生產(chǎn)中常用菌種的分離、選育和保藏

1、第二章第二章 生產(chǎn)中常用菌種的分離、生產(chǎn)中常用菌種的分離、選育和保藏選育和保藏 主講人：韓北忠 劉 萍帶圖象分析系統(tǒng)的微生物菌種帶圖象分析系統(tǒng)的微生物菌種顯微觀察裝置顯微觀察裝置 第一節(jié)第一節(jié) 菌種的分離簡(jiǎn)介菌種的分離簡(jiǎn)介 一、菌種的來源一、菌種的來源 根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購(gòu)買； 從大自然中分離篩選新的微生物菌種。 二、分離思路二、分離思路 新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來。 實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進(jìn)行分離純化。 有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條

2、件和合理先進(jìn)的設(shè)備與之配合。 定方案：定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長(zhǎng)培養(yǎng)特性。 采樣：采樣：有針對(duì)性地采集樣品。 增殖：增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)。 分離：分離：利用分離技術(shù)得到純種。 發(fā)酵性能測(cè)定：發(fā)酵性能測(cè)定：進(jìn)行生產(chǎn)性能測(cè)定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營(yíng)養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長(zhǎng)和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。三、新種分離與篩選的步驟三、新種分離與篩選的步驟 （一）采樣一）采樣1、采樣對(duì)象 以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細(xì)菌和放線菌為主，富含碳水化合物的土壤和沼澤地

3、中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長(zhǎng)區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對(duì)象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。從自然界篩選從自然界篩選 2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。 3、采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小薩子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時(shí)分離。（二）增殖培養(yǎng)（二）增殖培養(yǎng) 為了容易分離到所需的菌種，讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，可以通過配制選擇性培養(yǎng)基，選擇一定的培養(yǎng)條件來控制。 例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維

4、素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長(zhǎng)，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對(duì)下階段的純種分離就會(huì)順利得多。（三）培養(yǎng)分離（三）培養(yǎng)分離 盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長(zhǎng)狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用，而且控制得細(xì)一點(diǎn)，好一點(diǎn)。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法。（四）篩（四）篩 選選 這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn)，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。（五）毒性試驗(yàn)（五）毒性試驗(yàn) 自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)

5、心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應(yīng)慎重。據(jù)有的國(guó)家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗(yàn)外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗(yàn)。第二節(jié)第二節(jié) 培養(yǎng)分離培養(yǎng)分離 從自然界中分離培養(yǎng)微生物是菌種選育的重要和基礎(chǔ)的步驟。 到目前為止，還沒有一種分離培養(yǎng)方法能揭示一個(gè)試樣中所包含的所有微生物總數(shù)和種類。 在任一試樣中所存在的微生物僅為極少數(shù)特定種類的菌株；在工業(yè)微生物篩選過程中，應(yīng)及時(shí)調(diào)整檢測(cè)方法，以與各種不同類型的生長(zhǎng)和代謝之微生物相適應(yīng)。 因此，建立一更為科學(xué)的和針對(duì)性不強(qiáng)的分離方法是必要的。 一、成功的分離培養(yǎng)方法一、成功的分離培養(yǎng)方法(1

6、)認(rèn)真考它所需產(chǎn)品的特征和生產(chǎn)過程；(2)制訂初步的篩選標(biāo)準(zhǔn)；(3)將生態(tài)學(xué)方法運(yùn)用到分離和篩選過程。二、培養(yǎng)分離中要解決的問題1、“分離什么和從哪里分離出?” 2、必須充分考慮所分離微生物的生產(chǎn)能力、生長(zhǎng)速度、生物群體培養(yǎng)和產(chǎn)品生產(chǎn)工藝及其提純的難易和費(fèi)用，工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵罐中穩(wěn)定性及遺傳操作的難易程度等。3、選擇適宜的培養(yǎng)分離方法和檢測(cè)方法。三、將生態(tài)學(xué)方法用于培養(yǎng)分離三、將生態(tài)學(xué)方法用于培養(yǎng)分離的一般思路要點(diǎn)的一般思路要點(diǎn) 1羅列出所要分離的微生物類群； 2根據(jù)所采集樣本的各種生態(tài)參數(shù)，描述所要分離的微生物之生態(tài)系統(tǒng)或棲息地： 3將若干樣本分成若干類型，如植物和植物各部，土壤(類型和土層)、

7、巖石、水、昆蟲和發(fā)酵食品等； 4羅列出所要考察和測(cè)量的環(huán)境參數(shù)，如pH、鹽分、水分、氧化還原電勢(shì)及溫度等； 5列出生物系統(tǒng)中有用的自然底物，如森林土壤中的幾丁質(zhì)、葡萄表皮的果膠； 6根據(jù)上述1-5項(xiàng)中所獲得的數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)分離方法，即選擇適宜的稀釋液、底物、試樣、天然浸出汁和培養(yǎng)條件； 7用標(biāo)準(zhǔn)方法作對(duì)照來評(píng)價(jià)生態(tài)學(xué)分離方法； 8根據(jù)待檢材料的生態(tài)參數(shù)需要，修改已知的方法； 9運(yùn)用特定的富集方法，富集那些可能具有篩選意義的微生物類群。四、自然界中細(xì)菌的分離四、自然界中細(xì)菌的分離 (一一)采樣和采集方法采樣和采集方法 為了從一特定生態(tài)系統(tǒng)中分離出具有代表性的細(xì)菌菌群，特別是分離那些在唯一微環(huán)境區(qū)域中

8、出現(xiàn)的菌群時(shí)，必須十分重視樣本的采集。 樣本采集時(shí)所需的工具通常有無菌刮鏟、土樣采集器、鑷子、解剖刀、手套、無菌小塑料袋和塑料瓶等。采樣的注意事項(xiàng)采樣的注意事項(xiàng)1、采樣時(shí)應(yīng)盡可能保持相對(duì)無菌；2、所采集的樣本必須具有某種代表性；3、采好的樣必須完整地標(biāo)上樣本的種類及采集日期、地點(diǎn)以及采集地點(diǎn)的地理、生態(tài)參數(shù)等；4、應(yīng)充分考慮采樣的季節(jié)性和時(shí)間因素，因?yàn)檎嬲脑鼐旱某霈F(xiàn)可能是短暫的； 5、采好的樣應(yīng)及時(shí)處理，暫不能處理的也應(yīng)貯存于4下，但貯存時(shí)間不宜過長(zhǎng)。這是因?yàn)橐坏┎蓸咏Y(jié)束，試樣中的微生物群體就脫離了原來的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)部生態(tài)環(huán)境就會(huì)發(fā)生變化，微生物群體之間就會(huì)出現(xiàn)消長(zhǎng)1土樣采集方法土樣采

9、集方法 森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下層向上層順序采集； 水田等浸水土壤在不損土層結(jié)構(gòu)的情況下插入圓筒采集。如果層次要求不嚴(yán)格，可取離地面515cm處的土。將采集到的土樣盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。 在采集植物根際土樣時(shí)，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量無菌水中浸漬約20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用無菌水漂洗下根部殘留的土，這部分上卻為根際土樣。2 2植物體采集方法植物體采集方法 在采集葉面時(shí)，一般是用滅菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由幾片新鮮葉片的同一部位切取一小塊，并注意不要損傷周圍邊緣。 選擇葉面時(shí)應(yīng)考慮葉位、葉齡、葉片正反面和在一片葉上的取樣部位。 采集植物根及根系時(shí)

10、，方法與根際土樣采集方法相似。將洗凈的根裝入采樣袋中，采集根系時(shí)，一般與根際土樣一起保存。 3 3水樣采集方法水樣采集方法 用于細(xì)菌檢測(cè)的水樣應(yīng)收集于100m1干凈、滅菌的廣口塑料瓶中。 由于表層水中含有泥沙，故在采樣時(shí)應(yīng)在較深的靜水層中采集水樣。 方法是：握住采樣瓶底浸入水中30-50cm處，然后瓶口朝下打開瓶蓋，讓水樣進(jìn)入。如果有急流存在的話，應(yīng)直接將瓶口反向于急流。采集瓶從水中取出時(shí)應(yīng)迅速并帶有較大的弧度。水樣不應(yīng)裝滿采樣瓶。所有水樣都應(yīng)在24h之內(nèi)迅速進(jìn)行檢測(cè)，或者4下貯存。( (二二)生態(tài)學(xué)參數(shù)及培養(yǎng)基生態(tài)學(xué)參數(shù)及培養(yǎng)基的組成原則的組成原則1、加入培養(yǎng)基中的天然提取物種類和用量、環(huán)境

11、生物物理學(xué)參數(shù)以及用于平板涂布分離樣本的溶劑都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)中所要分離的細(xì)菌的數(shù)量和種類。2、就分離培養(yǎng)基的組成而言，部分培養(yǎng)基中必須含有10-50%的天然提取物。加入培養(yǎng)基中的天然提取物，部分培養(yǎng)基中則應(yīng)含有多種碳、氮源，如幾丁質(zhì)、纖維素或果膠。3、所有分離培養(yǎng)基中都應(yīng)含有抗真菌劑(如放線菌酮和制霉素)，摻加濃度一般為50gm1， 以抑制真菌的生長(zhǎng)。4、瓊脂平板在使用前應(yīng)置于37培養(yǎng)箱中孵育l、2天。5、培養(yǎng)基的生物物理學(xué)參數(shù)，如pH及鹽分也應(yīng)調(diào)節(jié)到與試樣的生態(tài)系統(tǒng)參數(shù)值相近。土中細(xì)菌的富集培養(yǎng)與分離 分離土樣中的大部分細(xì)菌的分離程序中無需進(jìn)行富集。 但對(duì)某些少數(shù)細(xì)菌則要求特殊的富集或選擇技術(shù)才

12、能很好地被分離培養(yǎng)。富集方法富集方法 運(yùn)用細(xì)菌的酶誘導(dǎo)性，在分離培養(yǎng)基中添加若干抗生素、復(fù)雜底物及生長(zhǎng)因子的前體物質(zhì)來激活細(xì)菌某一特殊基因組，可以建立起若干富集技術(shù)。 富集可以促進(jìn)抗性的產(chǎn)生并維持下來。 土樣中細(xì)菌的富集：適度稀釋后，取0.1m1涂布已添加及未添加富集底物(如幾丁質(zhì)、纖維素等)的土浸出汁平板。 植物體上細(xì)菌的分離：無菌富集，加植物浸出液適度培養(yǎng)取樣，洗滌，取1ml經(jīng)適度稀釋后涂布平板。 水中細(xì)菌的分離：水樣通過0.22m無菌濾膜，取出濾膜用1ml無菌稀釋液將濾膜上的沉積洗下。用樣本稀釋液適度稀釋,涂布平板倒置培養(yǎng)或?yàn)V紙壓印分離法。水中細(xì)菌分離的簡(jiǎn)易富集技術(shù)水中細(xì)菌分離的簡(jiǎn)易富集

13、技術(shù) 在無菌的、用棉團(tuán)塞好的廣口三角燒瓶中連續(xù)培養(yǎng)，定期取樣涂布適宜分離瓊脂平板上； 在不同水體的水樣中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白質(zhì)等，同樣可以促進(jìn)水中微生物的增殖。 培養(yǎng)過程中可加入低濃度的抗真菌劑以抑制真菌的生長(zhǎng)。 另一富集方法是在培養(yǎng)燒瓶中添加細(xì)菌“附著材料”，如無菌的植物組織或土壤浸出液。 通過改變培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)周期可選擇性富集嗜冷性細(xì)菌、中溫菌和嗜高溫菌。次代培養(yǎng)及純化步驟次代培養(yǎng)及純化步驟 1、涂布的平板經(jīng)培養(yǎng)后，如生長(zhǎng)出菌落，則按涂布不同稀釋度的稀釋液所得的單菌菌落和多菌菌落對(duì)瓊脂平板進(jìn)行分類。2、用無菌牙簽將菌落轉(zhuǎn)接到篩選平板上及轉(zhuǎn)接至添加有少量天然浸出液的適宜保藏瓊脂斜

14、面上。3、篩選平板經(jīng)培養(yǎng)后，按生長(zhǎng)出菌落的形態(tài)學(xué)特征如色素、菌落形態(tài)等進(jìn)行最初分組。4、將認(rèn)為有希望的菌落用牙簽轉(zhuǎn)接到另一模擬分離瓊脂平板上進(jìn)行篩選。五、放線菌的分離五、放線菌的分離 (一)采樣及采集方法 應(yīng)盡可能實(shí)行無菌操作。 所采集的樣本應(yīng)具有一定的代表性。 樣本采集完后，應(yīng)及時(shí)處理或在4下貯存，貯存試樣處應(yīng)與劃線，篩選平板分開，貯存時(shí)間不宜過長(zhǎng)。 ( (二二) )生態(tài)學(xué)參數(shù)生態(tài)學(xué)參數(shù) 放線菌分離培養(yǎng)過程中所需考慮的生態(tài)參數(shù)有溫度、pH、離子強(qiáng)度、氧化還原電勢(shì)和底物濃度。（三）培養(yǎng)基的組成原則（三）培養(yǎng)基的組成原則 大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復(fù)雜底物的瓊脂平板上進(jìn)行的。除嗜溫性放線菌

15、外，其他放線菌一般在培養(yǎng)4-20天內(nèi)在分離平板上緩慢形成菌落。 在放線菌分離瓊脂中通常都加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮，以抑制真菌的繁殖。 選擇性地添加抗生素。 分離瓊脂平板制備好后，一般皆應(yīng)在37培養(yǎng)箱中存放3天。放線菌的分離放線菌的分離 土樣中放線菌的非選擇性分離：土樣風(fēng)干，磨碎，無菌海綿壓印土樣后壓印平板后培養(yǎng)。 植物體上放線菌的分離：無菌取植物組織，干燥以減少細(xì)菌數(shù)量，剪碎植物材料后植入平板表層后培養(yǎng)。也可洗下微生物后振蕩培養(yǎng)。 水中放線菌的分離： 為使所要分離的放線菌的數(shù)量種類增多，一般將水樣離心或?yàn)V紙過濾，取離心沉積或?yàn)V紙表面沉積進(jìn)行系列稀釋和涂布。次代培養(yǎng)及純化次代培養(yǎng)及純化 菌

16、落形成后可根據(jù)肉眼可見的菌落形態(tài)上的差異，作初步的鑒定和區(qū)分。 通過高倍放大進(jìn)行鏡檢，可了解氣生和營(yíng)養(yǎng)孢子形成情況。 成功地分離出各種不同的放線菌屬及種的關(guān)鍵是所采集樣本的本身及其分離用的瓊脂培養(yǎng)基；而肉眼識(shí)別不同的生長(zhǎng)形態(tài)、從而初步地加以鑒定，在分離放線菌時(shí)顯得尤為重要。 將分離平板上所形成的菌落用經(jīng)火焰灼燒滅菌的鉤形針或無菌牙簽挑取，點(diǎn)接到瓊脂平板上進(jìn)行影印培養(yǎng)，以進(jìn)一步篩選和分離。六六、真菌分離1、利用低碳氮比的培養(yǎng)基可使真菌生長(zhǎng)菌落分散，利于計(jì)數(shù)，分離和鑒定。這里主要是利用營(yíng)養(yǎng)成分的減少而使生長(zhǎng)減慢，并由此限制真菌的遷涉生長(zhǎng)。2、改變培養(yǎng)溫度將有利于不同嗜溫區(qū)真菌的分離。3、有時(shí)，真菌

17、子實(shí)體形成必須有光線，這在分離培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加以考慮。4、選擇性富集：是通過一定的方式使樣本中一種或一群微生物數(shù)量上的增加而利于分離的一種技術(shù)。 富集可以是種水平的，如通過營(yíng)養(yǎng)要求的改變來富集分離鐮刀菌；也可以是組成群水平的，如以纖維素為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基可選擇性富集所有能降解纖維素的纖維素裂解微生物。5、選擇性抑制培養(yǎng)基可使非目標(biāo)微生物消除或減少到一定程度。在分離培養(yǎng)基中加入一定的抗生素即可有效地抑制細(xì)菌生長(zhǎng)及菌落形成。真菌的分離方法真菌的分離方法 土中真菌的分離：稀釋法，混入法，壓貼法，粘附法，浮選法，注射器采集法，土過篩法，庶糖密度梯度離心法。 植物材料中真菌的分離：植入法，壓貼法，洗滌法

18、，浸泡法。 水中真菌的分離：水樣稀釋后涂布分離。餌誘技術(shù)常用于水中真菌的富集。 子實(shí)體直接分離培養(yǎng)擔(dān)子菌：新采集的子實(shí)體組織植入平板內(nèi)或在放于液體培養(yǎng)基表面放一小塊無菌濾紙上培養(yǎng)。七、生產(chǎn)選種七、生產(chǎn)選種 是在長(zhǎng)年累月的生產(chǎn)實(shí)踐中，在培養(yǎng)工藝條件沒有任何可見變更情況下，突然發(fā)現(xiàn)某些批次生產(chǎn)水平提高較大，這就有可能是個(gè)別自然變異朝更好的方向變的細(xì)胞，在這種條件下很適應(yīng)于培養(yǎng)條件，并逐漸顯示出它的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，這種優(yōu)勢(shì)的發(fā)展，促使它優(yōu)良的生產(chǎn)性能表露。進(jìn)行類似新種篩選分離，達(dá)到獲得新的優(yōu)良生產(chǎn)菌種的目的。第三節(jié)第三節(jié) 工業(yè)菌種的育種方針工業(yè)菌種的育種方針 工業(yè)菌種的育種： 是運(yùn)用遺傳學(xué)原理和技術(shù)對(duì)某個(gè)

19、用于特定生物技術(shù)目的的菌株進(jìn)行的多方位的改造。通過改造，可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強(qiáng)化，或去除不良性質(zhì)或增加新的性狀。工業(yè)菌種育種的方法工業(yè)菌種育種的方法 誘變 基因轉(zhuǎn)移 基因重組育種過程育種過程 包括下列3個(gè)步驟： (1)在不影響菌種活力的前提下，有益基因型的引入。 (2)希望基因型的選出。 (3)改良菌種的評(píng)價(jià)(包括實(shí)驗(yàn)規(guī)模和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模)。選擇育種方法時(shí)綜合考慮的因素選擇育種方法時(shí)綜合考慮的因素 (1)待改良性狀的本質(zhì)及與發(fā)酵工藝的關(guān)系(如批式或連續(xù)發(fā)酵試驗(yàn))； (2)對(duì)這一特定菌種的遺傳和生物化學(xué)萬面認(rèn)識(shí)的明了程度； (3)經(jīng)濟(jì)費(fèi)用。 如果對(duì)特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少，則多半采用隨機(jī)誘

20、變、篩選及選育等技術(shù)： 如果對(duì)其遺傳及生物化學(xué)方面的性狀已有較深的認(rèn)識(shí)，則可選擇基因重組等手段進(jìn)行定向育種。工業(yè)菌種改良方法工業(yè)菌種改良方法 (1)解除或繞過代謝途徑中的限速步驟：通過增加特定基因的拷貝數(shù)或增加相應(yīng)基因的表達(dá)能力來提高限速酶的含量；在代謝裔途徑中引伸出新的代謝步驟，由此提供一個(gè)旁路代謝途徑。 (2)增加前體物的濃度。 (3)改變代謝途徑，減少無用副產(chǎn)品的生成以及提高菌種對(duì)高濃度的有潛在毒性的底物、前體或產(chǎn)品的耐受力。(4)抑制或消除產(chǎn)品分解酶。 (5)改進(jìn)菌種外泌產(chǎn)品的能力。(6)消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制。如誘導(dǎo)代謝產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)類似物抗性。 提高特定基因的表達(dá)水平提高特定基因的表達(dá)

21、水平 (1)引入強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號(hào)，可通過在一高效表達(dá)載體上克隆靶基因；在靶基因的上游引入強(qiáng)啟動(dòng)子；修改現(xiàn)有表達(dá)信號(hào)，提高基因效力等。 (2)誘導(dǎo)解除基因表達(dá)抑制的突變。 改進(jìn)菌種的生長(zhǎng)效率改進(jìn)菌種的生長(zhǎng)效率 提高菌株對(duì)底物的利用率方法： a. 通過確定并改變代謝中的耗能部分; b. 由另一菌株的高效低能代謝途徑代謝來實(shí)現(xiàn)。 c. 賦予菌種對(duì)多種底物，特別是價(jià)廉而豐富的底物的利用能力，由此可降低操作費(fèi)用。第四節(jié)第四節(jié) 誘變育種誘變育種 以微生物的自然變異作為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的機(jī)率并不很高，一個(gè)基因的自然突變頻率僅10-6-10-10左右。 誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種，是迄今為止國(guó)內(nèi)外提高菌種

22、產(chǎn)量、性能的主要手段。誘變物理、化學(xué)或生物誘變方法物理、化學(xué)或生物誘變方法 一、誘變劑和誘變處理 物理誘變劑：射線如紫外線、X射線、射線，快中子； 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。許多高產(chǎn)菌株的選育都用過紫外線，對(duì)于一般實(shí)驗(yàn)室、中小型工廠都適用，也很安全。 其他的幾種射線都是電離性質(zhì)的，有一定的穿透力，一般都由專業(yè)人員在專門的設(shè)備中使用，否則有一定危險(xiǎn)性。化學(xué)誘變劑：化學(xué)因子如堿基類似物、5氟尿嘧啶、烷化劑等?；瘜W(xué)誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。使用化學(xué)誘變劑的優(yōu)缺點(diǎn)：1、大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效。 2、化學(xué)誘變劑是很經(jīng)濟(jì)的，因?yàn)橹恍枰倭康暮线m的

23、誘變劑，設(shè)備是實(shí)驗(yàn)室的一般玻璃器皿，一個(gè)蒸氣罩。而用電離輻射行工作時(shí)，設(shè)備費(fèi)用大，并要注意安全性。3、大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹(jǐn)慎，要避免化學(xué)誘變劑與皮膚接觸，且切勿吸入其蒸氣，有人對(duì)某些誘變劑極其敏感，甚至未直接接觸就會(huì)過敏，這就更要當(dāng)心。誘變劑的選擇誘變劑的選擇1堿基類似物和羥胺具有很高的特異性，但很少使用，回復(fù)突變率高，效果不大。2亞硝酸和烷化劑應(yīng)用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。3吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷。4紫外線仍十分有效。電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，

24、它能造成不可回復(fù)的缺突變。但它可能影響鄰近基因的性能。二、誘變育種步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選( (一一) )出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株的選擇1自然界新分離的野生型菌株，對(duì)誘變處理較敏感，容易達(dá)到好的效果。2在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株。3每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。4出發(fā)菌株開始時(shí)可以同時(shí)選23株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。 5要盡量選擇單倍體細(xì)胞、單核或核少的多細(xì)胞體來作出發(fā)誘變細(xì)胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。 6根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細(xì)胞生理狀態(tài)或誘變

25、譜選擇誘變劑，因?yàn)橥徽T變劑的重復(fù)處理會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。有的誘變劑是作用于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，就要選對(duì)數(shù)期的細(xì)胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。 ( (二二) )處理菌懸液的制備處理菌懸液的制備 這一步驟的關(guān)鍵是制備單細(xì)胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進(jìn)行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾。( (三三) )誘變處理誘變處理 根據(jù)前面有關(guān)誘變劑及誘變處理的介紹，結(jié)合誘變對(duì)象的實(shí)際，設(shè)計(jì)誘變處理方案。 ( (四四) )中間培養(yǎng)中間培養(yǎng) 由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前，有一個(gè)表現(xiàn)延遲的過程，即細(xì)胞內(nèi)原有酶量的稀釋過程(生理延遲)，需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。這個(gè)過

26、程對(duì)今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。 方法： 讓變異處理后細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時(shí)，以讓細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制，讓細(xì)胞繁殖幾代，以得到純的變異細(xì)胞。這樣，隱性的變異就會(huì)顯現(xiàn)出來，若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會(huì)出現(xiàn)變異和不變異細(xì)胞同時(shí)存在于一個(gè)菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。( (五五) )分離和篩選分離和篩選 篩選分初篩和復(fù)篩。初篩以迅速篩出大量的達(dá)到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。 復(fù)篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異. 例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色

27、圈或透明圈的大小來挑取參加復(fù)篩者，而將90%的菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要仔細(xì)比較參加復(fù)篩和再?gòu)?fù)篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復(fù)篩階段，還應(yīng)不斷結(jié)合自然分離，純化菌株。紫外線的誘變育種紫外線的誘變育種 紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，波長(zhǎng)為2537A燈與處理物的距離為1530cm，照射時(shí)間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細(xì)胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在7080%為宜。 被照射的菌懸液細(xì)胞數(shù)，細(xì)菌為106個(gè)ml左右，霉菌孢子和酵母細(xì)胞為106107個(gè)ml。由于紫外線穿透力不強(qiáng)，要求照射液不要太深，約0.51.0cm厚，同時(shí)要用電磁攪拌器或手工進(jìn)行攪拌，使照

28、射均勻。 由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照射時(shí)和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進(jìn)行。 (二)操作步驟 1將細(xì)菌培養(yǎng)液以3000rmin離心5min，傾去上清液，將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。 2將菌懸液放入一巳滅菌的，裝有玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)用手搖動(dòng)，以打散菌體。將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過濾，單細(xì)胞濾液裝入試管內(nèi)，一般處于渾濁態(tài)的細(xì)胞液含細(xì)胞數(shù)可達(dá)108個(gè)ml左右，作為待處理菌懸液。 3取24m1制備的菌液加到直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下30cm處。在正式照射前，應(yīng)先開紫外線10min，讓紫外燈預(yù)熱，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射1050s。操

29、作均應(yīng)在紅燈下進(jìn)行，或用黑紙包住，避免白熾光。 4取未照射的制備菌液和照射菌液各o.5ml進(jìn)行稀釋分離，計(jì)數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)。 5取照射菌液2ml于液體培養(yǎng)基中(300ml三角瓶?jī)?nèi)裝30ml培養(yǎng)液)，120rmin振蕩培養(yǎng)46h。 6取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。 7挑取菌落進(jìn)行篩選。亞硝基胍誘變曲霉菌亞硝基胍誘變曲霉菌 N甲基N-硝基-N-亞硝基胍(NGN，MNNG或TG)對(duì)真核或原核微生物都有強(qiáng)烈的誘變作用。其精確的作用機(jī)制尚不很清楚，據(jù)認(rèn)為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。MNNG的誘變作用隨pH的升高而增強(qiáng)。 (二)操作步驟 1單

30、孢子懸液制備 取斜面，加入6ml 0.1molL pH6.o的磷酸緩沖液，用接種環(huán)刮下孢子，振蕩試管，立即通過帶濾紙漏斗過濾，由此制得單孢子懸液，若孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達(dá)l06個(gè)ml，此為待處理孢子懸液。 2MNNG溶液的制備 用分析天平稱取2mg，加入2ml 0.1molL pH 6.0磷酸緩沖液，于暗處振蕩溶解。3誘變處理 吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子懸液中，30振蕩30min，立即稀釋1000倍停止作用，然后以10-2，10-4兩個(gè)稀釋度分離培養(yǎng)，30 3天后計(jì)數(shù)。 4死亡率計(jì)算 將未處理的孢子液1ml加入1ml磷酸緩沖液中，同上逐級(jí)稀釋分離， 30下培養(yǎng)3天。根據(jù)處理

31、前后的活孢子數(shù)可計(jì)算出死亡率。 5挑取菌落進(jìn)行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選第五節(jié)第五節(jié) 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型的選育 營(yíng)養(yǎng)缺陷型是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)成分才能正常生長(zhǎng)的變異株。 與營(yíng)養(yǎng)缺陷型對(duì)應(yīng)的是野生型。 能滿足野生型菌株正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基稱基本培養(yǎng)基(MM)； 在基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)成分的稱補(bǔ)充培養(yǎng)基(SM)； 能滿足各種營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)的稱完全培養(yǎng)基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等。營(yíng)養(yǎng)缺陷型的用途營(yíng)養(yǎng)缺陷型的用途 營(yíng)養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大。目前生產(chǎn)氨基酸、核苷酸的菌種都是各種

32、類型的缺陷型。要研究代謝途徑，育種技術(shù)都必須有營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株為材料。篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型的步驟篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型的步驟 誘變 淘汰野生型 檢出缺陷型 確定生長(zhǎng)譜一、誘變方法一、誘變方法 物理誘變 化學(xué)誘變二、淘汰野生型二、淘汰野生型 抗生素法：野生型能在MM中生長(zhǎng)，而缺陷型不能，于是將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時(shí)讓野生型生長(zhǎng)，處于活化階段，而缺陷型無法生長(zhǎng)，仍處于休眠狀態(tài)。由于細(xì)菌或酵母對(duì)一些抗生素敏感，于是就相應(yīng)加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。一般細(xì)菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。 菌絲過濾法：對(duì)于霉菌，因孢子生長(zhǎng)后會(huì)長(zhǎng)出菌絲體，就可用濾紙過濾法將菌絲濾去，而缺陷

33、型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過。 三、檢出缺陷型三、檢出缺陷型 原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)情況完全不同，缺陷型在CM上生長(zhǎng)良好，而在MM上則不生長(zhǎng)，野生型都能生長(zhǎng)。 具體方法：影印法、點(diǎn)種法、夾層法 1將一較平皿直徑小1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨，用金屬夾夾住，滅菌。 2將完全培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓，使之成為印模，標(biāo)記方位。 3將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標(biāo)記的同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復(fù)印于上。 ( (一一) )影印法影印法 4 將CM和MM在恒溫箱中培養(yǎng)。 5二平皿相同方位進(jìn)行比較， 即可發(fā)現(xiàn)在MM平皿上長(zhǎng)出的菌落少于GM平板上的。MM上未長(zhǎng)

34、而相應(yīng)于CM上長(zhǎng)出的那幾個(gè)菌落就可能是缺陷型。 此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應(yīng)有一定間隔。 ( (二二) )點(diǎn)種法點(diǎn)種法 也就是任意法。 用接種針或牙簽將CM上長(zhǎng)出的菌落在MM和CM兩副平板上接種，依次在相應(yīng)位置點(diǎn)種，然后一起培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)情況。 此法結(jié)果明確，但工作量大。 ( (三三) )夾層法夾層法 先在培養(yǎng)皿上倒一層基本瓊脂培養(yǎng)基，凝固后涂上一層含菌的MM，凝固后再倒一薄層MM瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，將出現(xiàn)的菌落標(biāo)記，然后倒上一層CM瓊脂培養(yǎng)基，再培養(yǎng)。這時(shí)第二批長(zhǎng)出的菌落就可能是缺陷型。 此法缺點(diǎn)是，結(jié)果有時(shí)不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。四、營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)譜

35、的確定四、營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)譜的確定 驗(yàn)證確定是缺陷型后，就需確定其缺陷的因子，即生長(zhǎng)譜測(cè)定。生長(zhǎng)譜測(cè)定的方法生長(zhǎng)譜測(cè)定的方法 將缺陷型菌株培養(yǎng)后，收集菌體，制備成細(xì)胞懸液，與MM培養(yǎng)基(融化并涼至50)混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的56個(gè)區(qū)間放上不同的營(yíng)養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組合營(yíng)養(yǎng)物的濾紙圓片。培養(yǎng)后會(huì)在某組合區(qū)長(zhǎng)出，就可測(cè)得所需營(yíng)養(yǎng)。個(gè)平皿測(cè)一個(gè)菌。 以不同組合的營(yíng)養(yǎng)混合物與融化涼至50的MM培養(yǎng)基混合鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個(gè)缺陷型菌株于各相應(yīng)位置，培養(yǎng)后根據(jù)在這些組合長(zhǎng)出可推知其營(yíng)養(yǎng)因子。在56個(gè)平皿上可測(cè)20株菌以上。第六節(jié)第六節(jié) 基因育種基因育種 基因重組育種：是

36、運(yùn)用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細(xì)菌質(zhì)?；蚱渌d體，將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細(xì)胞并使其在新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，或者通過細(xì)胞間的相互作用，使一個(gè)細(xì)胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉(zhuǎn)移給另個(gè)細(xì)胞的方法。一個(gè)完整的基因克隆過程包括以一個(gè)完整的基因克隆過程包括以下步驟下步驟 、獲得待克隆的DNA片段（基因）； 、目的基因與載體在體外連接； 、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞； 、篩選、鑒定陽性重組子； 、重組子的擴(kuò)增與或表達(dá)。 2.2基因重組一、質(zhì)粒的特點(diǎn)一、質(zhì)粒的特點(diǎn)1、質(zhì)粒的存在并非微生物生命活動(dòng)必需。2、每個(gè)細(xì)胞中存在的質(zhì)粒數(shù)稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)。不同類型的質(zhì)粒

37、其拷貝數(shù)各異，同一質(zhì)粒在不同條件下，拷貝數(shù)也可能差異很大，有嚴(yán)緊型和松弛型兩種。3、質(zhì)粒DNA分子常呈現(xiàn)三種形態(tài)；常見的一種是共價(jià)、閉環(huán)狀DNA(CCC DNA)；其次是由于條鏈有缺口而產(chǎn)生的開環(huán)DNA(ocDNA)；第三種是由雙環(huán)分子兩段均斷裂而產(chǎn)生的線性DNA。質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體二、各類質(zhì)粒所賦予宿主細(xì)胞的二、各類質(zhì)粒所賦予宿主細(xì)胞的不同表現(xiàn)型不同表現(xiàn)型 抗生素抗性：抗生素的產(chǎn)生；大腸桿菌素的產(chǎn)生；腸毒素的產(chǎn)生；復(fù)雜有機(jī)化合物的降解；限制性核酸內(nèi)切酶和修飾酶的產(chǎn)生；殺傷性能。 在自然條件下，許多質(zhì)?？山?jīng)細(xì)菌接合或相似方式在宿主間相互轉(zhuǎn)移。在實(shí)驗(yàn)室條件下，質(zhì)粒也可經(jīng)人工手段將其轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞內(nèi)

38、。三、質(zhì)粒三、質(zhì)粒DNADNA的提取方法的提取方法 細(xì)菌培養(yǎng)和質(zhì)粒擴(kuò)增； 細(xì)菌的收獲和裂解； 質(zhì)粒DNA的提取。四、遺傳轉(zhuǎn)化四、遺傳轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化是指受體細(xì)胞直接攝取供體細(xì)胞游離的DNA片段，將其同源部分進(jìn)行堿基配對(duì)，組合到自己的基因中，從而獲得供體細(xì)胞的某些遺傳性狀。(二)操作步驟：質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌1從瓊脂平板上挑取新鮮菌落接入10ml肉湯培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)過夜。2取0.5ml培養(yǎng)物接入50ml肉湯中，無菌添加0.4ml 2.5molLMgCl2，于37振蕩培養(yǎng)。3將o.1molL CaCl2溶液、試管及吸管在冰浴中冷卻。4當(dāng)培養(yǎng)物OD600在o.5o.8左右時(shí)，開始收獲細(xì)胞(大約需

39、22.5h)5將培養(yǎng)物置冰浴中冷卻10min。6取10ml培養(yǎng)物置2個(gè)冷離心管中棄去上清液。7加入1ml 0.1molL CaCl2，再加0.9ml CaCl2，置冰浴中放置20min。83000rmin離心10min，棄去上清液9加入1ml 0.1molL CaCl2，重新懸浮細(xì)胞，置冰浴中保存。10加入120l待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 DNA溶液。11在冰上放置20min，在37處理2min。再插入冰中加入0.9m1肉湯37靜置培養(yǎng)90min。12以不同的量涂布選擇培養(yǎng)基平板。13于37培養(yǎng)過夜。鑒定轉(zhuǎn)化菌落。常用的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)常用的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 1、自然系統(tǒng) 2、人工誘導(dǎo)（完整細(xì)胞）（1）二價(jià)陽離子系

40、統(tǒng)：Ca2+，Ca2+Mg2+，Mg2+，Ca2+輔助噬菌體，Tris+Ca 2+（2）單價(jià)陽離子系統(tǒng)：PEG+Li+/Cs+/Rb+（3）凍融系統(tǒng)（4）Triton處理：人工誘導(dǎo)（PEG/原生質(zhì)體）重組重組DNADNA中常用的工具酶中常用的工具酶 包括限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等.限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 切開DNA分子所需的酶：每一種酶都有其各自的作用位點(diǎn)。 常用限制性內(nèi)切酶 種類及特性W. Arber,H. O. Smith限制性內(nèi)切酶的剪切方式限制性內(nèi)切酶的剪切方式 粘性未端：切開后的兩段DNA各留下一個(gè)尾，這2個(gè)尾的核苷酸順序完全一樣，中是方向相反。它們之

41、間是互補(bǔ)的，在適當(dāng)條件下可以再連接一起。其它工具酶其它工具酶 連接酶連接酶T4 DNA 修補(bǔ)工具酶修補(bǔ)工具酶DNA聚合酶聚合酶I 末端加工酶末端加工酶S1核酸酶核酸酶 ， 堿性磷酸單脂酶堿性磷酸單脂酶 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶人工加人工加polyA 或或polyT 尾尾 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶載體宿主系統(tǒng)載體宿主系統(tǒng) 載體(vector)是攜帶外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的DNA； 一般是通過改造質(zhì)粒、噬菌體或病毒等構(gòu)建的。載體應(yīng)具備以下條件：載體應(yīng)具備以下條件： 、能在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中復(fù)制； 、具有多種限制酶的單一切點(diǎn)（即所謂多克隆位點(diǎn)）以便外源DNA插入； 、具有篩選標(biāo)志以區(qū)別陽性與陰性重組

42、分子； 、載體分子較小，以便體外基因操作，同時(shí)載體DNA與宿主DNA便于分離； 、對(duì)于表達(dá)型載體還應(yīng)具有與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)等基因表達(dá)元件。宿主細(xì)胞必須符合以下條件宿主細(xì)胞必須符合以下條件 、對(duì)載體的復(fù)制和擴(kuò)增沒有嚴(yán)格的限制； 、不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源DNA； 、在重組DNA增殖過程中，不會(huì)對(duì)它進(jìn)行修飾； 、重組缺陷型，不會(huì)產(chǎn)生體內(nèi)重組； 、容易導(dǎo)入重組DNA分子； 、符合重組DNA操作的安全標(biāo)準(zhǔn)。目的基因的獲取目的基因的獲取 一、通過建立基因文庫(kù)分離靶基因 基因文庫(kù)包括兩類：基因組文庫(kù)：利用限制性內(nèi)切酶。 cDNA：用mRNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈DNA，再經(jīng)DNA聚合酶

43、的作用產(chǎn)生雙鏈DNA?？扇コ婧松锘蛑胁槐磉_(dá)的內(nèi)含子。 二、化學(xué)合成法制備DNA片段 從蛋白質(zhì)肽鏈的氨基酸順序可以知道它的遺傳密碼，再依照密碼合成基因。 三、聚合酶鏈反應(yīng)法擴(kuò)增基因片段 對(duì)于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通過聚合酶鏈反應(yīng)（），以基因組DNA或cDNA模板擴(kuò)增得到目的基因片段。PCRPCR技術(shù)技術(shù) 根據(jù)需擴(kuò)增片段的兩端設(shè)計(jì)引物。 使DNA解鏈（高溫），引物結(jié)合于基因的兩端（低溫），在合適溫度下開始合成（鏈延長(zhǎng)）反應(yīng)。 特點(diǎn)：需要很少的DNA模板，且能直接從基因組中得到目的基因。DNADNA擴(kuò)增擴(kuò)增PCRPCR反應(yīng)反應(yīng)DNADNA片斷的克隆片斷的克隆載體的條件載體的條件

44、：a 復(fù)制起點(diǎn) b 適宜的限制酶切點(diǎn)c 選擇標(biāo)記 DNA分子的體外連接 DNA片段的體外連接是重組DNA技術(shù)的關(guān)鍵。DNA連接是由DNA連接酶催化完成的。一、一、DNADNA連接酶連接酶 DNA連接酶催化兩條雙鏈DNA片段相鄰的5-磷酸和3-羥基間形成磷酸二酯鍵。 在分子克隆中最有用的的DNA連接酶是來自噬菌體的DNA 連接酶。 T4 DNA連接酶在分子克隆中主要用于： 、連接具有同源互補(bǔ)粘性末端的片段； 、連接雙鏈DNA分子間的平端； 、在雙鏈平端的DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。重組重組DNADNA導(dǎo)入宿主菌導(dǎo)入宿主菌 體外連接的重組DNA分子必須導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中才能大量的復(fù)制

45、、增殖和表達(dá)。根據(jù)所采用的載體的性質(zhì)，將重組DNA分子導(dǎo)入受體可有不同的方法。一、轉(zhuǎn)一、轉(zhuǎn) 化化 指以細(xì)菌質(zhì)粒為載體，將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)菌必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚硎怪幱诟惺軕B(tài)即容易接受外源DNA的狀態(tài)，然后利用短暫熱休克使DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主中。 此外還可用電穿孔法轉(zhuǎn)化細(xì)菌，它的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)化效率高、適用于任何菌株。二、轉(zhuǎn)染和感染二、轉(zhuǎn)染和感染 利用噬菌體DNA作為載體時(shí)可經(jīng)兩種方式導(dǎo)入受體菌。一種是感染，即在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。另一種方式是轉(zhuǎn)染，即在DNA連接酶作用下使噬菌體DNA環(huán)化，再象重組質(zhì)粒一樣地轉(zhuǎn)化進(jìn)受體菌。但習(xí)慣上常把以噬菌

46、體DNA為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細(xì)胞的過程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染。重組克隆的篩選與鑒定重組克隆的篩選與鑒定 基因克隆的最后一步是從轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落中篩選出含有陽性重組子的菌落，并鑒定重組子的正確性。 通過細(xì)菌培養(yǎng)以及重組子的擴(kuò)增，獲得所需的基因片段的大量拷貝。進(jìn)一步研究該基因的結(jié)構(gòu)、功能，或表達(dá)該基因的產(chǎn)物。一、抗藥性標(biāo)志的篩選一、抗藥性標(biāo)志的篩選 如果克隆載體帶有某種抗藥性標(biāo)志基因如ampr或tetrr ，轉(zhuǎn)化后只有含這種抗藥基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)菌才能在含該抗菌素的平板上幸存并形成菌落，這樣就可將轉(zhuǎn)化菌與非轉(zhuǎn)化菌區(qū)別開來。如果重組DNA時(shí)將外源基因插入標(biāo)志基因內(nèi)，該標(biāo)志基因失活，通過有無抗菌素培養(yǎng)基對(duì)比培養(yǎng)，還可

47、區(qū)分單純載體或重組載體（含外源基因）的轉(zhuǎn)化菌落。二、二、半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選很多載體都攜帶一段細(xì)菌的lacZ基因，它編碼半乳糖苷酶N-端的146個(gè)氨基酸，稱為肽，它表達(dá)半乳糖苷酶的C-端肽鏈。 當(dāng)載體與宿主細(xì)胞同時(shí)表達(dá)兩個(gè)片段時(shí)，宿主細(xì)胞才有半乳糖苷酶活性，使特異的底物X-gal 變?yōu)樘m色化合物，這就是所謂的互補(bǔ)。 而重組子由于基因插入使肽基因失活，不能形成互補(bǔ)，在含X-gal的平板上，含陽性重組子的細(xì)菌為無色菌落或噬菌斑。 三、菌落快速裂解鑒定法 從平板上直接挑選菌落裂解后，直接電泳檢測(cè)載體質(zhì)粒大小，判斷有無插入片段存在，該法適于插入片段較大的重組子初篩。 四、內(nèi)切酶圖譜鑒定

48、 經(jīng)初篩鑒定有重組子的菌落，小量培養(yǎng)后，再分離出重組質(zhì)粒或重組噬菌體DNA，用相應(yīng)的內(nèi)切酶切割，釋放出插入片斷；對(duì)于可能存在雙向插入的重組子，還要用內(nèi)切酶消化鑒定插入的方向。重組重組DNADNA的鑒定的鑒定 遺傳學(xué)方法遺傳學(xué)方法第七節(jié)第七節(jié) 雜交育種雜交育種 ( (一一) )細(xì)菌雜交細(xì)菌雜交 在細(xì)菌中實(shí)現(xiàn)雜交的種類尚不多，主要是大腸桿菌，其他還有鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、淋病奈氏球菌等。 大腸桿菌中存著致育因子F，有F因子為F+，沒有F因子稱F-。 F因子存在于細(xì)胞中形式：游離狀態(tài)(F+細(xì)胞)；整合狀態(tài)，即F因子插入胞核質(zhì)的一定位置上(Hfr細(xì)胞)。 F因子有明顯的感染性，大腸桿菌的接合，

49、實(shí)質(zhì)上是F因子的轉(zhuǎn)移，所以F+和Hfr稱供體菌，而F-稱受體菌。（二）酵母雜交育種技術(shù)二）酵母雜交育種技術(shù) 1、酵母繁殖方式 酵母為單細(xì)胞型真菌，一般以出芽方式生殖，在通常情況下，繁殖體為雙倍體，但經(jīng)過特定條件的誘導(dǎo)，可使其產(chǎn)生單倍體孢子并可出芽產(chǎn)生單倍體繁殖體。 單倍體細(xì)胞具及2兩種交配型。兩種交配型細(xì)胞經(jīng)其細(xì)胞壁上特定的凝聚因子誘導(dǎo)而進(jìn)行交配，恢復(fù)為雙倍體；同一交配型細(xì)胞之間，則因細(xì)胞壁上凝集因子的存在而不能進(jìn)行交配。 在生活過程中，酵母細(xì)胞還可以形成三倍體、四倍體、多倍體或非整倍體細(xì)胞。 2、酵母雜交 一般而言，雜交育種運(yùn)用了酵母的單雙倍生活周期，將不同基因型和相對(duì)的交配型的單倍體細(xì)胞經(jīng)

50、誘導(dǎo)雜交而形成二倍體細(xì)胞，經(jīng)篩選便可獲得新的遺傳性狀。 酵母的雜交方法有孢子雜交法、群體交配法、單倍體細(xì)胞雜交法和罕見交配法。就啤酒酵母而言，運(yùn)用罕見交配法更易獲得結(jié)果。第八節(jié)第八節(jié) 原生質(zhì)體育種原生質(zhì)體育種 原生質(zhì)體育種技術(shù)主要有原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，此外尚有原生質(zhì)體誘變育種等。 原生質(zhì)休融合育種是基因重組的一種重要方法。 原生質(zhì)體融合作為一種新的基因重組手段是1978年第三屆國(guó)際工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會(huì)上提出來的。 一、原生質(zhì)體融合育種的特點(diǎn)一、原生質(zhì)體融合育種的特點(diǎn)(一)雜交頻率較高：細(xì)胞壁去除后在高滲條件下形成類似于球形的原生質(zhì)體。(二)受接合型或致育型的限制較?。憾H株中任何

51、一株都可能起受體或供體的作用，因此有利于不同種屬間微生物的雜交。(三)遺傳物質(zhì)傳遞更為完整：原生質(zhì)體融合是二親株的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核進(jìn)行類似的合二為一的過程。 (四)存在著兩株以上親株同時(shí)參與融合形成融合子的可能性。（五有可能采用產(chǎn)量性狀較高的菌株作融合親株。 (六)提高菌株產(chǎn)量的潛力較大。 (七)有助于建立工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化體系。二、原生質(zhì)體融合育種步驟二、原生質(zhì)體融合育種步驟1標(biāo)記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗(yàn)證。2原生質(zhì)體制備。3等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進(jìn)融合。4涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落。5選擇性培養(yǎng)基上劃線生長(zhǎng)，分離驗(yàn)證，挑取融合子進(jìn)一步試驗(yàn)、保藏。6生產(chǎn)性能篩選。 三、原生質(zhì)體融合育種的要點(diǎn)三、原

52、生質(zhì)體融合育種的要點(diǎn)（一）標(biāo)記菌種的選擇 獲得標(biāo)記菌種的方法是采用常規(guī)誘變育種，篩選出營(yíng)養(yǎng)缺陷型或和抗藥性菌株。這里最重要的是標(biāo)記必須穩(wěn)定。 采用抗藥性菌株除可作標(biāo)記外，在實(shí)驗(yàn)室中還可排除雜菌污染的干擾。為的是確證融合的成功，可以采用多標(biāo)記菌種。 ( (二二) )原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的制備 原生質(zhì)體的制備主要是在高滲壓溶液中加入細(xì)胞壁分解酶，將細(xì)胞壁分離剝離，結(jié)果剩下由原生質(zhì)膜包住的類似球狀的細(xì)胞，它保持原細(xì)胞的一切活性。 在放線菌和細(xì)菌中，制備原生質(zhì)體主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蝸牛酶或纖維素酶等。 影響原生質(zhì)體制備的因素影響原生質(zhì)體制備的因素1菌體的前處理 為了使酶作用的效果好一些

53、，可將菌作一些前處理。如細(xì)菌加入亞抑制劑量的青霉素。2菌體的培養(yǎng)時(shí)間 為了使細(xì)胞易于原生質(zhì)體化，一般選擇增殖期的菌體。3 酶濃度 對(duì)于不同種屬的微生物，不僅對(duì)酶的種類要求不同，就是對(duì)酶的濃度也有差異。另外，最佳酶濃度還隨不同的生長(zhǎng)期的菌體而變化。 4酶處理溫度 5破壁時(shí)的pH值 6滲透壓穩(wěn)定劑 等滲透壓在原生質(zhì)體制備中，不僅起到保護(hù)原生質(zhì)體免于膨裂，而且還有助于酶和底物的結(jié)合，滲透壓穩(wěn)定劑多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有機(jī)物和KCl和NaCl等無機(jī)物。第九節(jié)第九節(jié) 篩選新的代謝產(chǎn)物篩選新的代謝產(chǎn)物 一、開發(fā)新的代謝產(chǎn)物的途徑一、開發(fā)新的代謝產(chǎn)物的途徑 (1)從自然界分離新的微生物菌株，或采用新的

54、檢閱方法篩選新的代謝產(chǎn)物。 (2)對(duì)已知微生物的代謝產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)修飾。 (3)利用微生物轉(zhuǎn)化改造代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。 (4)通過原生質(zhì)體融合獲得新的代謝產(chǎn)物。 (5)DNA重組技術(shù)。 二、篩選微生物新的代謝產(chǎn)物二、篩選微生物新的代謝產(chǎn)物的程序的程序 突變型菌株的篩選突變型菌株的篩選 一、產(chǎn)量性狀突變株的篩選 三、篩選微生物代謝產(chǎn)物的目標(biāo)三、篩選微生物代謝產(chǎn)物的目標(biāo) 篩選克服抗生素抗性菌株的活性物質(zhì)； 篩選抗腫瘤、抗病毒的活性物質(zhì)； 研究有藥理活性的酶抑制劑及免疫調(diào)節(jié)劑； 尋找食品工業(yè)最好的酵母培養(yǎng)物； 篩選降解有害物質(zhì)的微生物以及治療上具有低毒、長(zhǎng)效的化學(xué)藥物等。 四、篩選微生物代謝產(chǎn)物的方法四、

55、篩選微生物代謝產(chǎn)物的方法 (一)直接方法 為了盡快確定微生物代謝產(chǎn)物的利用前途，在體外試驗(yàn)測(cè)得活性后，可以將培養(yǎng)液的有效成分直接作用于機(jī)體，觀察被測(cè)樣品的療效。 這種直接確定代謝產(chǎn)物用途的方法亦稱動(dòng)物體內(nèi)治療試驗(yàn)。 (二)間接方法 篩選醫(yī)用抗生素，可用細(xì)茵、真菌、病毒或腫瘤模型，尋找抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤抗生素、酶抑制劑、免疫制劑等有效物質(zhì)。 在預(yù)篩選時(shí)，多用瓊脂平扳擴(kuò)散抑菌法。通過預(yù)篩選，直接測(cè)定最初分離物的生物活性，能加速篩選過程。 五、檢測(cè)系統(tǒng)五、檢測(cè)系統(tǒng) 篩選過程的成功依賴于排除那些已知的或并非需要的代謝產(chǎn)物的檢驗(yàn)方法，這樣才能識(shí)別出人們需要的化合物。 性能簽別性能簽別 性能鑒

56、別是分離和篩選微生物代謝產(chǎn)物中最基礎(chǔ)的工作。 鑒別可分為兩方面： 一是對(duì)微生物方面進(jìn)行形態(tài)、培養(yǎng)、生化功能答試驗(yàn)觀察，并確定微生物產(chǎn)生菌的類群； 二是從化學(xué)的早期鑒別來鑒別微生物的代謝產(chǎn)物?；瘜W(xué)的早期鑒別一般對(duì)產(chǎn)生菌所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進(jìn)行紙上層析、薄板層析、紙上電泳、抗茵譜、高壓電泳、紫外分光光度法、液相和氣相色譜等試驗(yàn)，井獲得各種圖譜，與已知圖譜進(jìn)行比較鑒別。 如果認(rèn)為是有實(shí)用前途的代謝產(chǎn)物，則要進(jìn)一步大量培養(yǎng)，并進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)、毒性考查、藥物代謝等實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行提高發(fā)酵水平和改善提取工藝的工作，以備投入生產(chǎn)。 如果是新的代謝產(chǎn)物一般要進(jìn)一步確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，井在此基礎(chǔ)上進(jìn)行合成法的研究或進(jìn)行化學(xué)改

57、造，研究結(jié)構(gòu)與生物活性的相互關(guān)系，并對(duì)作用機(jī)制、生物合成過程作進(jìn)一步的研究。 菌種篩選方法菌種篩選方法 誘變處理后，突變細(xì)胞只占存活細(xì)胞的百分之幾，而能使生產(chǎn)狀況提高的細(xì)胞又只是突變細(xì)胞中的少數(shù)。 為了花費(fèi)最少的工作量，在最短的時(shí)間內(nèi)取得最大的篩選成效，就要求采用效率較高的科學(xué)篩選方案和手段。菌種篩選方案菌種篩選方案 初篩：目的是刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良菌種不致于漏網(wǎng)。初篩工作以量為主，測(cè)定的精確性還在其次。初篩的手段應(yīng)盡可能快速、簡(jiǎn)單。 復(fù)篩的目的是確認(rèn)符合生產(chǎn)要求的菌株，所以，復(fù)篩步驟以質(zhì)為主，應(yīng)精確測(cè)定每個(gè)菌株的生產(chǎn)指標(biāo)。 菌種篩選的手段菌

58、種篩選的手段 初篩 從菌體形態(tài)變異分析 平皿快速檢測(cè)法 具體的有紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生長(zhǎng)圈法和抑制圈法等 搖瓶培養(yǎng)法搖瓶培養(yǎng)法也可用于初篩。 初篩的搖瓶培養(yǎng)一般是一個(gè)菌株只做一次發(fā)酵測(cè)定，從大量菌株中選出10-20%較好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而復(fù)篩中搖瓶培養(yǎng)一般是一個(gè)菌株培養(yǎng)3瓶，選出3-5個(gè)較好的菌株，再做進(jìn)一步比較，選出最佳的菌株。 特殊變異菌的篩選方法特殊變異菌的篩選方法 營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 經(jīng)誘變處理后的菌懸液在篩選前一般應(yīng)先進(jìn)行誘變后培養(yǎng)，以促使變異細(xì)胞發(fā)生分離，防止出現(xiàn)表型延遲現(xiàn)象，篩選出不純的菌株。營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選一般包括濃縮、進(jìn)一步檢出和鑒別營(yíng)養(yǎng)缺

59、陷型等步驟。 抗性突變菌株的篩選 抗性突變株的篩選相對(duì)比較容易，只要有10-6頻率的突變體存在，就容易篩選出來?？剐酝蛔冎甑暮Y選常用的有一次性篩選法和階梯性篩選法兩種手段。 一次性篩選法 噬菌體抗性菌株、耐高溫菌株 階梯性篩選法藥物抗性突變株。 組成酶變異株的篩選 許多水解酶是誘導(dǎo)酶，只有在含有底物或底物類似物的培養(yǎng)環(huán)境中，微生物才會(huì)合成這些酶類，所以，誘導(dǎo)酶的生產(chǎn)不僅需要誘導(dǎo)物，而且受到誘導(dǎo)物的種類、數(shù)量以及分解產(chǎn)物的影響。 具體的篩選方法有恒化器法、循環(huán)培養(yǎng)法和誘導(dǎo)抑制物法。 1) 恒化器法：常被用于微生物的“馴化”。在培養(yǎng)基中添加不能起誘導(dǎo)作用的低濃度底物，菌生長(zhǎng)速率極慢，而群體中少數(shù)組

60、成型變異株則可合成有關(guān)的酶，分解利用該底物，生長(zhǎng)速率較快。 為了提高組成酶變異株的優(yōu)勢(shì)，即它在群體中的比例，可以應(yīng)用恒化器培養(yǎng)技術(shù)。隨著恒化器培養(yǎng)中不斷加入新鮮基質(zhì)而逐漸增大組成酶變異株的優(yōu)勢(shì)，這樣就能夠比較容易地做進(jìn)一步的純化分離。 2) 循環(huán)培養(yǎng)法：利用不含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)環(huán)境和含有誘導(dǎo)物的培養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行交替循環(huán)培養(yǎng)待分離的菌懸液，從而使組成酶變異株得到富集。 當(dāng)接種到不含誘導(dǎo)物而含有其它可利用碳源的培養(yǎng)基中時(shí)，兩種類型菌株同樣能較好地生長(zhǎng)，但在此環(huán)境中組成型突變株已能合成有關(guān)的水解酶，而誘導(dǎo)型菌株就不能合成。 將它們轉(zhuǎn)接入含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中時(shí)，變異株能迅速利用誘導(dǎo)底物進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，而誘導(dǎo)型出發(fā)