.0±1.5）%，照射后存活后代的克隆形成率為（5.0±0

10、.6）%，t=8.537, P0.01。2.2照射后存活后代的細胞群體倍增時間延長：細胞生長曲線見圖1。HepG2的PDT為（96.0 ±6.8）h,照射后存活后代PDT為（124.8 ±12.2）h，t=3.572, P0.05。 圖1HepG2及受照后代細胞生長曲線2.3照射后存活后代的放射敏感性降低：細胞存活曲線見圖2。HepG2的為0.37Gy-1，D0為0.42 Gy，N為2.45， SF2為0.41±0.05。 照射后存活后代的為0.08Gy-1，D0為0.58 Gy，N為1.04，SF2為0.66±0.08，t=3.811, P0.05。2

11、.4照射后存活后代p53蛋白表達水平無變化：p53蛋白的流式細胞儀檢測結果見圖3。HepG2的p53陽性率為（37±11）%，照射后存活后代的p53陽性率為（45±14）%，t=0.778,P0.05。圖2HepG2及照后代細胞存活曲線 圖3HepG2及受照后代細胞p53蛋白表達的流式細胞儀檢測結果3討論目前已有大量研究表明，放射可以誘發(fā)細胞基因組的不穩(wěn)定性，其表現(xiàn)形式多樣，并且可以隨細胞分裂而傳遞下去，在其存活后代中出現(xiàn)延遲表達。但細胞基因組的不穩(wěn)定性是否會導致其存活后代的放射敏感性的變化呢？Crompton等2用6Gy的X射線照射C3H鼠纖維母細胞，分析其存活后代的DN

12、A含量和放射敏感性，發(fā)現(xiàn)其存活后代的DNA出現(xiàn)較多的非整倍體，但其放射敏感性卻沒有變化。而Pelevina等3用HeLa和中國倉鼠細胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)細胞照射后存活后代放射敏感性增高。然而更多的學者認為細胞受射線或其他的DNA 損傷劑作用后，其后代會產生抗性，即“adaptive response”4，5。不同的實驗得到的結論不同，可能是由于各實驗用的射線劑量和放射敏感性的評價方法有所差異，也可能不同的細胞對射線的反應就存在如此的差異。本研究發(fā)現(xiàn)，HepG2細胞經2Gy照射后其后代生長特性改變，克隆形成率降低，生長延緩，并且放射敏感性降低。照射后存活細胞后代放射敏感性降低的機制尚不清楚，目前存

13、在兩種假設：一種認為同一細胞群存在著放射敏感性不同的亞群，照射選擇性地殺滅了敏感亞群，存活的后代是放射抗拒的亞群，因此放射敏感性降低；另一種認為細胞群受照射后存活后代細胞的亞結構（substructure）發(fā)生了變化，即射線誘導細胞產生了針對DNA損傷的更強的修復能力，因此面對再次射線作用時表現(xiàn)為抗性增加，敏感性下降6。本研究難以討論后一種假設，但實驗結果顯然支持和補充了“亞群說”。受照射的肝癌細胞后代克隆源性細胞減少，因而克隆形成率降低，倍增時間延長，指數(shù)生長期的細胞進入放射敏感的G2期的比例降低，因此放射敏感性下降。p53作為細胞周期調控的一個重要元件，已知它的表達與細胞的放射敏感性密切相

14、關。Chang等7研究表明細胞受照射后代p53的表達無變化，本研究結果與其相似。由于HepG2細胞具有野生型p538，其受照射后存活的后代盡管放射敏感性下降，但p53的表達水平與HepG2相同，說明照射后存活后代放射敏感性的變化與p53表達無關。參考文獻1，Ribeiro JCC, Barnetson AR, Fisher RJ,et al.Relationship between radiation response and p53 status in human bladder cancer cells.Int J Radiat Biol，1997,72:11-20.2，Crompton

15、NE， Emery GC， Shi Y，et al. Radiation-induced genetic instability: no association with changes in radiosensitivity or cell cycle checkpoints in C3H 10T1/2 mouse fibroblasts. Radiat Environ Biophys, 1998,36: 255-259.3，Pelevina II, Gotlib Via, Kudriashova OV,et al. Properties of progeny of irradiated c

16、ells.Tsitologiia, 1998, 40: 467-477.4，Joiner MC, Lambin P, Malaise EP,et al. Hypersensitivity to very-low single radiation doses: its relationship to the adaptive response and induced radioresistance. Mutat Res, 1996 ,358: 171-183.5，Venkat S, Chaubey RC, Chauhan PS. Radio-adaptive response in human lymphocytes in vitro. Indian J Exp Biol, 1996, 34: 909-912.6，Wouters BG, Skarsgard LD. Low-dose radiation sensitivity and induced radioresistance to cell killing in HT-29 cells is distinct from the "adaptive response" and can not be explained by a subpopulation of sensitive cells. Radiat