化學(xué)發(fā)光分析法測(cè)定黑米色素抗氧化作用

1、化學(xué)發(fā)光分析法測(cè)定黑米色素抗氧化作用龍盛京(廣西醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室,南寧530021摘要:運(yùn)用化學(xué)發(fā)光分析法研究了黑米色素抗活性氧能力大小,測(cè)定了黑米色素對(duì)全血化學(xué)發(fā)光的抑制和清除O-2、OH、H2O2的作用。結(jié)果表明,黑米色素對(duì)全血化學(xué)發(fā)光有較大的抑制作用,即對(duì)由細(xì)胞體系產(chǎn)生的活性氧有較大的消除作用;對(duì)非細(xì)胞體系產(chǎn)生的活性氧化也有一定的消除能力。關(guān)鍵詞:化學(xué)發(fā)光分析;黑米;色素;抗氧化作用;活性氧機(jī)體在生理過(guò)程或應(yīng)激過(guò)程可產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O-2、過(guò)氧化氫(H2O2和羥基自由基(OH等活性氧物質(zhì),而過(guò)量產(chǎn)生的活性氧則可造成組織細(xì)胞損傷,引起細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡1。經(jīng)過(guò)多年研究已經(jīng)證明自由基

2、與一百多種人類(lèi)疾病有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)用化學(xué)發(fā)光分析方法來(lái)評(píng)價(jià)黑米色素抗活性氧的能力,旨為黑米的科學(xué)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1試劑、儀器、樣品及色素的提取緩沖溶液為無(wú)酚紅的pH7.4的H ank s平衡鹽溶液(HB SS。酵母多糖(sigm a產(chǎn)品稱(chēng)取30m g酵母多糖懸于3mL生理鹽水中,水浴煮沸30m in后離心,棄去上清液,沉淀再懸于HB SS緩沖溶液中,終質(zhì)量濃度為5g L,4保存。魯米諾(M erck2Schuch rat產(chǎn)品稱(chēng)819m g 魯米諾,加入0120mL二甲基亞砜溶解后,加pH7.4的H ank s應(yīng)用液50mL,電磁攪拌5h。終濃度為1mm o l L,冰箱保存。D G3030發(fā)光光

3、度計(jì)(南京華東電子管廠(chǎng)。黑米(紫香米由廣東省農(nóng)科院提供。黑米色素的提取:400g黑米加入70%乙醇1200mL,室溫浸泡,24h后過(guò)濾。濾渣加70%乙醇再浸泡24h,過(guò)濾。合并二次濾液,減壓濃縮,得黑米粗色素提取物。黑米粗色素提取物硅膠柱層析,先用氯仿:95%乙醇=28洗脫液洗脫,得黑米色素A收集液;然后改用75%乙醇洗脫,得黑米色素B收集液。黑米色素A、B 兩收集液經(jīng)減壓濃縮,真空干燥得黑米色素A 和黑米色素B。A、B兩樣品經(jīng)定性分析與文獻(xiàn)2相似,為黃酮花色苷類(lèi)化合物。2實(shí)驗(yàn)方法211樣品對(duì)全血化學(xué)發(fā)光抑制作用的測(cè)定在文獻(xiàn)3的基礎(chǔ)上改進(jìn)選用W istar大鼠,后雙腳注射3%甲醛011mL。1

4、2h后雙腳水腫,眼部取血,肝素抗凝。然后立即按血液HB SS液收稿日期:1998209211資金來(lái)源:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目,N o.39060028;廣西教育廳科研項(xiàng)目,N o.9733作者簡(jiǎn)介:龍盛京(1957-,男,副教授67=18比例稀釋,混勻,4冰箱保存?zhèn)溆?。用時(shí)取019mL稀釋血,加入不同量的供試液(空白不加,然后加入魯米諾50L,37恒溫水浴箱中衡溫10m in后,加入酵母多糖100L,記時(shí),混勻。置于37恒溫水浴箱中保溫到10m in時(shí)測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。每次延時(shí)O s,測(cè)定60s,積分60s,儀器放大倍數(shù)1×103。完成后儀器自動(dòng)打印出發(fā)光強(qiáng)度積分值。212樣品清除羥基

5、自由基(OH的測(cè)定方法參考文獻(xiàn)4的方法略加改進(jìn)原用50mm o l L磷酸鈉緩沖液配制的試劑都改由二次蒸餾水配。所用試劑和樣品均放在37恒溫水浴箱中保溫,在測(cè)定管中加入濃度為118mm o l L的維生素012mL,濃度為118mm o l L的硫酸銅014mL,質(zhì)量濃度為500g L的酵母012mL,濃度為0.2m o l L pH6.2的磷酸鈉緩沖溶液016mL,混勻,加入不同量的供試液(空白不加,混勻,置于發(fā)光儀中,于37加入濃度為60mm o l L的雙氧水016mL,啟動(dòng)反應(yīng)后,測(cè)定10s內(nèi)發(fā)光強(qiáng)度的總值。樣品清除過(guò)氧化氫的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)5的方法。樣品清除超氧陰離子自由基的測(cè)定方法

6、按文獻(xiàn)6的方法。3結(jié)果與討論樣品的抗氧化作用大小用清除率或抑制率以及抗氧化值表示。每種方法每個(gè)樣品平行做3次,取平均值,按下式計(jì)算清除率或抑制率:清除率或抑制率(%=(空白值-樣品值 空白值×100%液體C I50、固體C I50、抗氧化值的計(jì)算:液體C I50和固體C I50為從量效關(guān)系曲線(xiàn)回歸方程推出的,當(dāng)清除率為50%時(shí)所需的樣品毫升數(shù)或樣品毫克數(shù)?？寡趸?AOV=(S測(cè)-S標(biāo) S標(biāo)S測(cè)=固體C I50(m g,S標(biāo)=維生素C固體C I50或硫脲固體C I50。以維生素C為標(biāo)準(zhǔn)的抗氧化值(或以硫脲為標(biāo)準(zhǔn)的抗氧化值規(guī)定維生素C的AOV為零。當(dāng)AOV為負(fù)值時(shí),該樣品抗氧化能力就比

7、維生素C強(qiáng),如AOV為正值,則抗氧化能力就越弱。311黑米色素對(duì)全血化學(xué)發(fā)光的抑制作用由表1可見(jiàn),黑米色素A、B兩樣品對(duì)全血化學(xué)發(fā)光有較強(qiáng)的抑制作用并呈量效關(guān)系。從AOV的數(shù)據(jù)比較,兩樣品抑制全血化學(xué)發(fā)光的作用與維生素C相當(dāng)。揭示它們對(duì)細(xì)胞體系產(chǎn)生的活性氧有較強(qiáng)的清除作用。312黑米色素對(duì)過(guò)氧化氫的清除作用黑米色素A、B兩樣品對(duì)過(guò)氧化氫都有較強(qiáng)的清除作用,其中黑米色素B的AOV為負(fù)數(shù),表明黑米色素B清除過(guò)氧化氫的能力比維生素C強(qiáng),結(jié)果見(jiàn)表2。表1黑米色素對(duì)全血發(fā)光的抑制作用Table1I nh ibitory effects of the p ig m en t fro m black r i

8、ce on che m ilu m i nescence i n whole blood樣品濃度(g L抑制率(%(X±SD10L50L(用量100LC I50原液(L固體(m gAOV77表2黑米色素對(duì)過(guò)氧化氫的清除作用Table2Percen t ages of H2O2scavenged by the p ig m en t fro m black r ice樣品濃度(g L清除率(%(X±SD1L5L(用量10LC I50原液(L固體(m gAOV1L3L5L313黑米色素對(duì)超氧陰離子自由基(O-2的清除作用黑米色素對(duì)O-2都有一定的清除能力,但是兩黑米色素清除O-

9、2的AOV數(shù)據(jù)都大于30,這表明對(duì)O-2的清除能力比維生素C要小30倍左右,結(jié)果見(jiàn)表3。314黑米色素清除羥基自由基的作用由表4可見(jiàn),黑米色素A、B兩樣品對(duì)OH有一定的清除作用,其中黑米色素B的清除能力強(qiáng)于黑米色素A,但兩者對(duì)OH的清除作用都小于硫脲。表3黑米色素清除超氧陰離子自由基的作用Table3Percen t ages of O-2scavenged by the p ig m en t fro m black r ice樣品濃度(g L清除率(%(X±SD10L50L(用量100L200LC I50原液(L固體(m gAOV黑米色素B51L 28125±31473

10、L51189±01705L表4黑米色素清除超羥基自由基的作用Table4Percen t ages ofOH by scavenged by the p ig m en t fro m black r ice樣品濃度(g L清除率(%(X±SD500L1000L(用量1500LC I50原液(L固體(m gAOV黑米色素B549106±314210L 65120±413250L77117±1103100L全血中的白細(xì)胞受到酵母多糖的刺激后,產(chǎn)生免疫反應(yīng),通過(guò)已糖磷酸支路代謝途徑的87活化,發(fā)生呼吸暴發(fā),產(chǎn)生活性氧,并伴隨發(fā)光現(xiàn)象。但這種發(fā)光現(xiàn)象

11、非常弱,需要高靈敏度的儀器才能檢測(cè)到。如果在細(xì)胞吞噬的過(guò)程中加入冷光劑魯米諾,則發(fā)光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),這是由于細(xì)胞吞噬過(guò)程中所產(chǎn)生的活性氧把魯米諾氧化成激發(fā)態(tài)分子,被激發(fā)的魯米諾退激回基態(tài)時(shí)產(chǎn)生波長(zhǎng)為425nm的化學(xué)發(fā)光。A llen和Kato在此基礎(chǔ)上先后建立了以全血為材料檢測(cè)呈噬細(xì)胞化學(xué)發(fā)光的方法。其結(jié)果表明,全血化學(xué)發(fā)光與細(xì)胞吞噬氧化功能成正比,與吞噬過(guò)程產(chǎn)生的活性氧濃度成正比7,8。在全血化學(xué)發(fā)光體系中加入的樣品如能消除活性氧,則全血化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度就會(huì)減弱,由此可根據(jù)樣品抑制全血化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)弱來(lái)衡量其清除由細(xì)胞體系產(chǎn)生的活性氧能力的大小。黑米色素對(duì)全血化學(xué)發(fā)光的抑制作用較大,這揭示黑米色素對(duì)

12、細(xì)胞體系產(chǎn)生的活性氧有較大的清除能力。黑米色素為黃酮花色苷類(lèi)化合物,其分子結(jié)構(gòu)中有酚羥基存在,黑色素對(duì)細(xì)胞體系或非細(xì)胞體系產(chǎn)生的活性氧都有一定的清除作用,這與酚羥基的存在有關(guān)。酚羥基是一類(lèi)較為活潑的官能團(tuán)之一,易被活性氧氧化,而表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗活性氧化的能力。結(jié)果提示,黑米的食療功能與黑米色素的抗活性氧能力有關(guān),黑米色素是食品中較好的自由基清除劑之一。黑米色素在體內(nèi)代謝過(guò)程中的抗氧化作用如何有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)1Singh A,Smoak B L,Patterson K Y et al.Am JC lin nutr.1991,53:1262賴(lài)來(lái)展1黑色食品的研究與加工技術(shù)1北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科技

13、出版社,1997,1063徐孝儀,程松高1中國(guó)免疫學(xué)雜志,1986,2(1:344陳季武,胡天喜1生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1992,19(2:1365龍盛京,錢(qián)瑩1營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),1997,19(4:4706龍盛京,李毅1中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),1994,10(1:517A llam P C,L oo se L D.B i ochem bi ophys R esCommon,1978,69:2458Kato T,W okalek H,Schopf E.K li mW ochensch r,1981,59(5:203D eter m i na tion of An tiox ida tion of P igm

14、 en t from Black R ice by Che m ilu m i nescence L ON G S heng2j ing (D ep artm en t of Chem istry,Guangx i M edical U n iversity,N ann ing530021,Fenx i Sh iyan sh i,1999,18(4:7679T he inh ib ito ry effect of p igm en t from b lack rice on active oxygen w as studied by u sing chem ilum inescence.T h

15、e inh ib iti on on chem inescence in w ho le b lood and the scavenging effects on p erox ide an i on radicals, hydroxyl radical and hydrogen perox ide w ere m easu red.T he resu lts show ed that the p igm en t from b lack rice m arkdly inh ib it chem ilum inescence in w ho le b lood,and scavenge the active oxygen p roduced by non2 cellu lar system s to a certain ex ten t.T hese resu lts suggest