細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) 細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展總是依賴于技術(shù)和實(shí)驗(yàn)手段的進(jìn)步,所以學(xué)習(xí)細(xì)胞生物學(xué)的技術(shù)和方法至關(guān)重要。 實(shí)驗(yàn)一 普通顯微鏡及其使用（裝片觀察）一、 目的要求： 1、掌握顯微鏡的構(gòu)造、油浸系的原理、使用方法、保護(hù)要點(diǎn)。 2、參觀了解其他各類顯微鏡。 二、 材料：普通光學(xué)顯微鏡及其他顯微鏡、細(xì)菌標(biāo)本片、香柏油、二甲苯、擦鏡紙。 三、 方法和步驟： 1、 介紹普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造 機(jī)械部分：鏡座、鏡臂、鏡筒、 轉(zhuǎn)換器、載物臺(tái)、調(diào)焦螺旋。 光學(xué)部分：接目鏡、物鏡、反光鏡、聚光器。 2、 油鏡的原理及使用方法 原理：油鏡頭的晶片細(xì)小，進(jìn)入鏡中的光線亦少，光線經(jīng)聚光器，通過(guò)載玻片進(jìn)油鏡時(shí)，由于空氣介

2、質(zhì)和玻璃介質(zhì)的折射率不一樣，光線因折射而損失，使視野更暗。在載玻片和油鏡之間加上和玻璃折光系數(shù)相同的香柏油，光線直接進(jìn)入鏡頭，不發(fā)生折射，視野明亮，便于觀察。3、 如何維護(hù)顯微鏡：機(jī)械部分的維護(hù)，光學(xué)部分的維護(hù)。 4、 注意事項(xiàng)： （1）觀察油鏡載片時(shí)，先在載片上有菌影的地方滴1-2滴香柏油，然后放載物臺(tái)中央，眼側(cè)面看，慢慢降低油鏡浸入香柏油中，鏡頭幾乎接觸標(biāo)本。再用左眼在接目鏡觀察，同時(shí)慢慢旋動(dòng)粗螺旋提起鏡筒至能模糊看到物象時(shí)，再轉(zhuǎn)動(dòng)微調(diào)螺旋，直至看清晰為止。注意鏡頭離開(kāi)油，就不能看清，重新按剛才的步驟進(jìn)行。 （2）油鏡使用過(guò)后，立即用擦鏡紙擦拭鏡頭，如油漬已干，則可用香柏油粘二甲苯擦拭鏡頭

3、，再用干凈擦鏡紙擦去二甲苯。 5、 觀察幾種細(xì)菌標(biāo)本片。 6、 示教看相差顯微鏡和熒光顯微鏡。 四 、作業(yè)及思考題： 1、 油鏡的原理是什么？2、 光線強(qiáng)弱如何調(diào)節(jié)？與哪些部件有關(guān)？ 實(shí)驗(yàn)二、細(xì)胞膜的滲透性實(shí) 驗(yàn) 目 的 了解細(xì)胞膜的滲透性及各類物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的速度。 實(shí) 驗(yàn) 原 理 將紅細(xì)胞放入數(shù)種等滲溶液中，由于紅細(xì)胞對(duì)各種溶質(zhì)的透性不同，有的溶質(zhì)可以滲入，有的不能滲入，滲入的溶質(zhì)能夠提高紅細(xì)胞的滲透壓，所以促使水分進(jìn)入細(xì)胞，引起溶血，由于溶質(zhì)透入速度互不相同，因此溶血時(shí)間也不相同。 實(shí) 驗(yàn) 用 品 一、器材 50ml燒杯, 試管（110cm）, 10ml移液管, 試管架。 二、材料 羊血。

4、 三、試劑 0.17mol/L氯化鈉，0.17mol/L氯化胺，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸鈉，0.12mol/草酸胺，0.12mol/硫酸鈉，0.32mol/葡萄糖，0.32mol/甘油，0.32mol/乙醇，0.32mol/丙酮。 實(shí) 驗(yàn) 方 法 一、羊血細(xì)胞懸液取50ml小燒杯一個(gè)，加1份羊血和10份0.17mol/L氯化鈉，形成一種不透明的紅色液體，此即稀釋的羊血。二、低滲溶液取試管一支，加入10ml蒸餾水，再加入1ml稀釋羊血，注意觀察溶液顏色的變化，有不透明的紅色逐漸澄清，說(shuō)明紅細(xì)胞發(fā)生破裂造成100%紅細(xì)胞溶血，使光線比較容易透過(guò)溶液。三、羊紅細(xì)胞的滲透性1、

5、取試管一支，加入0.17mol/L氯化鈉10ml，再加入1ml稀釋羊血，輕輕搖動(dòng)，注意觀察溶液顏色有無(wú)變化？有無(wú)溶血現(xiàn)象？為什么？2、取試管一支，加入0.17mol/L氯化胺10ml，再加入1ml稀釋羊血，輕輕搖動(dòng)，注意觀察溶液顏色有無(wú)變化？有無(wú)溶血現(xiàn)象？為什么？3、分別在另外8種等滲溶液中進(jìn)行同樣實(shí)驗(yàn)。步驟同2。實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較和分析。實(shí)驗(yàn)三、線粒體和液泡系的超活染色與觀察 活體染色是能使生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織特異性著色但對(duì)活樣品又沒(méi)有毒害作用的一種活體染色方法，其目的是顯示生活細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，而不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以致引起細(xì)胞的死亡。活體染色技術(shù)

6、可用來(lái)研究生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。 通常把活體染色分為體內(nèi)活體染色與體外活體染色兩類。體外活體染色又稱超活染色，它是由活的動(dòng)、植物分離出部分細(xì)胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色?；铙w染料之所以能固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊的部分，主要是靠染料的“電化學(xué)”特性。堿性染料的膠粒表面帶陽(yáng)離子，酸性染料的膠粒表面帶有陰離子，而被染的部分本身也是具有陰離子或陽(yáng)離子，這樣，它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活體染色，理論上應(yīng)選擇那些對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性或毒性極小的染料，且使用時(shí)需要配成稀淡的溶液。一般說(shuō)來(lái)，最為適用的是堿性染料，這可能是因?yàn)樗?/p>

7、有溶解在類脂質(zhì)(如卵磷脂、膽固醇等)的特性，易于被細(xì)胞吸收。詹納斯綠B(Janus green B)和中性紅(neutral red)兩種堿性染料是活體染色劑中最重要的染料，對(duì)于線粒體和液泡系的染色分別具有專一性。 實(shí) 驗(yàn) 目 的1、觀察動(dòng)、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體、液泡系的形態(tài)、數(shù)量與分布； 2、學(xué)習(xí)一些細(xì)胞器的超活染色技術(shù)。實(shí) 驗(yàn) 原 理 線粒體是細(xì)胞內(nèi)一種重要細(xì)胞器，是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的場(chǎng)所。細(xì)胞的各項(xiàng)活動(dòng)所需要的能量，主要是通過(guò)線粒體呼吸作用來(lái)提供的?；铙w染色是應(yīng)用無(wú)毒或毒性較小的染色劑真實(shí)地顯示活細(xì)胞內(nèi)某些結(jié)構(gòu)而又很少影響細(xì)胞生命活動(dòng)的一種染色方法。詹納斯綠 B是線垃體的專一性活體染色劑。

8、線粒體中細(xì)胞色素氧化酶使染料保持氧化狀態(tài)(即有色狀態(tài))呈藍(lán)綠色，而在周圍的細(xì)胞質(zhì)中染料被還原，成為無(wú)色狀態(tài)。中性紅為弱堿性染料，對(duì)液泡系(即高爾基體)的染色有專一性，只將活細(xì)胞中的液泡系染成紅色，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)完全不著色，這可能是與液泡中某些蛋白質(zhì)有關(guān)。 實(shí) 驗(yàn) 用 品1、器材 顯微鏡、恒溫水浴鍋、解剖盤、剪刀、鑷子、雙面刀片、解剖盤載玻片、凹面載玻片、蓋玻片、表面皿、吸管、牙簽、吸水紙。 2、試劑（1）Ringer溶液： 氯化鈉 0.85g (變溫動(dòng)物用0.65g) 氯化鉀 0.25g 氯化鉀 0.25g 氯化鈣 0.03g 蒸餾水 100ml （2）10%、1/3000中性紅溶液： 稱取0

9、.5g中性紅溶于50ml Ringer液，稍加熱 (3040)使之很快溶解，用濾紙過(guò)濾，裝入棕色瓶于暗處保存，否則易氧化沉淀，失去染色能力。臨用前，取已配制的1%中性紅溶液1ml，加入29ml Ringer溶液混勻，裝入棕色瓶備用。（3） 1%、1/5000詹納斯綠B溶液 稱取50mg詹納斯綠B溶于5ml Ringer溶液中，稍加微熱(3040)，使之溶解，用濾紙過(guò)濾后，即為1%原液。取1%原液l ml加入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液裝入瓶中備用。最好現(xiàn)用現(xiàn)配，以保持它的充分氧化能力。 實(shí)驗(yàn)材料 人口腔上皮細(xì)胞，小麥種子或黃豆幼根根尖。實(shí) 驗(yàn) 方 法1、人口腔粘膜上皮細(xì)胞

10、線粒體的超活染色與觀察清潔載玻片放在37恒溫水浴鍋的金屬板上 滴2滴1/5000詹納斯綠B染液 用牙簽口腔頰粘膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞 刮下的粘液狀物放大載玻片的染液滴中 染色10l5min(注意不可使染液干燥，必要時(shí)可再加滴染液) 蓋上蓋玻片,顯微鏡下觀察 2、植物細(xì)胞液泡系的超活染色與觀察 取豆芽的根尖 用刀片縱切根尖 放入中性紅染液滴中，染色510min。 吸去染液，滴一滴Ringer液 蓋上蓋玻片進(jìn)行鏡檢(鑷子輕輕地下壓蓋玻片，使根尖壓扁，利于觀察) 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 在高倍鏡下，先觀察根尖部分的生長(zhǎng)點(diǎn)的細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形小泡，這是初生的幼小液泡。然后，

11、由生長(zhǎng)點(diǎn)向延長(zhǎng)區(qū)觀察，在一些已分化長(zhǎng)大的細(xì)胞內(nèi)，液泡的染色較淺，體積增大，數(shù)目變少。在成熟區(qū)細(xì)胞中，一般只有一個(gè)淡紅色的巨大液泡，占據(jù)細(xì)胞的絕大部分，將細(xì)胞核擠到細(xì)胞一側(cè)貼近細(xì)胞壁處。實(shí)驗(yàn)報(bào)告（1）. 繪口腔上皮細(xì)胞示線粒體的形態(tài)與分布 （2）. 繪蟾蜍胸骨劍突軟骨細(xì)胞示液泡系的形態(tài)與分布實(shí)驗(yàn)四、葉綠體的分離與熒光觀察實(shí) 驗(yàn) 目 的 1. 通過(guò)植物細(xì)胞葉綠體的分離, 了解細(xì)胞器分離的一般原理和方法。 2. 觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光, 并熟悉熒光顯微鏡的使用方法。 實(shí) 驗(yàn) 原 理 將組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進(jìn)行差速離心，是分離細(xì)胞器的常用方法。葉綠體的分離應(yīng)在等滲溶液(0.35mol/L

12、氯化鈉或0.4mol/L蔗糖溶液)中進(jìn)行, 以免滲透壓的改變使葉綠體到損傷。將勻漿液1000r/min的條件下離心2min, 以去除其中的組織殘?jiān)臀幢黄扑榈耐暾?xì)胞。然后，在3000r/min的條件下離心5min，即可獲得沉淀的葉綠體(混有部分細(xì)胞核)。分離過(guò)程最好在05的條件下進(jìn)行；如果在室溫下，要迅速分離和觀察。 利用熒光顯微鏡對(duì)可發(fā)熒光的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，將受到許多因素的影響，如溫度、光、淬滅劑等。因此在熒光觀察時(shí)應(yīng)抓緊時(shí)間, 有必要時(shí)立即拍照。另外，在制作熒光顯微標(biāo)本時(shí)最好使用無(wú)熒光載片、蓋片和無(wú)熒光油。 實(shí) 驗(yàn) 用 品 一、器材 1.主要設(shè)備: 普通離心機(jī)、組織搗碎機(jī)、粗天平、熒光顯

13、微鏡。 2.小型器材: 500ml燒杯2個(gè), 250ml量筒1個(gè), 滴管20支, 10ml刻度離心管20支, 試管架5個(gè)，紗布若干，無(wú)熒光載片和蓋片各4片。 二、材料 新鮮菠菜。 三、試劑 0.35mol/L氯化鈉溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。 實(shí) 驗(yàn) 方 法 一、葉綠體的分離與觀察 1. 選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦干后去除葉梗脈，稱30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，裝入組織搗碎機(jī)。 2. 利用組織搗碎機(jī)低速(5000r/min)勻槳35min。 3. 將勻漿用6層紗布過(guò)濾于500ml燒杯中。 4. 取濾液4ml在1000r/min下離心2mi

14、n。棄去沉淀。 5. 將上清液在3000r/min下離心5min。棄去上清液，沉淀即不葉綠體(混有部分細(xì)胞核)。 6. 將沉淀用0.35mol/LNaCl溶液懸浮、 7. 取葉綠體懸液一滴滴于載玻片上，加蓋玻片后即可在普通光鏡和熒光顯微鏡下觀察。 (1)在普通光鏡下觀察。 (2)在熒光顯微鏡下觀察葉綠體的直接熒光。 (3)在熒光顯微鏡下觀察葉綠體的間接熒光：取葉綠體懸液一滴滴在無(wú)熒光載片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙熒光染料, 加蓋片后即可在熒光顯微鏡下觀察。 二、菠菜葉手切片觀察 用剔須刀片將新鮮的嫩菠菜葉切削出一斜面置于載玻片上，滴加12滴0.35mol/L NaCl溶液，加蓋片后輕壓，置

15、顯微鏡下觀察。 (1)在普通光鏡下觀察。 (2)在熒光顯微鏡下觀察其直接熒光。 (3) 觀察間接熒光：向手切片上滴加12滴0.01%吖啶橙染液，染色1min，洗去余液, 加蓋片后可在熒光顯微鏡下觀察間接熒光。 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 一、葉綠體的分離和觀察 1. 普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。 2. 以O(shè)lympus熒光顯微鏡為例，在先用B(bule)激發(fā)濾片、B雙色鏡和O530(orange)陰斷濾片的條件下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光。 3. 加入吖啶橙染色后，葉綠體可發(fā)出桔紅色熒光，而其中混有的細(xì)胞核則發(fā)綠色熒光。 二、菠菜葉手切片觀察

16、1. 在普通光鏡下可以看到三種細(xì)胞 (1)表皮細(xì)胞: 為邊緣呈鋸齒形的鱗片狀細(xì)胞; (2)保衛(wèi)細(xì)胞: 為構(gòu)成氣孔的成對(duì)存在的腎形細(xì)胞；(3)葉肉細(xì)胞: 為排列成柵狀的長(zhǎng)形和橢圓形細(xì)胞。葉綠體呈綠色橄欖形，在高倍鏡下還可以看到綠色的基粒。 2. 在熒光顯微鏡下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光，但其熒光強(qiáng)度要比游離葉綠體弱, 氣孔發(fā)綠色熒光，兩保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的火紅色葉綠體則環(huán)繞氣孔排列成一圈。表皮細(xì)胞內(nèi)的葉綠體數(shù)量要比葉肉細(xì)胞少。 3. 用吖啶橙染色后，葉綠體則發(fā)出桔紅色熒光，細(xì)胞核可發(fā)出綠色熒光, 氣孔仍為綠色。 作 業(yè) 1. 在普通光學(xué)顯微鏡下，用目微尺和臺(tái)微尺測(cè)量一下葉綠體的長(zhǎng)軸和短軸，分別測(cè)量510個(gè)葉

17、綠體，求其平均值。 2. 在熒光顯微鏡下，觀察葉綠體的自發(fā)熒光時(shí)，更換濾鏡系統(tǒng)，葉綠體的顏色是否有變化？實(shí)驗(yàn)五、 植物染色體標(biāo)本制備與觀察實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)植物染色體標(biāo)本的制備技術(shù)，了解Feulgen反應(yīng)的基本原理,學(xué)習(xí)其操作方法和壓片法,初步掌握細(xì)胞分裂各期的主要特點(diǎn).核酸是生物最重要的組成成分,核酸分為兩大類,即脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA).它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的分布及化學(xué)性質(zhì)均有所不同.DNA主要分布在核的染色質(zhì)或有絲分裂過(guò)程中出現(xiàn)的染色體內(nèi).RNA分布在細(xì)胞質(zhì)和核仁內(nèi).但在染色質(zhì)及染色體中也含有少量的RNA,核仁中也有少量的DNA.在線粒體,葉綠體等細(xì)胞器內(nèi)除含有RNA外,也含有少量的

18、DNA.實(shí)驗(yàn)原理Feulgen反應(yīng)的原理是根據(jù)DNA經(jīng)弱酸(1mol/L)水解后,打開(kāi)料嘌呤和脫氧核糖連接的鍵,在脫氧核糖的一端形成有離的醛基.這些醛基就在原位與Schiff試劑結(jié)合,形成含醌基( )的化合物,醛基是一個(gè)發(fā)色團(tuán)所以具有顏色,因此凡有DNA的部位,就呈現(xiàn)紫紅色.實(shí)驗(yàn)材料大麥、黑麥或小麥種子實(shí)驗(yàn)內(nèi)容植物染色體標(biāo)本的制備及DNA的顯示法-Feulgen反應(yīng)壓片法細(xì)胞有絲分裂相的觀察實(shí)驗(yàn)步驟（一）植物染色體標(biāo)本的制備1、將植物種子放在潮濕的濾紙上，20°C發(fā)芽，待胚根長(zhǎng)至12cm時(shí)，切取0.5cm長(zhǎng)的根尖部分。2、預(yù)處理：將切下的根尖浸入0.1%秋水酰素液中，室溫下處理34小

19、時(shí)。3、固定、水解及染色：Camoy固定劑固定10-30分鐘 95%酒精10分鐘 70%酒精10分鐘 蒸餾水 (對(duì)照) 5%三氯醋酸 90oC 15分鐘 1mol/L HCl 蒸餾水 1mol/L HCl 60 oC 8分鐘 Schiff試劑40 -60分鐘 亞硫酸水(1,2,3) 換3次,每次5分鐘自來(lái)水 將染色后的根尖漂洗干凈,懸著染色效果好的材料 蒸餾水 壓片 鏡檢(二) 壓片法壓片的操作步驟如下,把根尖放在載片上,用刀片切取根尖(0.3cm),縱切根尖,加一滴水,用解剖針將根尖縱向分成若干小條,保留1-2小條,加蓋玻片,用鉛筆端輕輕敲擊蓋玻片,使細(xì)胞分離,壓平呈云霧狀.（三）蠶豆(或洋

20、蔥)根尖壓片的觀察首先在低倍鏡下,區(qū)分根尖的分生組織區(qū)及延長(zhǎng)組織區(qū)的細(xì)胞,然后,在高倍鏡下,觀察細(xì)胞核的形態(tài),注意在你的片子上,是否有有絲分裂細(xì)胞,如有,你能找到細(xì)胞分裂期的幾個(gè)階段,其特征如何 (可參照附錄)做Feulgen反應(yīng)時(shí),應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題固定劑的選擇:一般常選用Carnoy固定液.其他的固定劑如Flemming固定劑及Champy固定劑等均可用,但不能使用Bouin固定劑.水解時(shí)間:水解時(shí)間一定要合適,不宜過(guò)長(zhǎng)或不足,否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果.如用Carnoy固定液固定的材料,水解時(shí)間一般在8-15分鐘之間.水解時(shí)間的長(zhǎng)短要隨不同的材料及不同的固定劑而定.Schiff試劑的質(zhì)量:在做Fe

21、ulgen反應(yīng)時(shí),重要的因素就是Schiff試劑的質(zhì)量問(wèn)題.實(shí)驗(yàn)時(shí),要注意試劑顏色是否正常,有無(wú)SO2的氣味.洗滌劑的重要性:漂洗時(shí),所用的亞硫酸水,最好在每次實(shí)驗(yàn)前臨時(shí)配制,以便保持較濃的SO2.實(shí)驗(yàn)對(duì)照組:一定要做對(duì)照片,以便說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性.操作過(guò)程中,用鑷子鑷取根尖的生長(zhǎng)區(qū)部位,切勿夾取根冠部位.鴉片過(guò)程中盡量使根尖分生組織細(xì)胞保持原來(lái)的分布狀態(tài).習(xí)題簡(jiǎn)述Feulgen反應(yīng)的原理欲得到一張好的Feulgen反應(yīng)制片,制片過(guò)程中應(yīng)注意些什么 繪制細(xì)胞分裂圖。實(shí)驗(yàn)六 植物原生質(zhì)體的制備實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)植物原生質(zhì)體的分離制備技術(shù)，觀察原生質(zhì)體的形態(tài)。2.學(xué)習(xí)植物原生質(zhì)體的融合技術(shù)，觀察不

22、同方法融合細(xì)胞的形態(tài)及變化。實(shí)驗(yàn)用品顯微鏡，擦鏡紙，剪子，鑷子，小平皿，吸管四支，直式漏斗，300目尼龍網(wǎng)，10ml離心管，載片，蓋片。實(shí)驗(yàn)原理原生質(zhì)體（protoplast）這個(gè)術(shù)語(yǔ)最早是由Hanstein在1880年提出來(lái)的。確切地說(shuō)，食用菌原生質(zhì)體是指細(xì)胞壁完全消除后余下的那部分包裹的裸露的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。植物的花瓣細(xì)胞在經(jīng)過(guò)纖維素酶，離折酶處理后，纖維素和果膠成分遭到破壞，造成原生質(zhì)體脫離細(xì)胞壁進(jìn)入培養(yǎng)液中。植物花瓣細(xì)胞中的大液泡中存在有大量色素，且不同的細(xì)胞色素不同，因此可以在不對(duì)細(xì)胞染色的情況下，通過(guò)顏色范圍辨認(rèn)不同細(xì)胞的原生質(zhì)體，以及同種間細(xì)胞融合和異種間細(xì)胞融合情況。PEG是一種高分

23、子化合物，由于含有醚鍵而具有負(fù)極性，與水，蛋白質(zhì)和碳水化合物等一些正極化基團(tuán)形成氫鍵。當(dāng)PEG分子足夠長(zhǎng)時(shí)，可作為鄰近原生質(zhì)體表面之間的分子橋而使之粘連。PEG也能連接Ca2+等陽(yáng)離子。Ca2+可在一些負(fù)極化基團(tuán)和PEG之間形成橋，因而促進(jìn)粘連，在洗滌過(guò)程中，連接在原生質(zhì)體膜上的PEG分子可被洗脫，這將引起電荷的紊亂和再分布，從而引起原生質(zhì)體融合，高Ca2+高pH清洗則增加了質(zhì)膜的流動(dòng)性，因而大大提高了融合頻率，洗滌時(shí)的滲透沖擊對(duì)融合也可能起作用。實(shí)驗(yàn)試劑1.洗滌液：甘露醇 0.6 MCaCl2?2H2O 8 mM NaH2PO4?H2O 2 Mm實(shí)驗(yàn)步驟1.酶液的制備 把纖維素酶（EAS86

24、7）溶于0.50.7摩爾/升甘露醇內(nèi)，加10毫摩/升氯化鈣溶液作穩(wěn)定劑。酶溶解后，經(jīng)4000轉(zhuǎn)/分離心機(jī)沉降原生質(zhì)體，20分鐘后，取上清液。經(jīng)針筒型過(guò)濾器，再經(jīng)0.45微米微孔濾膜過(guò)濾后，在無(wú)菌箱內(nèi)把酶液分裝在三角燒瓶?jī)?nèi)，貯存在冰箱里備用。 2.材料準(zhǔn)備 把生長(zhǎng)在溫室，苗齡60天以上的煙草植株，取上中部全展葉，在日光下照射2小時(shí)，使它萎蔫。也可以用溫室生長(zhǎng)的蠶豆葉作同樣處理，或用大田收獲的胡蘿卜，放在0以上低溫備用。萎蔫后的葉片浸在3%的漂白精片溶液中1520分鐘，再用無(wú)菌水沖洗干凈，用無(wú)菌吸水紙吸干表面水分。 3.酶解 用尖頭鑷子撕去葉片下表皮，剪成小塊。胡蘿卜則用刀片削去表皮和中柱，取用皮層部，切成小塊。以上材料1克，放入盛有10毫升酶溶液的培養(yǎng)皿里，加蓋