食品中細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)

1、第二節(jié)第二節(jié) 食品中細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)食品中細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)一、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察一、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察二、細(xì)菌的分離與培養(yǎng)技術(shù)二、細(xì)菌的分離與培養(yǎng)技術(shù)三、細(xì)菌的生化反應(yīng)三、細(xì)菌的生化反應(yīng)食品衛(wèi)生細(xì)菌常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目食品衛(wèi)生細(xì)菌常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目 衛(wèi)生指標(biāo)菌衛(wèi)生指標(biāo)菌大腸菌群測(cè)定大腸菌群測(cè)定菌落總數(shù)測(cè)定菌落總數(shù)測(cè)定 沙門氏菌檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)志賀氏菌檢驗(yàn)志賀氏菌檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)溶血性鏈球菌檢驗(yàn)溶血性鏈球菌檢驗(yàn)致病菌致病菌1、細(xì)菌的顯微鏡檢查、細(xì)菌的顯微鏡檢查l顯微鏡：光學(xué)顯微鏡l放大倍數(shù)：101001000l鏡頭：油鏡頭l鏡油：香柏油或石蠟油l香柏油折光率（n1.515）與玻片折光率（n

2、1.52）接近l顯微鏡使用完畢須擦拭鏡頭。一、細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查一、細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查（1）不染色標(biāo)本檢查）不染色標(biāo)本檢查l應(yīng)用：主要用于觀察活菌的動(dòng)力和形態(tài)l常用方法：壓滴法、懸滴法載玻片載玻片細(xì)菌懸液細(xì)菌懸液蓋玻片蓋玻片壓滴法壓滴法接種環(huán)取細(xì)菌接種環(huán)取細(xì)菌菌懸液菌懸液23環(huán)環(huán)鑷子取蓋玻片鑷子取蓋玻片覆蓋于菌液上覆蓋于菌液上載玻片中央載玻片中央注意注意：使蓋玻片先接觸菌液，緩慢放下，避：使蓋玻片先接觸菌液，緩慢放下，避 免產(chǎn)生氣泡免產(chǎn)生氣泡鏡檢鏡檢懸滴法懸滴法取一凹玻片，在凹取一凹玻片，在凹窩周圍涂凡士林窩周圍涂凡士林蓋玻片中央放蓋玻片中央放1環(huán)菌液環(huán)菌液凹玻片倒置于蓋玻片，凹凹玻片倒置于蓋玻片，凹

3、窩到準(zhǔn)蓋玻片中央菌液窩到準(zhǔn)蓋玻片中央菌液反轉(zhuǎn)蓋玻片，輕壓，使其反轉(zhuǎn)蓋玻片，輕壓，使其與凹窩邊緣黏緊與凹窩邊緣黏緊有鞭毛的菌，可看到其移動(dòng)有鞭毛的菌，可看到其移動(dòng)（2）染色標(biāo)本的檢查）染色標(biāo)本的檢查染色方法的種類l單染法單染法:采用一種染料染色l復(fù)染法復(fù)染法（鑒別染色）:采用兩種或兩種以上的不同染料進(jìn)行先后染色，使不同種類的細(xì)菌、同種細(xì)菌的不同結(jié)構(gòu)，分別染上不同的顏色，以便鑒別細(xì)菌。染色標(biāo)本檢查的基本程序染色標(biāo)本檢查的基本程序l涂片干燥固定染色涂片方式：菌液、菌苔干燥的方法：自然干燥、外焰烘干固定的方法、目的染料種類：堿性染料、酸性染料、中性染料，堿性染料最常用復(fù)染法基本程序復(fù)染法基本程序l初染

4、媒染脫色復(fù)染革蘭染色法（革蘭染色法（Gram染色）染色）l染液組成： 結(jié)晶紫染液、盧戈碘液、95乙醇、稀釋復(fù)紅l染色方法：結(jié)晶紫結(jié)晶紫 初染初染盧戈碘液盧戈碘液 媒染媒染95乙醇乙醇 脫色脫色稀釋復(fù)紅稀釋復(fù)紅 復(fù)染復(fù)染1分鐘分鐘30S1min1分鐘分鐘影響革蘭染色的關(guān)鍵步驟是影響革蘭染色的關(guān)鍵步驟是脫色脫色革蘭染色結(jié)果革蘭染色結(jié)果l紫色革蘭陽(yáng)性菌l紅色革蘭陰性菌革蘭陰性菌革蘭陰性菌革蘭陽(yáng)性菌革蘭陽(yáng)性菌革蘭染色意義革蘭染色意義有助于鑒別細(xì)菌有助于選擇用藥有助于了解細(xì)菌的致病性影響革蘭染色的因素影響革蘭染色的因素l操作因素操作因素 涂片的厚薄 脫色時(shí)間的長(zhǎng)短l染液因素染液因素 盧戈碘液放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)

5、 95乙醇揮發(fā) 結(jié)晶紫與草酸銨混合時(shí)間太長(zhǎng)l細(xì)菌因素細(xì)菌因素 細(xì)菌種類 細(xì)菌菌齡抗酸染色抗酸染色l用于區(qū)別抗酸菌與非抗酸菌細(xì)菌特殊染色細(xì)菌特殊染色白喉?xiàng)U菌異染粒 傷寒桿菌 負(fù)染色法負(fù)染色法肺炎鏈球菌莢膜負(fù)染色2、微生物直接計(jì)數(shù)、微生物直接計(jì)數(shù)l儀器：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 l菌種：釀酒酵母 l原理原理：利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，常用的微生物計(jì)數(shù)法。將經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的菌懸將經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的菌懸液（或孢子懸液）放在計(jì)數(shù)板載玻片與蓋玻片液（或孢子懸液）放在計(jì)數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下計(jì)數(shù)。之間的計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下計(jì)數(shù)。根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目微生物數(shù)目來(lái)?yè)Q算成來(lái)?yè)Q算成單位體積

6、單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目?jī)?nèi)的微生物總數(shù)目。l優(yōu)點(diǎn)：直觀、快速。l缺點(diǎn)：計(jì)得的是活菌體和死菌體的總和，又稱為總菌計(jì)數(shù)法。每個(gè)大方格中的小方格數(shù)相同，即每個(gè)大方格中的小方格數(shù)相同，即1625=400小方格小方格 每個(gè)計(jì)數(shù)室選每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)（或個(gè)（或4個(gè)）中格中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。個(gè)）中格中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。 1mL菌液的菌數(shù)菌液的菌數(shù)=每小格內(nèi)菌數(shù)每小格內(nèi)菌數(shù)4106稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù) （一）培養(yǎng)基（一）培養(yǎng)基l常用玻璃器材的準(zhǔn)備l培養(yǎng)基的成分和作用l培養(yǎng)基的種類l培養(yǎng)基的制備二、細(xì)菌的培養(yǎng)與分離技術(shù)二、細(xì)菌的培養(yǎng)與分離技術(shù)常用玻璃器材的準(zhǔn)備常用玻璃器材的準(zhǔn)備l玻璃器材的種類及用途l玻璃器材的清洗新購(gòu)置

7、的：12鹽酸浸泡清水清洗用過(guò)的無(wú)污染器皿：洗滌劑洗刷清水清洗l細(xì)菌污染的器材：消毒滅菌后再洗刷盛培養(yǎng)基試管和平皿：高壓滅菌趁熱倒出洗滌劑洗刷清水沖洗吸管：3來(lái)蘇浸泡清水沖洗玻片和蓋玻片：3來(lái)蘇和清潔液浸泡清水沖洗；染色后的玻片，應(yīng)肥皂水煮沸10min再洗滌含油脂的器皿：?jiǎn)为?dú)滅菌培養(yǎng)基的成分和作用培養(yǎng)基的成分和作用l培養(yǎng)基：是指人工配制的適合細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的綜合營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。l營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖醇類、血液、雞蛋和動(dòng)物血清、生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽類l水l凝固劑：瓊脂、明膠l抑制劑l指示劑培養(yǎng)基的種類培養(yǎng)基的種類（按用途分類按用途分類）l基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基：培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)要求不高的細(xì)菌，如普通平板

8、l營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：能滿足營(yíng)養(yǎng)需求較高細(xì)菌的生長(zhǎng)，如血平板l鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基：含有某些特定的底物，用于鑒別細(xì)菌，如克氏雙糖培養(yǎng)基（KIA）l選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基：具有選擇性抑制作用，用于選擇性的培養(yǎng)目的菌，如SS平板l增菌培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)基：促進(jìn)目的菌的生長(zhǎng)，適用于含菌量較少的標(biāo)本，如葡萄糖肉湯。l厭氧培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)厭氧菌培養(yǎng)基的種類培養(yǎng)基的種類（按物理性狀分類按物理性狀分類）l液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基：不含凝固劑，用于增菌和接種純種細(xì)菌。l半固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基：含0.30.7瓊脂，用于觀察細(xì)菌的動(dòng)力。l固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基：含22.5瓊脂，多用于細(xì)菌的分離培養(yǎng)。培養(yǎng)基制備的

9、一般程序培養(yǎng)基制備的一般程序調(diào)配調(diào)配溶化溶化矯正矯正pH過(guò)濾澄清過(guò)濾澄清分裝分裝滅菌滅菌檢定檢定培養(yǎng)基滅菌培養(yǎng)基滅菌 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基：121高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌15分鐘分鐘 含糖培養(yǎng)基：含糖培養(yǎng)基：113 滅菌滅菌15分鐘分鐘 雞蛋、血清培養(yǎng)基：間歇滅菌雞蛋、血清培養(yǎng)基：間歇滅菌3天天3次次 不耐高溫的液體成分：濾過(guò)除菌不耐高溫的液體成分：濾過(guò)除菌保存保存培養(yǎng)基培養(yǎng)基pH測(cè)定及矯正測(cè)定及矯正 材料：l待測(cè)培養(yǎng)基、lpH7.4標(biāo)準(zhǔn)比色管、4孔比色架、0.02酚紅、l氫氧化鈉0.1mol/L、1mol/L） l鹽酸（0.1mol/L、1mol/L）l蒸餾水l試管（與比色管口徑一致）、l

10、刻度吸管（5ml、1ml、0.5ml、0.25ml）、（二）細(xì)菌的接種與培養(yǎng)（二）細(xì)菌的接種與培養(yǎng)l無(wú)菌技術(shù)l細(xì)菌檢驗(yàn)的操作需在無(wú)菌室或超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。l無(wú)菌室、超凈工作臺(tái)使用前后需進(jìn)行消毒。l細(xì)菌檢驗(yàn)使用的物品使用前后需嚴(yán)格滅菌l標(biāo)本的采集l無(wú)菌試管、燒瓶的使用細(xì)菌接種的基本程序細(xì)菌接種的基本程序滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)沾取標(biāo)本沾取標(biāo)本接種接種滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)殺滅接種環(huán)沾染的細(xì)菌，以免污染標(biāo)本殺滅接種環(huán)沾染的細(xì)菌，以免污染標(biāo)本殺滅接種環(huán)沾染的細(xì)菌，以免污染環(huán)境殺滅接種環(huán)沾染的細(xì)菌，以免污染環(huán)境細(xì)菌接種法細(xì)菌接種法l平板劃線接種法平板劃線接種法： 目的：使混合的細(xì)菌呈單個(gè)分散生長(zhǎng)，形成單個(gè)菌

11、落，以便獲得純菌。 方法：分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標(biāo)本連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標(biāo)本l液體培養(yǎng)基接種法液體培養(yǎng)基接種法l穿刺接種法穿刺接種法 :用于觀察細(xì)菌動(dòng)力用于觀察細(xì)菌動(dòng)力l斜面接種法斜面接種法 l傾注培養(yǎng)法傾注培養(yǎng)法:用于細(xì)菌計(jì)數(shù)分區(qū)劃線法分區(qū)劃線法第一區(qū)劃線第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)連續(xù)劃線法連續(xù)劃線法細(xì)菌培養(yǎng)法細(xì)菌培養(yǎng)法l一般培養(yǎng)（需氧培養(yǎng)）：培養(yǎng)溫度：37（采用恒溫培養(yǎng)箱）培養(yǎng)時(shí)間：1824hl厭氧培養(yǎng)法：厭氧培養(yǎng)箱、厭氧袋、厭氧罐、皰肉培養(yǎng)法、硫乙醇酸鹽法等細(xì)菌在細(xì)菌在固體固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象l菌落定義：指單個(gè)細(xì)菌在平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖，形成單一肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌集團(tuán)。菌落特征：大小、形狀、邊緣、顏色、表面、透明度、濕潤(rùn)度、黏度、溶血性菌落類型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型（M）l菌苔：指多個(gè)菌落融合在一起形成的細(xì)菌堆積物。細(xì)菌在細(xì)菌在液體液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象l混濁l沉淀：多見(jiàn)于鏈狀排列的細(xì)菌l菌膜：多見(jiàn)于