臨床輸血檢測操作規(guī)程

1、文件類型：作業(yè)指導書 文件編號：JCXRMYY -JY-015-2009文件名稱：臨床輸血檢測操作規(guī)程 第01版第0次修改 第1頁共12頁 ABO 血型鑒定 1、測定原理 根據(jù)紅細胞上有或無 A 抗原或和 B 抗原，將血型分為 A 型、B 型、AB 型及O 型4種?？衫眉t細胞凝集試驗，通過正、反定型準確鑒定ABO血型。所謂正定型，是用已知抗A 和抗B 分型血清來測定紅細胞上有無相應的 A 抗原或和B抗原；所謂反定型，是用已知A細胞和B細胞來測定血清中有無相應的抗A或和抗B。 2、標本種類及收集要求 2.1 受檢者血清； 2.2 枸緣酸鈉抗凝血或未稍取血，受檢者血液制成5 紅細胞鹽水懸液使用，

2、制備方法見本節(jié)附注。 2.3 標本出現(xiàn)中度溶血者，為不合格標本，不能用于檢測。 3、儀器、試劑、校準品、質(zhì)控品、培養(yǎng)基、以及其他所需物品 抗A、抗B血型定型試劑（單克隆抗體）：河北醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程中心，產(chǎn)品注冊號：國藥準字S10950017，包裝:抗A、抗B各1支/盒，塑料瓶，規(guī)格：10ml/支，儲存要求：28避光保存，主要成分：分泌抗人 A 型和抗人 B 型血型原單抗的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液并補加一定量小鼠腹水抗體。0.9/%的生理鹽水：江西科倫醫(yī)藥有限公司。離心機，顯微鏡。 4、操作步驟 4.1、試管法 取潔凈小試管(內(nèi)徑10mm×60mm)3支，分別標明抗A、抗B和抗A十 B

3、，用滴管分別加抗A、抗B 和抗A 十 B 分型血清各 l 滴（約 50 ul）于試管底部，再以滴管分別加入受檢者5紅細胞鹽水懸液1滴，混和。 另取潔凈小試管(內(nèi)徑 10mm×60mm)3 支，分別標明 A、B 和 O 細胞。用滴管分別加入受檢者血清 l 滴于試管底部，再分別以滴管加入 A、B和O型5 33試劑紅細胞懸 液l滴，混和。 立即以1000rmin離心 3 min。 將試管輕輕搖動，使沉于管底的紅細胞浮起，先以內(nèi)眼觀察有無凝集(或溶血)現(xiàn)象。如內(nèi)眼不見凝集，應將反應物倒于玻片上，再以低倍鏡檢查。 觀察結(jié)果時既要看有無凝集，更要注意凝集強度，此有助于A、B亞型、類B或cisAB

4、的發(fā)現(xiàn)。 -編制人/修改人：校核人： 審核人： 批準人：批準日期： 年 月 日 實施日期： 年 月 日文件類型：作業(yè)指導書 文件編號：JCXRMYY -JY-015-2009文件名稱：臨床輸血檢測操作規(guī)程 第01版第0次修改 第2頁共12頁 凝集強度判斷標準 4+ 紅細胞凝集成一大塊，血清清晰透明。 3+ 紅細胞凝集成數(shù)小塊，血清尚清晰。 2+ 紅細胞凝塊分散成許多小塊，見到游離紅細胞。 1+ 肉眼可見大顆粒，周圍有較多游離紅細胞。 ± 鏡下可見數(shù)個紅細胞凝集在一起，周圍有很多游離紅細胞。 MF 混合凝集外觀(mixed field)是指鏡下可見少數(shù)紅細胞凝集，而極大多數(shù)紅細胞仍呈分

5、散分布。 - 表示陰性，鏡下未見凝集，紅細胞均勻分布。 4.2 玻片法 取清潔玻片 1 張(或白瓷板 1 塊)，用蠟筆劃成方格，標明抗-A、抗-B和抗-A十B，分別用滴管滴加抗-A、抗-B和抗-A十B分型血清 l滴于標明的方格內(nèi)，再各加受檢者2紅細胞懸液1滴，混和。 另取潔凈玻片一張(或白瓷板1塊)，用蠟筆劃成方格，標明A細胞、B細胞和 O 細胞，用滴管各加受檢者血清 1 滴，再分別用滴管滴加 A、B和O型試劑紅細胞懸液1滴。 將玻片(或白瓷板)不斷輕輕轉(zhuǎn)動，使血清與細胞充分混勻，連續(xù)約 15 min，先以肉眼觀察有無凝集(或溶血)反應；再在低倍鏡下觀察結(jié)果。 5、結(jié)果判定 ABO 血型正反定

6、型結(jié)果 分型血清+受檢者紅細胞 受檢者血型 受檢者血清+試劑紅細胞 抗-A 抗-B 抗-A 十 B A 細胞 B 細胞 O 細胞 + - + A - + - - + + B + - - - - - O + + - + + + AB - - - 注：+為凝集；-為不凝集。 -編制人/修改人：校核人： 審核人： 批準人：批準日期： 年 月 日 實施日期： 年 月 日文件類型：作業(yè)指導書 文件編號：JCXRMYY -JY-015-2009文件名稱：臨床輸血檢測操作規(guī)程 第01版第0次修改 第3頁共12頁 6、注意事項： 346.1 分型血清必須為批批檢試劑，且在有效期內(nèi)使用；質(zhì)量性能符合要求。試劑開

7、封后必須貼上開封日期、開封人標簽，用畢后應放置冰箱保存，以免細菌污染。試劑開封后有效期為一周。 6.2 試劑紅細胞以 3 個健康者同型新鮮紅細胞混和，用生理鹽水洗滌 1 次，以除卻存在于血清中的抗體及可溶性抗原?；蚴褂煤细竦纳唐吩\斷紅細胞。試劑紅細胞有效期：自制的為 15 天，商品的為試劑有效期。試劑開封后必須貼上開封日期、開封人標簽，用畢后應放置冰箱保存，以免細菌污染。試劑開封后有效期為一周。 6.3 生理鹽水啟用后，有效期為二周。 6.4 所有試劑在開封或使用時，必須檢查是否有變質(zhì)；凡可疑者，必須更換新的試劑進行檢測工作。 6.5 試管、滴管和玻片必須清潔干燥，防止溶血。 6.6 操作方法

8、應按規(guī)定，一般應先加血清，然后再加紅細胞懸液，以便容易核實是否漏加血清。 6.7 按理 IgM 抗-A 和抗-B 與相應紅細胞的反應溫度以 4為最強，但為了防止冷凝集現(xiàn)象的干擾，一般仍在室溫(2024)內(nèi)進行試驗，37可使反應減弱。 6.8 離心時間不宜過長或過短，速度不宜過快或過慢，以防假陽性或假陰性結(jié)果。 6.9 觀察時應注意紅細胞呈特異性凝集、繼發(fā)性凝固以及緡錢狀排列的區(qū)別。 6.10 判斷結(jié)果后應仔細核對、記錄，避免筆誤。 6.11 對于可能存在不完全抗原的時候，應在各反應方加入凝聚胺試劑，以檢驗不完全抗原的存在。 6.12 對于可疑結(jié)果，必須更換所用的試劑，重新檢測。 6.13 5%

9、紅細胞懸液的配制：用生理鹽水洗滌紅細胞3次。 根據(jù)下表進行紅細胞懸液的配制 懸液濃度（%） 壓積紅細胞（滴） 鹽水（滴） 2 1 2ml(40) 5 1 0.8ml(16)-編制人/修改人：校核人： 審核人： 批準人：批準日期： 年 月 日 實施日期： 年 月 日文件類型：作業(yè)指導書 文件編號：JCXRMYY -JY-015-2009文件名稱：臨床輸血檢測操作規(guī)程 第01版第0次修改 第4頁共12頁 7、操作性能概要 7.1正反定型結(jié)果不一致的原因： 原因： 有技術(shù)性問題或紅細胞和血清本身的問題，常見者有以下幾種： .1 分型血清效價太低、親和力不強。如抗A血清效價不高，可將A亞型誤定為O型，

10、AB型誤定為B型。 357.1.1.2 紅細胞懸液過濃或過淡，抗原抗體比例不適當，使反應不明顯，誤判為陰性反應。 .3 受檢者紅細胞上抗原位點過少(如亞型)或抗原性減弱(見于白血病或惡性腫瘤：以及類B或cisAB等。 .4 受檢者血清中蛋白紊亂(高球蛋白血癥)，或?qū)嶒灂r溫度過高，常引起紅細胞呈緡錢狀排列。 .5 受檢者血清中缺乏應有的抗-A 及或抗B 抗體，如丙種球蛋白缺乏癥。 .6 各種原因引起的紅細胞溶解，誤判為不凝集。部分溶血時，可溶性血型物質(zhì)中和了相應的抗體. .7 由細菌污染或遺傳因素引起多凝集或全凝集往往是正反定型不符的原因。 .8 血清中有意外抗體，如自身抗I，常引起干擾。 .9

11、 老年人血清中抗體水平大幅度下降正反定型結(jié)果不一致的解決辦法如發(fā)現(xiàn)ABO正反定型結(jié)果不一致，先要重復作試驗1次。嚴格執(zhí)行操作規(guī)程，使用質(zhì)量合格的試劑以及細心觀察和解釋試驗結(jié)果，就可解決明顯的問題，對一些疑難問題月必須進一步研究。 檢查步驟： .1 另從受檢者采取 l 份新鮮血液標本這樣可以糾正因污染或搞錯樣本造成的不符合。 .2 將紅細胞洗滌數(shù)次，配成5生理鹽水細胞懸液，用抗A、抗B、抗Al，抗A十B及抗H做試驗可以得到其它有用的信息。 .3 對受檢紅細胞作直接抗球蛋白試驗，如結(jié)果呈陽性，表示紅細胞已被抗體致敏。 .4 用 A1、A2、B、O 紅細胞及自身紅細胞檢查受檢血清。如果懷疑是抗I，用

12、O型(或ABO相合的)臍血紅細胞檢查。 -編制人/修改人：校核人： 審核人： 批準人：批準日期： 年 月 日 實施日期： 年 月 日文件類型：作業(yè)指導書 文件編號：JCXRMYY -JY-015-2009文件名稱：臨床輸血檢測操作規(guī)程 第01版第0次修改 第5頁共12頁 .5 如果試驗結(jié)果未見凝集，應將細胞及血清試驗至少在室溫和4放置30min，用顯微鏡檢查核實。 .6 如疑為 A 抗原或 B 抗原減弱，則可將受檢紅細胞與抗A 或抗B 血清作吸收及放散試驗以及受檢者唾液作 A、B、H 血型物質(zhì)測定。后者只對 80HAB分泌型的人有用。 .7 如試驗結(jié)果紅細胞呈絹錢狀排列，加等滲鹽水l滴，混和，

13、往往可使絹錢現(xiàn)象消失。應注意不應先加鹽水 l 滴于受檢者血清中而后和紅細胞作試驗，以免使血清中抗體被稀釋。 .8 如受檢者為A型血而疑為有類B抗原時，可用下列方法進行鑒別： .8.1 觀察細胞與抗A及抗B的凝集強度，與抗A的反應要比與抗 36B的反應強。這種區(qū)別用玻片法作試驗更為明顯。 .8.2 用受檢者紅細胞與自身血清作試驗，血清中的抗B不凝集自身紅細胞上的類B抗原。 .8.3 檢查唾液中是否有A、B物質(zhì)，如果是分泌型，可檢出A物質(zhì)而無B物質(zhì)。 .8.4 核對患者的診斷，類B抗原的形成與結(jié)腸癌、直腸癌、革蘭陰性桿菌感染有關。 .9 如發(fā)現(xiàn)多凝集現(xiàn)象，應考慮由遺傳產(chǎn)生的Cad抗原活性；被細菌酶

14、激活的T或TK受體；或產(chǎn)生機制不太明了的Tn受體所引起。多凝集紅細胞具有以下特點： .9.1 能被人和許多家兔的血清凝集。 .9.2 能與大多數(shù)成年人的血清凝集，不管有無相應的同種抗體。 .9.3 不被臍帶血清凝集。 .9.4 通常不與自身的血清凝集。 8、臨床意義 用于檢驗人的ABO血型歸屬。 9、參考文獻 全國臨床檢驗操作規(guī)程（第3版） -編制人/修改人：校核人： 審核人： 批準人：批準日期： 年 月 日 實施日期： 年 月 日文件類型：作業(yè)指導書 文件編號：JCXRMYY -JY-015-2009文件名稱：臨床輸血檢測操作規(guī)程 第01版第0次修改 第6頁共12頁 Rh（D）血型鑒定 1、

15、實驗原理 紅細胞與抗D抗體發(fā)生凝集反應表明該細胞有D抗原，反之，無凝集現(xiàn)象表明試驗的紅細胞缺少正常強度的D抗原。 2、標本收集和制備 無菌操作收集血液標本,收集后盡可能立即進行實驗。如果不能立即實驗,應將樣品貯存于 2-8C。收集在 ACD、CPD、CPD2A 液中的血液標本,不超過 21天仍可進行實驗，但是加EDTA、肝素和凝集的血液標本，實驗應在2天內(nèi)進行。 3、儀器、試劑、校準品、質(zhì)控品、培養(yǎng)基、以及其他所需物品： Rh(IgM)血型定型試劑（單克隆抗體）：上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司，產(chǎn)品注冊號：國藥準字 S20060018,包裝、規(guī)格：每盒內(nèi)裝有 1 支試劑，10ml/支，儲存要求：

16、存放28，有效期內(nèi)使用。 4、操作步驟 4.1 玻片法： 干凈玻片上加1滴抗D。 再加入1滴40%-50%的被檢紅細胞懸液。該紅細胞懸液可以是鹽水懸液， 37也可以是懸浮于自身血漿或血清中的紅細胞。 在圓形的玻片區(qū)域中混勻，前后緩慢搖晃玻片。2分鐘左右肉眼判讀結(jié)果。不要將試劑的干燥與凝集相混淆。 如果是陰性，需要試管法重做一遍實驗。 4.2 鹽水試管法 加一滴抗D試劑于預先標記好的試管中 再加1滴約3%5%紅細胞生理鹽水懸液于試管中?；靹颉?離心，速度和時間可選擇以下二種之一： 轉(zhuǎn)速1000rpm，時間一分鐘1分鐘或3400rpm，時間15秒。 檢查是否溶血（溶血可能是陽性結(jié)果，或者是細菌污染

17、），然后輕輕搖晃，是細胞再懸浮起來。 觀察凝集狀況，并立即記錄結(jié)果。必要時可借助顯微鏡。 若是陰性結(jié)果，需在37孵育15分鐘-30分鐘，然后再離心觀察結(jié)果。結(jié)果若呈陰性需進一步確認是否是弱D。 -編制人/修改人：校核人： 審核人： 批準人：批準日期： 年 月 日 實施日期： 年 月 日文件類型：作業(yè)指導書 文件編號：JCXRMYY -JY-015-2009文件名稱：臨床輸血檢測操作規(guī)程 第01版第0次修改 第7頁共12頁 4.3 微量板法（U型板） 加一滴抗D試劑于U型底的微孔中。 再在微孔中一滴約 3-5%的被檢紅細胞懸液，細胞懸液需事先制備于生理鹽水中。 用機械的方法將U型板混勻。 用板式

18、離心機離心：2000rpm,時間 30 秒。不同的離心機，不同的微量板所需要的離心條件有所區(qū)別，正確實驗的結(jié)果需要適當?shù)碾x心，使反應板產(chǎn)生清晰的細胞扣及透亮的上清液。 檢測溶血情況（溶血可能是陽性結(jié)果，或者是細菌污染）。 結(jié)果判斷：用機械震蕩U型板，再懸浮細胞，根據(jù)懸浮情況來判斷凝集。陽性反應，出現(xiàn)紅細胞凝集，而陰性反應在微孔中會出現(xiàn)均勻細胞懸液。 可用肉眼和自動化判讀結(jié)果。 如果呈陰性，需要試管法重做一遍實驗。 5、參考值范圍 陽性反應：出現(xiàn)紅細胞凝集，為RhD陽性。 陰性反應：紅細胞不出現(xiàn)凝集，為RhD陰性。 6、產(chǎn)品性能指標 抗D（IgM）效價大于等于1：64（ccDeeO型） 7、 方

19、法的局限性 VI本實驗不能凝集CategoryD 細胞，對于陰性和弱陽性結(jié)果，按有關安全輸血規(guī)范進行確認實驗，必要時送血型參比實驗室進行確認。 8、注意事項 388.1 試劑含有0.1%W/V疊氮鈉，如果攝入會中毒。 8.2 試劑如出現(xiàn)混濁則不能使用，若開瓶使用時間較長后，最好用已知RhD陰性、RhD 陽性紅細胞檢查結(jié)果是否符合，以防制品污染、變質(zhì)失效，而造成錯誤。及時貼上開封時間標簽，在效期內(nèi)使用。 8.3 由于人紅細胞的D抗原往往表現(xiàn)較弱，故必要時進行顯微鏡鏡檢，以免錯判結(jié)果，特別是陰性結(jié)果時。 8.4 Rh血型鑒定應嚴格控制溫度與時間，因Rh抗原、抗體集反應凝塊比較脆弱，觀察反應結(jié)果時，

20、應輕輕側(cè)動試管，不可用力振搖。 8.5 對于結(jié)果可疑的，必須洗滌紅細胞后重新檢驗。-編制人/修改人：校核人： 審核人： 批準人：批準日期： 年 月 日 實施日期： 年 月 日文件類型：作業(yè)指導書 文件編號：JCXRMYY -JY-015-2009文件名稱：臨床輸血檢測操作規(guī)程 第01版第0次修改 第8頁共12頁 9、 操作性能概要 9.1 假陽性反應原因分析： 試劑中存在具有其他特異性的抗體（指不完全抗 D 抗體），因此，對疑難抗原定型時，建議用不同來源的抗血清同時做兩份實驗。因為使用兩份特異性相同的抗血清得到不一致的結(jié)果時，就會使檢驗人員意識到有進一步實驗的必要。 多凝集紅細胞與任何人血清會

21、發(fā)生凝集。 當用未經(jīng)洗滌的細胞做實驗時，試樣中的自身凝集和異常蛋白質(zhì)可能引起假陽性結(jié)果。 9.14 試劑瓶可能被細菌、外來物質(zhì)或其他抗血清所污染。 9.2 假陰性反應原因分析： 搞錯抗血清 每次試驗時應細心核對抗血清瓶子上的標簽。 試管中漏假抗血清 在加入細胞懸液之前，必須檢查試管中有無抗血清。 某種特定的抗血清不能和其他相應抗原的變異型起反應。 如某種抗血清含有主要對抗 Rh 復合抗原的抗體，則可能與獨立的基因產(chǎn)物的個別抗原不發(fā)生反應。這在抗C血清最為常見，因為很多抗C血清含有反應性更強的抗Ce成分。 未遵照抗血清使用說明書做試驗，如抗血清和細胞的比例以及溫育的溫度和時間不正確。 抗血清保存

22、不妥，試劑中的免疫球蛋白變質(zhì)。 10、參考文獻： 全國臨床檢驗操作規(guī)程（第3版） -編制人/修改人：校核人： 審核人： 批準人：批準日期： 年 月 日 實施日期： 年 月 日文件類型：作業(yè)指導書 文件編號：JCXRMYY -JY-015-2009文件名稱：臨床輸血檢測操作規(guī)程 第01版第0次修改 第9頁共12頁 抗體篩選和鑒定試驗 1、 原理 紅細胞血型抗體分子的物理特性與血清學的反應性之間有著直接的關系。可 39分為IgM和IgG球蛋白抗體 IgM 為天然抗體，在鹽水介質(zhì)中能直接相應的紅細胞，使之發(fā)生肉眼可見的凝集反應。 IgG為免疫抗體，常經(jīng)妊娠或輸血等免疫產(chǎn)生。在鹽水介質(zhì)中不能凝集而只能

23、致敏抗原的紅細胞，且必須通過特定的方法使致敏紅細胞發(fā)生凝集。如牛血清白蛋白、酶、抗球蛋白、凝聚胺、凝膠（或玻璃）等方法。 2、 方法 待檢血清需要使用多種方法進行鑒定。一般使用鹽水法、酶方法、抗球蛋白法、凝聚胺法或凝膠法檢測抗體。在檢測到弱抗體時，可以利用適當增加血清的細胞比例、適當增加孵育時間、加入低離子強度溶液增效劑或 PEG 聚氧乙烯乙二醇等方法增加反應的敏感性。不同的抗體在不同的方法和條件下可以有不同的表現(xiàn)。這些特性為判定抗體特異性提供了參考信息。 3、 試劑 3.1、 紅細胞：選取三個以上的O型紅細胞組成一組篩選細胞（已知抗原）。 3.2、譜細胞：選取八個以上的O型紅細胞組成一組譜細

24、胞（已知抗原）。 4、 操作 4.1、 不規(guī)則抗體的篩選：用篩選細胞（1、2、3號），同患者血清在三種介質(zhì)中（鹽水、凝聚胺、看球蛋白）反應，需做自身細胞對照。 4.2、 不規(guī)則抗體的鑒定：對篩選陽性的患者應檢查其抗體的特異性。用一組譜細胞（1-11）同患者血清在三種介質(zhì)中（鹽水、凝聚胺、抗球蛋白），進行抗體的篩選，需做自身細胞對照。 5、 結(jié)果判斷 陽性反應：出現(xiàn)紅細胞凝集。表示紅細胞上有相應抗體存在。 陰性反應：出現(xiàn)紅細胞不凝集。表示紅細胞上沒有相應抗體存在。 結(jié)合譜細胞反應格局，確定抗體特異性。-編制人/修改人：校核人： 審核人： 批準人：批準日期： 年 月 日 實施日期： 年 月 日文件

25、類型：作業(yè)指導書 文件編號：JCXRMYY -JY-015-2009文件名稱：臨床輸血檢測操作規(guī)程 第01版第0次修改 第10頁共12頁 6、 臨床意義 6.1、 定血型； 6.2、 測效價 6.3、 可能幾率：正確的抗體鑒定，必須有充分的譜細胞支持。 7、 標本要求 7.1、按照一般的血液樣本采集步驟采集血液標本。該標本可于4或0以下冷凍保存三周或數(shù)年。一般不需特殊處理。 7.2、 應用EDTA抗凝標本，可反應體內(nèi)紅細胞被補體致敏的真實情況。抗凝標本也用于直接抗球蛋白試驗，并可提供洗脫技術(shù)所需的紅細胞來源。 7.3、 需要一管新鮮收集的凝固的血液標本用作血清研究。若懷疑冷抗體引起的直接抗球蛋

26、白試驗陽性，其血液標本凝固應保持在 37，直到血清 40被分離出來為之。 8、 注意事項 8.1、 僅用于體外診斷 8.2、 試劑貯藏溫度2-8； 8.3、 試劑有效期兩個月。 -編制人/修改人：校核人： 審核人： 批準人：批準日期： 年 月 日 實施日期： 年 月 日文件類型：作業(yè)指導書 文件編號：JCXRMYY -JY-015-2009文件名稱：臨床輸血檢測操作規(guī)程 第01版第0次修改 第11頁共12頁 改良低離子聚凝胺法促進劑實驗操作規(guī)程 1、目的：減少交叉配血試驗的假陽性。 2、適用范圍：交叉配血、血型鑒定、抗體篩檢血型血清學試驗。 3、試劑來源：中山市生科試劑儀器有限公司 4、采集與

27、處理： 4.1 脈采血3-4ml，并觀察是否溶血、乳糜血，如有此現(xiàn)象應再留標本并做記錄。 4.2 檢查留樣試管、標簽、標號、姓名、血型是否齊全，如有遺漏應拒收。 04.3 將血標本試管放37C水浴中10分鐘，離心。 5、標準操作： 5.1 主（次）管加入受（供）血者血清 2 滴，加供（受）血者 4%紅細胞鹽水懸液1滴。 5.2 各管加 LIM0.8ml，混勻，靜置 1 分鐘，各管加 Promoter1 滴，混勻，3000轉(zhuǎn)/分離心 15 秒，倒出上清液（殘留約 0.1ml），扣搖，肉眼可見明顯的凝集狀（如無凝集須重做），加假凝集清除液 1 滴與管底，輕搖，凝集 1 分鐘內(nèi)消失呈均勻混懸液，為陰性，凝集1分鐘內(nèi)不能被消除，即為陽性。 5、 結(jié)論： 陽性表示受（供）血者血清中含供（受）者紅細胞血型 Ag 相應的 Ab（IgG、IgM），供受血者不相容，陰性表示供受血者相容-編制人/修改人：校核人： 審核人： 批準人：批準日期：