表達(dá)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的人多發(fā)性骨髓瘤小鼠模型的建立

1、表達(dá)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的人多發(fā)性骨髓瘤小鼠模型的建立         08-03-01 15:34:00     編輯：studa20                   作者：王雅丹，胡豫，張璐，黃靖，孫春艷【摘要】  過去的研究證實腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）在體外具有促進(jìn)多發(fā)性骨髓

2、瘤（MM）細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)MM血管新生的能力。本研究探討B(tài)DNF/TrkB途徑是否為治療MM的潛在靶點，并比較兩種途徑建立人MM NOD/SCID小鼠模型的優(yōu)缺點，為深入探索治療MM的新靶點奠定基礎(chǔ)。選擇糖尿病抵抗/重癥聯(lián)合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠，通過皮下注射或尾靜脈注射人骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226建立兩種異體移植動物模型。觀察荷瘤后小鼠的生長狀態(tài)，測量皮下瘤塊的體積；荷瘤后3周，每周經(jīng)眼眶后靜脈叢采血，檢測血清中人源輕鏈含量、Ca2+濃度和血漿中人源BDNF濃度，并計數(shù)紅細(xì)胞；小鼠死后，采用組織學(xué)方法觀察瘤細(xì)胞的形態(tài)特征，流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血和骨髓中人源性CD38細(xì)胞比例，采用

3、計算機(jī)X線數(shù)字?jǐn)z影觀察小鼠全身骨密度的改變和骨質(zhì)破壞情況。結(jié)果表明：皮下注射模型的成瘤率高（5/5），具有多種與漿細(xì)胞瘤相似的病理學(xué)特征，但其骨髓中未檢測到MM細(xì)胞，血清中鈣離子濃度不高，M蛋白濃度升高不明顯且未發(fā)現(xiàn)溶骨性損害的組織學(xué)和影像學(xué)證據(jù)。尾靜脈注射模型成瘤率相對較低（4/7），骨髓中可檢測到呈浸潤生長的人CD38細(xì)胞；而且在荷瘤3周后，血清中即可檢測到人源M蛋白；隨著腫瘤的生長，M蛋白水平、鈣離子濃度逐漸升高，并有溶骨性損害的影像學(xué)證據(jù)。兩種模型血漿中人源BDNF的水平亦逐漸升高，9周時濃度分別為（73±11）pg/ml和（105±18）pg/ml。結(jié)論：本研究成

4、功建立了兩種高表達(dá)BDNF的MM荷瘤NOD/SCID小鼠模型，兩種模型相互結(jié)合應(yīng)用，為探索MM治療的新靶點BDNF/TrkB提供了合適的動物模型。 【關(guān)鍵詞】  多發(fā)性骨髓瘤     Establishment of Multiple Myeloma Mouse Models Expressing Brain Derived Neurotrophic Factor        Abstract    Previous studies have

5、demonstrated the effects of brainderived neurotrophic factor (BDNF) on promoting proliferation of multiple myeloma (MM) cells and inducing angiogenesis in MM in vitro. This study was aimed to  further explore whether BDNF/TrkB pathway is a potential therapeutic target in MM, and to elucidate

6、60; the   advantages and disadvantages  of  two ways   developed  for  human myeloma xenograft in animal models.   The models of xenograft tumors were established in the nonobese diabetic /severe combined immunodeficiency (NOD/SCID) mice by subcutane

7、ous  or intravenous  injection of human myeloma cell line RPMI8226. Mice were monitored daily for life state,  and the volume of subcutaneous tumors were measured after inoculation. 3 weeks after inoculation, red  blood cell counts, BDNF level in plasma, human light chain &#

8、160; and calcium level in serum of NOD/SCID were detected every two weeks. The histological and cytological examinations were performed to observe pathological  features of tumors. Using flow cytometry to observe the expression of human CD38+ cell in murine blood and bone marrow. The changes of

9、 bone density and skeletal lesions were detected by computer radiography.  The  results showed that the subcutaneously injected animal model showed a  high  growth efficiency of RPMI8226 subcutaneous tumors (5/5) and  several pathological features of plasmacytomas. There wer

10、e neither  obvious increase in light chain  and  calcium levels, nor spread of human MM cells to murine bone marrow and no radiological evidence of skeletal lesions. The intravenously injected animal model had relative   low efficiency for growth of tumors (4/7) but MM cells

11、 could engraft  and proliferate in murine bone marrow. The human light chain could be  detected in serum as early as 3 weeks after inoculation. Myelomabearing mice had high level of light chain and  high calcium   in serum and resorption of the murine bone.  Furthermore

12、, the concentrations of BDNF were increased with the tumor growth in both models with （73±11）pg/ml and（105±18）pg/ml in plasma respectively at  9 weeks   after inoculation.  It is concluded that   two appropriate MM xenograft NOD/SCID animal models were establi

13、shed, both of which show high BDNF levels in the plasma. Therefore,  two valuable in vivo systems to explore novel therapeutic target (BDNF/TrkB)  in MM  have been set up successfully.    Key words    multiple myeloma; animal model; brain derived neurotro

14、phic factor    J Exp Hematol 2007; 15(5):967-972    表達(dá)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的人多發(fā)性骨髓瘤小鼠模型的建立    我們的研究已經(jīng)證實，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）與其高親合力的受體TrkB結(jié)合后，具有誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤（MM）血管新生的能力并可以在體外誘導(dǎo)MM細(xì)胞增殖、遷移1-5。為了進(jìn)一步探索BDNF/TrkB途徑是否為治療MM的潛在靶點、拮抗BDNF/TrkB能否阻礙疾病的發(fā)展，需要建立一種合適的MM動物模型。雖然我們已經(jīng)建立了一種基質(zhì)膠MM細(xì)胞裸鼠模

15、型，但在荷瘤前需給予裸鼠射線照射以便抑制B細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞的免疫活性, 并且缺少對該腫瘤組織學(xué)特征的描述。    糖尿病抵抗/重癥聯(lián)合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠是免疫缺陷小鼠品系中殘留免疫較少的品系之一，它缺乏功能性的T/B細(xì)胞和循環(huán)補(bǔ)體，并且NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞功能也存在缺陷6，因此常被作為許多正常和惡性人源細(xì)胞的移植載體，包括MM細(xì)胞株和MM原代細(xì)胞7,8。國內(nèi)有關(guān)MM動物模型的報道較少，多為皮下種植模型9。國外學(xué)者雖然應(yīng)用NOD/SCID小鼠建立的MM模型較為成熟，但并未涉及BDNF的表達(dá)。    在本研究中，我們

16、將高表達(dá)BDNF的人MM細(xì)胞株RPMI8226通過兩種途徑種植于NOD/SCID小鼠以建立MM動物模型，比較兩種模型的優(yōu)缺點，并檢測其體內(nèi)BDNF的表達(dá)情況，為深入探索BDNF/TrkB途徑在MM中的作用奠定基礎(chǔ)。    材料和方法    試劑    兔抗人BDNF抗體和兔抗人CD38抗體購于Santa Cruz 生物技術(shù)公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG和FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG為Pierce公司產(chǎn)品。FITC標(biāo)記的小鼠抗人CD38或PerCP標(biāo)記的小鼠抗人CD45單克隆抗體為Becton Dic

17、kinson公司產(chǎn)品。淋巴細(xì)胞分離液、RPMI 1640培養(yǎng)液購于Gibco公司。BDNF ELISA試劑盒購于R&D公司。    細(xì)胞培養(yǎng)    人類MM細(xì)胞系RPMI 8226細(xì)胞購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，置于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37、5CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取經(jīng)臺盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞存活率大于95 %并處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。    NOD /SCID小鼠的飼養(yǎng)    4-6周齡NOD /SCID雄性小鼠20只，

18、購自上海斯萊克實驗動物研究所，飼養(yǎng)于SPF級實驗室中。飼料經(jīng)60Co照射，飲用水及墊料均經(jīng)高壓消毒無菌處理。對小鼠的所有操作均在無菌層流條件下進(jìn)行。    模型的建立    取6-8周齡NOD /SCID 鼠，接受300 cGy 射線照射(放射源60Co 劑量率172 cGy)，照射后24小時內(nèi)將3×107個RPMI 8226細(xì)胞懸于200 l PBS溶液中，并經(jīng)過尾靜脈注射途徑輸注于NOD /SCID小鼠體內(nèi)（7只），以同體積的PBS溶液作陰性對照（4只）；或不經(jīng)過照射，左后肢皮下注射2×107個RPMI8226細(xì)胞（5只），同部位注射PBS溶液作陰性對照（4只）。每日監(jiān)測小鼠的體重、皮毛、活動情況、有無麻痹癱瘓癥狀和感染跡象等。經(jīng)皮下注射的小鼠還需測量皮下瘤塊的體積（ab2/6，a為長徑，b為短徑）。待小鼠自然死亡，生存時間以種植瘤細(xì)胞當(dāng)天至死亡時的天數(shù)計算。    血液學(xué)指標(biāo)的測定    荷瘤3周后，每周經(jīng)眼眶后靜脈叢采血350 l ，單周時不加抗凝劑，4 000 r/min離心5分鐘，取血清于 -20儲存?zhèn)溆茫捎帽葷岱z測血清中人源輕鏈的含