血清酸性α-醋酸萘酯酶的比色測(cè)定及初步臨床應(yīng)用

1、血 清 酸 性 -醋 酸 萘 酯 酶 的 比 色 測(cè) 定 及 初 步 臨 床 應(yīng) 用 馮春來(lái) 1 黃興富 2 范 華 21(聊城市東昌府區(qū)防疫站 2(東昌府人民醫(yī)院 【摘要】 目的 建立比色測(cè)定血清酸性 -醋酸萘酯酶總活性的方法。方法 用 -醋酸萘酯為底物 , 在 37、 pH 6. 2的 酸性環(huán)境中經(jīng)酶水解產(chǎn)生 -萘酚 , 然后與重氮試劑固藍(lán) B 偶聯(lián)反應(yīng)顯色測(cè)定 。結(jié)果 最適 pH 6. 06. 4, 底物濃度為 2mmol/ L , 吸收峰波長(zhǎng)為 520nm , 線性范圍 02500U/L , 酶促反應(yīng)時(shí)間為 20min , 顯色反應(yīng)時(shí)間為 20min , 顯色穩(wěn)定時(shí)間為 20min ,

2、 批內(nèi) 、 批間變異系數(shù)分別為 2. 67%和 5. 1%。血紅蛋白 1g/L和膽紅素 172u mol/L無(wú)干擾。枸櫞酸鈉 、 草酸鹽 、 肝素 、 E DT A -K 2常用 濃度無(wú)抑制 , 氟化鈉可抑制該酶活性。標(biāo)本 28 冰箱保存 7d 結(jié)果無(wú)變化。正常參考值 (n=100 為 (1645±378. 5 U/L (x-1. 96s 。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便實(shí)用 , 適于各級(jí)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展 , 可作為評(píng)價(jià)肝細(xì)胞變性壞死、 肝纖維化、 肝臟合成功能異常的一項(xiàng)新的 血清學(xué)指標(biāo)?！娟P(guān)鍵詞】 酸性醋酸萘酯酶 ; 分光光度法 ; 肝病Mea sur ement of acid a lpha na

3、pht hyl acetate estera se in ser um by color imetr ic a ssa y a nd it s prel imina ry clinical a pplicat ion Fen g Chun lai , H uang X ing fu , Fan Hua (Dongchang epidemic prevention station , Liaoch eng , 252000【 Abstra ct 】 Objective T o es tab lish a col orimetric assay for d etecting acid alpha

4、naphthy l acetate es terase in seru m. Methods When pH w as 6. 2and temperature was 37 -naphthyl acetate was , hydrolyzed by acid alpha n aphthy l acetate esterase and it produ ced -naphthyl. T hen colorimetric ass ay was performed w ith fas t B salt diazotizati on reacti on. Results T he optimum pH

5、 was 6. 0-6.4and subs trate concentra 2 tion w as 2mmol/L. Abs orben t w av elength w as at 520nm. Linear ran ge for enzyme determination w as from 0to 2500U/L. T ime for enzymatic reaction w as 20minutes. T ime for produ ction o f color reacti on w as 20minu tes. T ime for color stabilization was 2

6、0minutes. Intra -assay C V value was 5. 1%and inter -assay CV value was 2. 67%. W hen H b concentrati on ros e up to lg/L and bilirub in to 172mol/L ,en zy matic ac 2 tivity w as not interfered. When s od ium citrate ,sodium oxalate ,heparin and EDT A -K 2was common concentration ,en zy matic activ

7、ity was n ot in terfered ,bu t N aF interfered for en zy matic activ ity. T he results d id n ot changed in seven days when sera were st ored at 2-8 in refrig erator. T he mean value in 100h ealthy subjects w as 1645±378. 5U/L(x -1. 96s . Conclusions T he meth od w as simple and usefu1. It fit

8、int o every laboratory. It sh ou ld be a new indicat or for evaluation of hepatic function.【 K ey w or ds 】 A cid alpha naph thy l acetate esterase ; C olorimetric analysis; H epatic dis ease 酸性 -醋酸萘酯酶 (aci d alpha naphthyl acetate esterase ,AN AE EC 3. 1. 1. 1 , 是一種細(xì)胞溶 酶體酶 , 主要作用于短鏈脂肪酸和芳香脂類(lèi)使其發(fā)生水解 。

9、 由于該酶水解專(zhuān)一性不強(qiáng) , 故又稱(chēng)酸性非特異性酯 酶 1-2。 AN AE 主要分布于肝 、 胰 、 腎 、 小腸 、 單核巨 噬細(xì)胞及組織細(xì)胞內(nèi) 3, 過(guò)去主要用于白血病組織 化學(xué)的 鑒 別 診斷 和 淋 巴 細(xì) 胞 的 分 類(lèi)等 2。血 清 A NAE 主要來(lái)源于肝臟內(nèi) B 酯酶 1。 血清 A N AE 總 活性定量測(cè)定的方法尚未見(jiàn)報(bào)道 , 我們?cè)谘芯垦?A NAE 同工 酶 4的基 礎(chǔ)上 , 參考 G omori S 組化 方 法 3, 建立了定量比色測(cè)定的方法并初步應(yīng)用于臨 床 , 取得了滿(mǎn)意的結(jié)果 。 現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。 研究對(duì)象和方法 研究對(duì)象 正常對(duì)照為本院體檢健康者

10、, 年齡 1870歲 , 男 50例 , 女 50例。各型肝炎及肝炎后肝 硬 化患者 96例 , 其中急 性肝炎 20例 , 慢 性肝炎 40例 , 肝硬化病人 36例 , 診斷按 1995年全國(guó)會(huì)議肝炎 診斷標(biāo)準(zhǔn) 。1. 2 試劑和儀器1. 2. 1 試劑 A 底物液 :2m mol/L -醋 酸萘 酯 , 稱(chēng) 取 20mg -醋酸萘酯 (化學(xué)純 用 1m l 丙酮溶解后加 0. 1mol/LpH 6. 2磷酸鹽緩沖液 49ml , 用力振搖助溶 , 4 避光保存可用 1周 。 B 終止液 :1.75m ol/L 醋酸 。 C 顯色液 :1mmol/L 固藍(lán) B 鹽 , 稱(chēng)取 50mg 固藍(lán)

11、 B (分 析純 加 0. 8%吐溫 20100ml ,4 避光保 存可用 2周。 D 標(biāo)準(zhǔn)液 L 萘酚 , 稱(chēng)取 萘 酚 (分析純 加無(wú)水乙醇 5溶解后水補(bǔ)足至 , 避光保存。1 1. 1:2mmol /-28. 8mg -0. ml 100 m l 41. 2. 2 原理 -醋酸萘酯為底物 , 在 37 pH 6. 2的 酸性環(huán)境中經(jīng)酶水解產(chǎn)生-萘酚 , 然后與 重氮試 劑固藍(lán) B 在 pH 3. 0左右的酸性環(huán)境中偶聯(lián)反應(yīng) , 形 成紅色偶氮化合物 , 色澤深淺與酶活性成正比 。 1. 2. 3 操作步驟取 3支試管標(biāo)上測(cè)定管、 標(biāo)準(zhǔn)管和 空白管 , 分別加血清 10、 標(biāo)準(zhǔn)液 100、

12、 蒸餾水 10, 然后 加 0. 5m l 底物液 37 水浴 20min , 取出加終止液 1ml 和顯色液 1ml 混 勻 , 置 37 水浴 20min , 冷卻后 7230分光光 度計(jì)比色 , 波長(zhǎng) 520nm , 光徑 0. 5cm , 以 空白管調(diào)零 , 讀取測(cè)定管和標(biāo)準(zhǔn)管吸 光度 (A 。計(jì) 算 :測(cè)定管 A ÷標(biāo)準(zhǔn)管 A ×0. 2×1000÷0. 01÷20=血清酸性 -醋酸萘酯酶 (U/L 單位定義 :每升血清在 37 酶反應(yīng) 1min 產(chǎn)生 1mol -萘酚為 1個(gè)酶活 性單位 (U/L 。2 結(jié) 果2. 1 實(shí)驗(yàn)條件的選

13、擇 2. 1. 1 最適 pH 的選擇用 0. 1m ol/L 的磷酸鹽配成 pH 5. 4至 6. 8緩沖液 , 同時(shí)與 1份血標(biāo)本作用 , 結(jié)果 pH 6. 06. 4時(shí)酶活性最高 , 因此選用 pH 6. 2磷酸 鹽緩沖液。2. 1. 2 底物濃度的選 擇將-醋酸萘酯 配成 1-6mm ol/L 濃度 , 分別對(duì)高 、 中 、 低濃度的 3份標(biāo)本 同 時(shí)測(cè)定 , 反應(yīng)曲線見(jiàn)圖 1, 當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?2mm ol/L 時(shí)反應(yīng)曲線趨于平坦 , 說(shuō)明當(dāng)?shù)孜餄舛葹?2mm ol/L 時(shí)酶促反應(yīng)速度已達(dá)到最大 , 因此最終底物濃度選 擇 2mm ol/L 。2. 1. 3吸收峰 用標(biāo)準(zhǔn)品和樣 品最

14、終顯色 物在 723O 分光光度計(jì)上從 420660nm 每隔 2nm 進(jìn)行 1次測(cè)定 , 最后繪制吸收曲線 , 結(jié)果在 520nm 處有吸收 峰 。圖 1 不同底物濃度與不同濃度標(biāo)本的反應(yīng)曲線2. 1. 4 最適樣品用 量 用 5、 10、 20樣 品同時(shí)測(cè)定 ,10l 樣品量時(shí) 1560U/L 的樣品 A 值在 0. 4左右 ,因此選擇樣品用量為 10l 。當(dāng) A 大于 0. 6時(shí)標(biāo)本進(jìn) 行稀釋測(cè)定 。2. 1. 5 反應(yīng)時(shí)間的選擇 (1 酶促反應(yīng)時(shí)間 , 采用 U L 、 5U L 、 O U L 高 、 中 、 低 3個(gè)不同濃度的樣本同 時(shí)作 用 5、 、 5、 、 5、 3、 6,

15、結(jié)果 高 、 中 、 低 3種不同濃度的標(biāo)本在 內(nèi)反應(yīng)呈直線 ,2025min 后反應(yīng)呈曲線 ,25min 后 A 變化不大(見(jiàn)圖 2 , 選擇酶促反應(yīng)時(shí)間為 20min 。 (2重氮偶 聯(lián)顯色反應(yīng)時(shí)間 , 采用樣本和標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)分別進(jìn)行 5、 10、 15、 20、 25、 30min 偶聯(lián)顯色 , 結(jié)果 20m in 時(shí)顯色反 應(yīng)雖尚未平衡 , 但 上升已較慢 , 因此顯 色時(shí)間定為 20min 。圖 2 酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線2. 1. 6 顯色后的室溫放置時(shí)間 由于偶氮化合物對(duì)光較敏感 , 隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)顯色會(huì)漸漸加深 , 因 此 對(duì) 樣本 和標(biāo) 準(zhǔn) 顯色 后放 置 時(shí)間 進(jìn) 行 了每 隔

16、5min 觀察吸光度 , 結(jié)果在室溫放置 20min 內(nèi) A 值相 對(duì)增加小于 5%, 在 放置 30min 時(shí) 結(jié)果相對(duì)增加近 10%, 因此顯色后的比色時(shí)間宜控制在 20min 之內(nèi) 。 2. 1. 7終止劑濃度和顯色劑中吐溫 -20濃度的 選擇將濃醋酸稀釋成 0. 875、 1. 75、 3. 50、 5. 25m ol /L 濃度進(jìn)行觀察 , 結(jié)果 1. 75m ol/L (pH 3 時(shí)已能完全 中止酶促反應(yīng)并且顯色后色澤最鮮艷 。 將顯色劑中 吐溫分別配成 0. 2%、 0. 4%、 0. 6%、 0. 8%、 1%的濃 度進(jìn)行觀察 , 結(jié)果 0. 8%時(shí)可使 A 值控制在最佳比 色

17、范圍 0. 20. 6之間 , 并且顯色后穩(wěn)定時(shí)間能控制 達(dá) 20min 。如不加吐溫立即呈色則 A 值大于 0. 6, 而 且無(wú)法控制顯色終點(diǎn)。2. 1. 8 底物和顯色劑的穩(wěn)定性配好的新鮮底物放 28 保存 , 然后每天取出恢復(fù)至室溫后進(jìn)行測(cè)定 , 測(cè)完后再置冰箱 , 如此反復(fù)發(fā)現(xiàn)第 9d 時(shí)空白管 A 值 大于 0. 1。 因此底物的穩(wěn)定性在 28 時(shí)為 1周 。 同樣顯色劑在 14d 內(nèi)穩(wěn)定 。2. 1. 9反應(yīng)線性將標(biāo)準(zhǔn)品配成 04000U/L 進(jìn)行 測(cè)定 , 結(jié)果 02500U/L 內(nèi)反應(yīng)呈直線 , 直線方程為 Y=0. 0127+0. 0017,r =0. 9998。 當(dāng)血清中含

18、量大于 2500U/L 時(shí)應(yīng)稀釋后測(cè)定 。2. 1. 10靈敏度 和精密度 靈敏度為 2U/ml , 高 、中、 低濃度的 3份 標(biāo)本分別進(jìn)行批內(nèi) 批間 20次測(cè) 定 , 批內(nèi)平均 CV 為 2. 67%; 批間平均 C V 為 5. 1%。 2. 1. 11干擾試驗(yàn) 血清中血紅蛋白濃度達(dá) 1g/L 、 血清總膽紅素達(dá) 172m ol/L 、 肝素 、 草 酸鹽、 EDT A -K 2、 枸 櫞酸 鈉 的 常 用濃 度 對(duì) 結(jié) 果 均 無(wú) 影 響 ; 15L 的氟化鈉可抑制 %左右的酶活性 ; 標(biāo)本 在 保存 酶活性無(wú)明顯變化 。 參考值 (= (65±35 L (x ±2

19、048/148/124/10120200min 20m i n mmol/90287d 2. 2n 1001478. u/1.96s , 性別間結(jié)果無(wú)差異 。2. 3 初步臨床應(yīng)用 20例急性肝炎患者結(jié)果 為 (1385±198 U/L ;40例慢性肝炎患者為 (1325±175 U/L ;36例肝炎后肝硬化患者為 (790±229 U/L 。經(jīng) 方差分析和 g 檢驗(yàn) , 肝病病人結(jié)果都明顯低于正常 人 (P <0. 01 ; 肝硬化組明顯低于肝炎組和正常人 (P <0. 01 ; 急慢性肝炎組間無(wú) 顯著差異 (P >0. 05 。 各病組組內(nèi)陽(yáng)

20、性率分別為急性肝炎 30%(6/20 、 慢 性肝炎 37. 5%(15/40 、 肝硬化 88. 9%(32/36 , 經(jīng) x2檢驗(yàn) , 肝硬化組陽(yáng)性率明顯高 于急、 慢性肝炎 組 (P <0. 01 , 急、 慢性肝炎組間陽(yáng)性率無(wú)明顯差異 (P > 0. 05 。3 討 論3. 1 非 特異 性酯 酶根 據(jù)其 作用 的 pH 環(huán)境分為酸 性 、 中性 、 堿性 3種 , 主要用于細(xì)胞組化研究 , 它們作 用的底物都是 -醋酸萘酯 。 本實(shí)驗(yàn)是主要針對(duì)酸 性非特異性酯酶建立的測(cè)定方法 , 組化中重氮偶聯(lián) 反應(yīng)形成的化合物為褐色并為顆粒型沉淀 , 為了使 終產(chǎn)物顯色后易比色 , 我

21、們根據(jù)重氮偶聯(lián)反應(yīng)在酸 性環(huán)境中偶聯(lián)速度降低 , 穩(wěn)定性增加的原理 5對(duì)顯 色環(huán)境進(jìn)行了改變 , 用 1. 75m ol/L 的醋酸使顯 色環(huán) 境維持在 pH 3左右 , 這樣最終產(chǎn)物的色澤較鮮艷且 無(wú)沉淀 , 有利于比色 , 另外醋酸又可起到終止酶促反 應(yīng)的作用 。 顯色液中 吐溫的作用 是使顯色反 應(yīng)延 緩 , 延長(zhǎng)顯色穩(wěn)定時(shí)間 , 便于比色分析 。3. 2 本法的試劑保存時(shí)間短 , 顯色后穩(wěn)定時(shí)間不夠 長(zhǎng) , 這主要是因?yàn)榇姿彷刘ヒ姿?, 固藍(lán) B 以及顯 色后偶 氮鹽對(duì)光敏 感 , 導(dǎo)致 穩(wěn)定性差 。 故 應(yīng)注意 : (1試劑需保持新鮮 , 保存不超過(guò) 1周 ; (2顯色后最 好在

22、20m in 內(nèi)完成比色 ; (3 標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)較穩(wěn)定 , 可繪 制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 , 不必每次帶標(biāo)準(zhǔn) 。3. 3 初步臨床應(yīng)用顯示 , 當(dāng)肝細(xì)胞變性 、 壞死和纖 維化后 , 血清中 A NAE 的活性明顯低于正常人 , 且肝 硬化病人的結(jié)果又明顯低于急 、 慢性肝炎病人 。 提 示血清中該酶的活性降低與肝損壞程度呈正相關(guān) 。 因此 , 我們認(rèn)為血清 AN AE 測(cè)定可作為評(píng)價(jià)肝細(xì)胞 損傷 、 肝纖維化以及肝臟合成功能異常的一項(xiàng)新的 血清學(xué)指標(biāo)。參 考 文 獻(xiàn)1小川和郎 . 酶組織細(xì)胞 化學(xué)技術(shù) M.鐘慈 聲主譯 . 上 海 :上海 醫(yī) 科大學(xué)出版社 ,1989. 77-82.2王鳳計(jì) . 血液細(xì)

23、胞 學(xué) M.第 2版 . 天津 :天津科 技出 版社 ,199o. 123-125.3龔志錦 , 詹洲 . 病理組織 制片和染色 技術(shù) M.上海 :上 ?？萍?出 版社 ,1994. 321-323.4黃志華 , 周玉貴 , 劉 昌元 . 血清-醋酸萘酯酶同工 酶瓊脂糖凝膠 電泳及臨床應(yīng)用 J.臨床檢驗(yàn)雜志 , 1998,16(3 :155-157.5華東紡織工學(xué)院 . 染料化學(xué) M.北京 :紡織工 業(yè)版社 ,1960. 113-114.(上接 59頁(yè) 理論 上溶血 標(biāo) 本對(duì) H BV DN A 的檢 測(cè)有 影響 。 有研究表明 , 血紅素可通過(guò)其卟啉環(huán)與 Taq 酶的不 可逆 結(jié) 合 而 抑 制 Taq 酶 活 性 , 從而 影 響 PCR 測(cè) 定 2-3。 本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí) , 同一乙肝大三陽(yáng)志愿者 的溶血血清和未溶血血清的 H BV DN A 含量差 異無(wú) 顯著性 (P >0. 05 , 因此認(rèn) 為溶血 血清對(duì) H BV DN A 定量測(cè)定不存在干擾作用 。 一方面可能是由于標(biāo)本 中血紅蛋白 (Hb 經(jīng) 100 煮沸 10分鐘后已經(jīng) 變