化學發(fā)光分析法測定黑米色素抗氧化作用

1、化學發(fā)光分析法測定黑米色素抗氧化作用龍盛京(廣西醫(yī)科大學化學教研室,南寧530021摘要:運用化學發(fā)光分析法研究了黑米色素抗活性氧能力大小,測定了黑米色素對全血化學發(fā)光的抑制和清除O-2、OH、H2O2的作用。結果表明,黑米色素對全血化學發(fā)光有較大的抑制作用,即對由細胞體系產(chǎn)生的活性氧有較大的消除作用;對非細胞體系產(chǎn)生的活性氧化也有一定的消除能力。關鍵詞:化學發(fā)光分析;黑米;色素;抗氧化作用;活性氧機體在生理過程或應激過程可產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O-2、過氧化氫(H2O2和羥基自由基(OH等活性氧物質,而過量產(chǎn)生的活性氧則可造成組織細胞損傷,引起細胞死亡或細胞凋亡1。經(jīng)過多年研究已經(jīng)證明自由基

2、與一百多種人類疾病有關。本實驗用化學發(fā)光分析方法來評價黑米色素抗活性氧的能力,旨為黑米的科學應用提供實驗依據(jù)。1試劑、儀器、樣品及色素的提取緩沖溶液為無酚紅的pH7.4的H ank s平衡鹽溶液(HB SS。酵母多糖(sigm a產(chǎn)品稱取30m g酵母多糖懸于3mL生理鹽水中,水浴煮沸30m in后離心,棄去上清液,沉淀再懸于HB SS緩沖溶液中,終質量濃度為5g L,4保存。魯米諾(M erck2Schuch rat產(chǎn)品稱819m g 魯米諾,加入0120mL二甲基亞砜溶解后,加pH7.4的H ank s應用液50mL,電磁攪拌5h。終濃度為1mm o l L,冰箱保存。D G3030發(fā)光光

3、度計(南京華東電子管廠。黑米(紫香米由廣東省農(nóng)科院提供。黑米色素的提取:400g黑米加入70%乙醇1200mL,室溫浸泡,24h后過濾。濾渣加70%乙醇再浸泡24h,過濾。合并二次濾液,減壓濃縮,得黑米粗色素提取物。黑米粗色素提取物硅膠柱層析,先用氯仿:95%乙醇=28洗脫液洗脫,得黑米色素A收集液;然后改用75%乙醇洗脫,得黑米色素B收集液。黑米色素A、B 兩收集液經(jīng)減壓濃縮,真空干燥得黑米色素A 和黑米色素B。A、B兩樣品經(jīng)定性分析與文獻2相似,為黃酮花色苷類化合物。2實驗方法211樣品對全血化學發(fā)光抑制作用的測定在文獻3的基礎上改進選用W istar大鼠,后雙腳注射3%甲醛011mL。1

4、2h后雙腳水腫,眼部取血,肝素抗凝。然后立即按血液HB SS液收稿日期:1998209211資金來源:國家自然科學基金資助項目,N o.39060028;廣西教育廳科研項目,N o.9733作者簡介:龍盛京(1957-,男,副教授67=18比例稀釋,混勻,4冰箱保存?zhèn)溆?。用時取019mL稀釋血,加入不同量的供試液(空白不加,然后加入魯米諾50L,37恒溫水浴箱中衡溫10m in后,加入酵母多糖100L,記時,混勻。置于37恒溫水浴箱中保溫到10m in時測定發(fā)光強度。每次延時O s,測定60s,積分60s,儀器放大倍數(shù)1×103。完成后儀器自動打印出發(fā)光強度積分值。212樣品清除羥基

5、自由基(OH的測定方法參考文獻4的方法略加改進原用50mm o l L磷酸鈉緩沖液配制的試劑都改由二次蒸餾水配。所用試劑和樣品均放在37恒溫水浴箱中保溫,在測定管中加入濃度為118mm o l L的維生素012mL,濃度為118mm o l L的硫酸銅014mL,質量濃度為500g L的酵母012mL,濃度為0.2m o l L pH6.2的磷酸鈉緩沖溶液016mL,混勻,加入不同量的供試液(空白不加,混勻,置于發(fā)光儀中,于37加入濃度為60mm o l L的雙氧水016mL,啟動反應后,測定10s內(nèi)發(fā)光強度的總值。樣品清除過氧化氫的測定方法參照文獻5的方法。樣品清除超氧陰離子自由基的測定方法

6、按文獻6的方法。3結果與討論樣品的抗氧化作用大小用清除率或抑制率以及抗氧化值表示。每種方法每個樣品平行做3次,取平均值,按下式計算清除率或抑制率:清除率或抑制率(%=(空白值-樣品值 空白值×100%液體C I50、固體C I50、抗氧化值的計算:液體C I50和固體C I50為從量效關系曲線回歸方程推出的,當清除率為50%時所需的樣品毫升數(shù)或樣品毫克數(shù)?？寡趸?AOV=(S測-S標 S標S測=固體C I50(m g,S標=維生素C固體C I50或硫脲固體C I50。以維生素C為標準的抗氧化值(或以硫脲為標準的抗氧化值規(guī)定維生素C的AOV為零。當AOV為負值時,該樣品抗氧化能力就比

7、維生素C強,如AOV為正值,則抗氧化能力就越弱。311黑米色素對全血化學發(fā)光的抑制作用由表1可見,黑米色素A、B兩樣品對全血化學發(fā)光有較強的抑制作用并呈量效關系。從AOV的數(shù)據(jù)比較,兩樣品抑制全血化學發(fā)光的作用與維生素C相當。揭示它們對細胞體系產(chǎn)生的活性氧有較強的清除作用。312黑米色素對過氧化氫的清除作用黑米色素A、B兩樣品對過氧化氫都有較強的清除作用,其中黑米色素B的AOV為負數(shù),表明黑米色素B清除過氧化氫的能力比維生素C強,結果見表2。表1黑米色素對全血發(fā)光的抑制作用Table1I nh ibitory effects of the p ig m en t fro m black r i

8、ce on che m ilu m i nescence i n whole blood樣品濃度(g L抑制率(%(X±SD10L50L(用量100LC I50原液(L固體(m gAOV77表2黑米色素對過氧化氫的清除作用Table2Percen t ages of H2O2scavenged by the p ig m en t fro m black r ice樣品濃度(g L清除率(%(X±SD1L5L(用量10LC I50原液(L固體(m gAOV1L3L5L313黑米色素對超氧陰離子自由基(O-2的清除作用黑米色素對O-2都有一定的清除能力,但是兩黑米色素清除O-

9、2的AOV數(shù)據(jù)都大于30,這表明對O-2的清除能力比維生素C要小30倍左右,結果見表3。314黑米色素清除羥基自由基的作用由表4可見,黑米色素A、B兩樣品對OH有一定的清除作用,其中黑米色素B的清除能力強于黑米色素A,但兩者對OH的清除作用都小于硫脲。表3黑米色素清除超氧陰離子自由基的作用Table3Percen t ages of O-2scavenged by the p ig m en t fro m black r ice樣品濃度(g L清除率(%(X±SD10L50L(用量100L200LC I50原液(L固體(m gAOV黑米色素B51L 28125±31473

10、L51189±01705L表4黑米色素清除超羥基自由基的作用Table4Percen t ages ofOH by scavenged by the p ig m en t fro m black r ice樣品濃度(g L清除率(%(X±SD500L1000L(用量1500LC I50原液(L固體(m gAOV黑米色素B549106±314210L 65120±413250L77117±1103100L全血中的白細胞受到酵母多糖的刺激后,產(chǎn)生免疫反應,通過已糖磷酸支路代謝途徑的87活化,發(fā)生呼吸暴發(fā),產(chǎn)生活性氧,并伴隨發(fā)光現(xiàn)象。但這種發(fā)光現(xiàn)象

11、非常弱,需要高靈敏度的儀器才能檢測到。如果在細胞吞噬的過程中加入冷光劑魯米諾,則發(fā)光強度明顯增強,這是由于細胞吞噬過程中所產(chǎn)生的活性氧把魯米諾氧化成激發(fā)態(tài)分子,被激發(fā)的魯米諾退激回基態(tài)時產(chǎn)生波長為425nm的化學發(fā)光。A llen和Kato在此基礎上先后建立了以全血為材料檢測呈噬細胞化學發(fā)光的方法。其結果表明,全血化學發(fā)光與細胞吞噬氧化功能成正比,與吞噬過程產(chǎn)生的活性氧濃度成正比7,8。在全血化學發(fā)光體系中加入的樣品如能消除活性氧,則全血化學發(fā)光強度就會減弱,由此可根據(jù)樣品抑制全血化學發(fā)光的強弱來衡量其清除由細胞體系產(chǎn)生的活性氧能力的大小。黑米色素對全血化學發(fā)光的抑制作用較大,這揭示黑米色素對

12、細胞體系產(chǎn)生的活性氧有較大的清除能力。黑米色素為黃酮花色苷類化合物,其分子結構中有酚羥基存在,黑色素對細胞體系或非細胞體系產(chǎn)生的活性氧都有一定的清除作用,這與酚羥基的存在有關。酚羥基是一類較為活潑的官能團之一,易被活性氧氧化,而表現(xiàn)出較強的抗活性氧化的能力。結果提示,黑米的食療功能與黑米色素的抗活性氧能力有關,黑米色素是食品中較好的自由基清除劑之一。黑米色素在體內(nèi)代謝過程中的抗氧化作用如何有待進一步研究。參考文獻1Singh A,Smoak B L,Patterson K Y et al.Am JC lin nutr.1991,53:1262賴來展1黑色食品的研究與加工技術1北京:中國農(nóng)業(yè)科技

13、出版社,1997,1063徐孝儀,程松高1中國免疫學雜志,1986,2(1:344陳季武,胡天喜1生物化學與生物物理進展,1992,19(2:1365龍盛京,錢瑩1營養(yǎng)學報,1997,19(4:4706龍盛京,李毅1中國藥理學通報,1994,10(1:517A llam P C,L oo se L D.B i ochem bi ophys R esCommon,1978,69:2458Kato T,W okalek H,Schopf E.K li mW ochensch r,1981,59(5:203D eter m i na tion of An tiox ida tion of P igm

14、 en t from Black R ice by Che m ilu m i nescence L ON G S heng2j ing (D ep artm en t of Chem istry,Guangx i M edical U n iversity,N ann ing530021,Fenx i Sh iyan sh i,1999,18(4:7679T he inh ib ito ry effect of p igm en t from b lack rice on active oxygen w as studied by u sing chem ilum inescence.T h

15、e inh ib iti on on chem inescence in w ho le b lood and the scavenging effects on p erox ide an i on radicals, hydroxyl radical and hydrogen perox ide w ere m easu red.T he resu lts show ed that the p igm en t from b lack rice m arkdly inh ib it chem ilum inescence in w ho le b lood,and scavenge the active oxygen p roduced by non2 cellu lar system s to a certain ex ten t.T hese resu lts suggest