生物技術(shù)之層析技術(shù)

1、生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)常用研究技術(shù)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)常用研究技術(shù)層析技術(shù)層析技術(shù)引 言1850年德國(guó)科學(xué)家朗格首先發(fā)現(xiàn)了色譜分離的現(xiàn)象，當(dāng)他把一種有顏色的物質(zhì)滴到一張濾紙上，觀察到它們擴(kuò)散成一圈一圈的圓環(huán)。層析法也稱色譜法，是1906年俄國(guó)植物學(xué)家茨維特（Michael Tswett）發(fā)現(xiàn)并命名的。他將碳酸鈣細(xì)粉裝入玻璃管內(nèi)使其成柱形， 然后把石油醚抽提的植物葉子的色素溶液傾入，讓其通過(guò)碳酸鈣柱，接著用石油醚洗滌，于是奇跡出現(xiàn)了，在吸附柱的不同部位出現(xiàn)了綠色的葉綠素， 黃色的葉黃素和胡蘿卜素，混合物的不同色素組分得到了分離。當(dāng)時(shí)茨維特把這種色帶叫作“色譜”，茨維特把他開(kāi)創(chuàng)的方法叫色譜法（Chromatogra

2、phy) 。4 層析技術(shù)（層析技術(shù)（chromatographychromatography）又稱）又稱色譜技術(shù)色譜技術(shù)、層離技層離技術(shù)術(shù)等，是一組相關(guān)技術(shù)的總稱。等，是一組相關(guān)技術(shù)的總稱。 層析技術(shù)是利用混合物中各組分的層析技術(shù)是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)( (分分子的形狀和大小、分子極性、吸附力、分子親和力、分子的形狀和大小、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)配系數(shù)等等) )的不同，使各組分以不同程度分布在的不同，使各組分以不同程度分布在固定相固定相和和流動(dòng)相流動(dòng)相中，當(dāng)流動(dòng)相流過(guò)固定相時(shí)，各組分以不同的速中，當(dāng)流動(dòng)相流過(guò)固定相時(shí)，各組分以不同的速度移動(dòng)，而達(dá)到分離的

3、技術(shù)。度移動(dòng)，而達(dá)到分離的技術(shù)。 5 層析技術(shù)具有分離精度高、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方層析技術(shù)具有分離精度高、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，樣品可多可少，既可用于實(shí)驗(yàn)室的便等優(yōu)點(diǎn)，樣品可多可少，既可用于實(shí)驗(yàn)室的研究工作，又可用于工業(yè)生產(chǎn)，研究工作，又可用于工業(yè)生產(chǎn)， 還可與其他還可與其他分析儀器配合，組成各種自動(dòng)分析儀器。分析儀器配合，組成各種自動(dòng)分析儀器。 層析技術(shù)是當(dāng)前獲得高純度產(chǎn)物最有效的分離層析技術(shù)是當(dāng)前獲得高純度產(chǎn)物最有效的分離純化技術(shù)。純化技術(shù)。 6主要內(nèi)容主要內(nèi)容第一節(jié)第一節(jié) 概述概述第二節(jié)第二節(jié) 凝膠層析技術(shù)凝膠層析技術(shù)第三節(jié)第三節(jié) 離子交換層析技術(shù)離子交換層析技術(shù)第四第四節(jié)節(jié) 吸附層析技

4、術(shù)吸附層析技術(shù)第五節(jié)第五節(jié) 親和層析技術(shù)親和層析技術(shù)7第一節(jié)第一節(jié) 概述概述一、基本概念一、基本概念層析系統(tǒng)：層析系統(tǒng)：任何層析過(guò)程都是在兩個(gè)相中進(jìn)行的，一個(gè)是固任何層析過(guò)程都是在兩個(gè)相中進(jìn)行的，一個(gè)是固定于支持物上的定于支持物上的固定相固定相，另一個(gè)是流經(jīng)固定相的，另一個(gè)是流經(jīng)固定相的流動(dòng)相流動(dòng)相，層析系統(tǒng)就是由固定相和流動(dòng)相組成的。，層析系統(tǒng)就是由固定相和流動(dòng)相組成的。當(dāng)流動(dòng)相流過(guò)加有樣品的固定相時(shí)，由于樣品中當(dāng)流動(dòng)相流過(guò)加有樣品的固定相時(shí)，由于樣品中各組分的理化性質(zhì)的差異，各組分的理化性質(zhì)的差異，受固定相的阻力與流受固定相的阻力與流動(dòng)相的推力的影響不同動(dòng)相的推力的影響不同，因而各組分在固

5、定相與，因而各組分在固定相與流動(dòng)相之間的分布（含量對(duì)比）不同，從而使各流動(dòng)相之間的分布（含量對(duì)比）不同，從而使各組分以不同的速率移動(dòng)，達(dá)到分離物質(zhì)的目的。組分以不同的速率移動(dòng)，達(dá)到分離物質(zhì)的目的。8第一節(jié)第一節(jié) 概述概述配合相應(yīng)的光學(xué)、電學(xué)和電化學(xué)檢測(cè)手段，可用于定性、定配合相應(yīng)的光學(xué)、電學(xué)和電化學(xué)檢測(cè)手段，可用于定性、定量和純化某種物質(zhì)，其純度高達(dá)量和純化某種物質(zhì)，其純度高達(dá)99%99%。固定相固定相 固定相是由層析介質(zhì)組成。它可以是固體物質(zhì)（如吸附固定相是由層析介質(zhì)組成。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如

6、固定在纖維素或硅膠上的溶液），但這個(gè)液體必須附載在某個(gè)在纖維素或硅膠上的溶液），但這個(gè)液體必須附載在某個(gè)固體物質(zhì)上，該物質(zhì)稱為載體或擔(dān)體（固體物質(zhì)上，該物質(zhì)稱為載體或擔(dān)體（supportsupport）。這些）。這些基質(zhì)能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附，溶解，交換等基質(zhì)能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附，溶解，交換等作用。它對(duì)層析的效果起著關(guān)鍵的作用。作用。它對(duì)層析的效果起著關(guān)鍵的作用。9基本概念基本概念流動(dòng)相流動(dòng)相 在層析過(guò)程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)向一定方向移動(dòng)在層析過(guò)程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)向一定方向移動(dòng)的液體、氣體或超臨界體等，都稱為流動(dòng)相。柱層析中一般稱的液體、氣體或超臨界體

7、等，都稱為流動(dòng)相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時(shí)稱為展層劑。為洗脫劑，薄層層析時(shí)稱為展層劑。它也是層析分離中的重要它也是層析分離中的重要影響因素之一。影響因素之一。 固定相與流動(dòng)相，兩相互不相溶固定相與流動(dòng)相，兩相互不相溶10 層析法是基于被分離物質(zhì)的層析法是基于被分離物質(zhì)的物理物理、化學(xué)化學(xué)及及生物學(xué)特性生物學(xué)特性的不同，使混合物中各組分以不同程度分布在固定相和流的不同，使混合物中各組分以不同程度分布在固定相和流動(dòng)相中，并使各組分以不同速率移動(dòng)，從而達(dá)到分離的目動(dòng)相中，并使各組分以不同速率移動(dòng)，從而達(dá)到分離的目的。的。二、基本原理二、基本原理11柱層析系統(tǒng)的基本組成柱層析系統(tǒng)的基本組成F

8、層析柱層析柱+ +層析劑層析劑F上樣洗脫系統(tǒng)上樣洗脫系統(tǒng)F檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)F收集系統(tǒng)收集系統(tǒng)三通閥三通閥收集器收集器檢測(cè)器檢測(cè)器泵泵泵泵流動(dòng)相流動(dòng)相料液料液DCBA層析柱層析柱（a）層析系統(tǒng)基本組成）層析系統(tǒng)基本組成12時(shí)間（或流出體體積）時(shí)間（或流出體體積）流出組分濃度流出組分濃度A B C D 層析劑選擇和預(yù)處理層析劑選擇和預(yù)處理 裝柱裝柱 平衡平衡 上樣上樣 洗脫洗脫 檢測(cè)檢測(cè) 收集收集層析劑再生和保存層析劑再生和保存柱層析的基本操作柱層析的基本操作（b）分離出組分峰圖）分離出組分峰圖(1)分辨力高(2)分析效率高(3)靈敏度高(4)操作簡(jiǎn)便，應(yīng)用廣泛局限性：在定量分析中需要純制得標(biāo)準(zhǔn)物

9、質(zhì)；不能精確地解決物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)問(wèn)題三、層析法的特點(diǎn)三、層析法的特點(diǎn)氣氣- -固固( (GSC) 氣氣- -液液(GLC)液液- -固固( (LSC) 液液- -液液(LLC)1. 1. 按流動(dòng)相的形式不同按流動(dòng)相的形式不同氣氣相相層層析析G GC C液液相相層層析析LCLC以氣體作為流動(dòng)相以氣體作為流動(dòng)相以液體作為流動(dòng)相以液體作為流動(dòng)相四、層析技術(shù)分類四、層析技術(shù)分類2.2.按層析的原理可分為按層析的原理可分為吸附層析分配層析凝膠層析親和層析離子交換層析 層析技術(shù)分類層析技術(shù)分類3.3.按操作形式不同按操作形式不同柱層析平面層析：包括紙層析、薄層層析、薄膜層析等 層析技術(shù)分類層析技術(shù)分類是將

10、固定相裝在柱內(nèi)，使樣品沿一是將固定相裝在柱內(nèi)，使樣品沿一個(gè)方向移動(dòng)，以達(dá)到分離目的。個(gè)方向移動(dòng)，以達(dá)到分離目的。是用濾紙作為液體的載體，點(diǎn)樣后，是用濾紙作為液體的載體，點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開(kāi)，使組分達(dá)到分離。用流動(dòng)相展開(kāi)，使組分達(dá)到分離。是將適當(dāng)粒度的固定相均勻涂鋪在是將適當(dāng)粒度的固定相均勻涂鋪在薄板上。點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開(kāi)，薄板上。點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開(kāi)，使組分達(dá)到分離。使組分達(dá)到分離。是將適當(dāng)?shù)母叻肿佑袡C(jī)吸附劑制成是將適當(dāng)?shù)母叻肿佑袡C(jī)吸附劑制成薄膜，以類似紙層析的方法進(jìn)行物薄膜，以類似紙層析的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離。質(zhì)的分離。17第二節(jié)第二節(jié) 常用的層析方法常用的層析方法凝膠層析凝膠層析離子交換層

11、析離子交換層析親和層析親和層析吸附層析吸附層析分配分配層析層析（一）凝膠層析（一）凝膠層析又稱為凝膠排阻層析、分子篩層析、凝膠過(guò)濾法等又稱為凝膠排阻層析、分子篩層析、凝膠過(guò)濾法等 。 是指混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)裝有凝膠作固定相的層析是指混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)裝有凝膠作固定相的層析柱時(shí)，混合物中各種物質(zhì)因柱時(shí)，混合物中各種物質(zhì)因分子大小不同分子大小不同而被分離純化而被分離純化的技術(shù)。的技術(shù)。凝膠層析柱中裝填著許多直徑小于1mm的凝膠顆粒，顆粒內(nèi)部不是實(shí)心的，而是三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 1 1. .凝膠層析的原理凝膠層析的原理固定相（凝膠）固定相（凝膠）三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠層凝膠層析法析法固固

12、定定相相流流動(dòng)動(dòng)相相小分子小分子被延被延滯滯小分子小分子大分子大分子較較快流出快流出分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)：分子大小不同分子大小不同, ,在凝膠受到的在凝膠受到的阻滯作用有差阻滯作用有差異異, ,從而造成各從而造成各組分在凝膠柱組分在凝膠柱中的遷移速度中的遷移速度不同得到分離。不同得到分離。在洗脫過(guò)程中，混合物樣品流經(jīng)凝膠柱，大分子物質(zhì)因其直徑大于凝膠網(wǎng)孔的孔徑，不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能沿著凝膠顆粒的空隙隨溶劑流動(dòng)，流程短而移動(dòng)速度快，先流出層析柱；小分子組分由于其分子直徑小于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔徑，可進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，流程長(zhǎng)而移動(dòng)速度慢，比大分子物質(zhì)后流出層析柱，分子大小不同的混合物因此得到分離。

13、1 1. .凝膠層析的原理凝膠層析的原理凝膠層析凝膠層析不同大小的分子流過(guò)多孔凝膠不同大小的分子流過(guò)多孔凝膠分子大的組分先流分子大的組分先流出，分子小的組分后流出出，分子小的組分后流出各組分便按分子從大到各組分便按分子從大到小的順序依次流出小的順序依次流出2.2.凝膠層析的介質(zhì)凝膠層析的介質(zhì)凝膠是一種多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)。層析用的凝膠一般都呈球形，顆粒的大小通常以目數(shù)來(lái)表示。層析的分辨率和流速與凝膠顆粒大小有關(guān)。顆粒大，流速快，但分離效果差；顆粒小，分離效果較好，但流速慢。一般常用的是100200目。目前常用的有交聯(lián)葡聚糖凝膠，交聯(lián)瓊脂糖凝膠，丙烯酰胺凝膠，聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠以及Superdex

14、。27 p是最傳統(tǒng)的凝膠介質(zhì)。是最傳統(tǒng)的凝膠介質(zhì)。p由天然高分子葡聚糖與其它交聯(lián)劑由天然高分子葡聚糖與其它交聯(lián)劑(3-(3-氯氯-1,2-1,2環(huán)氧丙烷環(huán)氧丙烷) )交聯(lián)而成的凝膠。國(guó)外商品名為交聯(lián)而成的凝膠。國(guó)外商品名為SephadexSephadex。p主要由主要由Pharmacia BiotechPharmacia Biotech生產(chǎn)。常見(jiàn)的有三類：生產(chǎn)。常見(jiàn)的有三類： Sephadex Sephadex G G系列系列、Sephacryl Sephacryl S S 系列系列和和Sephadex Sephadex LHLH系列系列。 （1 1）葡聚糖凝膠：）葡聚糖凝膠：p結(jié)構(gòu)：基本骨架

15、：葡聚糖（dextran）交聯(lián)劑：3-氯代-1,2-環(huán)氧氯丙烷使葡聚糖之間通過(guò)醚鍵交聯(lián)聚合而成的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。葡聚糖凝膠：葡聚糖凝膠：p凝膠型號(hào)與交聯(lián)度、吸水量的關(guān)系：凝膠型號(hào)與交聯(lián)度、吸水量的關(guān)系：交聯(lián)度：如交聯(lián)度：如Sephadex G25, G50, G100,Sephadex G25, G50, G100,數(shù)字越小，交聯(lián)度越大，凝數(shù)字越小，交聯(lián)度越大，凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密。膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密。吸水量與數(shù)字關(guān)系：如吸水量與數(shù)字關(guān)系：如G25G25，表示吸水量為，表示吸水量為1g1g干膠吸水干膠吸水2.5g.2.5g.29（2 2）瓊脂糖凝膠）瓊脂糖凝膠p交聯(lián)瓊脂糖凝膠是由瓊脂糖與交聯(lián)瓊脂

16、糖凝膠是由瓊脂糖與1,3-1,3-二溴異丙醇交聯(lián)二溴異丙醇交聯(lián)而成的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。商品名為而成的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。商品名為SepharoseCLSepharoseCL。 p此類產(chǎn)品通常有此類產(chǎn)品通常有Sepharose2B Sepharose2B 、Sepharose4BSepharose4B、 Sepharose6BSepharose6B三種，分別代表含瓊脂糖凝膠三種，分別代表含瓊脂糖凝膠2%2%、4%4%、6%6%的凝膠。的凝膠。p該凝膠具有良好的機(jī)械性能，分辨率高，分離范圍該凝膠具有良好的機(jī)械性能，分辨率高，分離范圍廣，廣泛用于蛋白質(zhì)的分離純化和親和層析的載體。廣，廣泛用于蛋白質(zhì)的分離純化和

17、親和層析的載體。30 （3 3） 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠p 丙烯酰胺與丙烯酰胺與N,N-N,N-亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。商品名亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。商品名為為Bio-GelBio-Gel。改變亞甲基雙丙烯酰胺的濃度，就可以得。改變亞甲基雙丙烯酰胺的濃度，就可以得到不同交聯(lián)度的產(chǎn)物。到不同交聯(lián)度的產(chǎn)物。p 聚聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍、吸水率等性能基本近似于丙烯酰胺凝膠的分離范圍、吸水率等性能基本近似于SephadexSephadex。p pHpH為為211211之間比較穩(wěn)定，能耐受強(qiáng)去垢劑與變性劑的影之間比較穩(wěn)定，能耐受強(qiáng)去垢劑與變性劑的影響響L;L;非常親水，基本不帶電荷，吸附效應(yīng)

18、較小非常親水，基本不帶電荷，吸附效應(yīng)較小, ,流速快，流速快，分辨率高。分辨率高。p 不會(huì)象葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠那樣可能生長(zhǎng)微生物。不會(huì)象葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠那樣可能生長(zhǎng)微生物。p 丙烯酰胺凝膠商品型號(hào)有丙烯酰胺凝膠商品型號(hào)有Bio-gelP-2Bio-gelP-2到到Bio-gelP-300Bio-gelP-300等等1010種，其阿拉伯?dāng)?shù)字表示排阻極限。種，其阿拉伯?dāng)?shù)字表示排阻極限。由由丙烯?；暇厶潜；暇厶桥c與甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺共聚生成的剛性共聚生成的剛性凝膠，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，有良好的機(jī)械性能，可高溫消凝膠，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，有良好的機(jī)械性能，可高溫消毒，分辨率高，毒，分辨

19、率高，廣泛用于蛋白質(zhì)的分離與提純廣泛用于蛋白質(zhì)的分離與提純。 （4 4）SephacrylSephacryl凝膠：凝膠：一種由一種由PhamaricaPhamarica公司生產(chǎn)的新型凝膠過(guò)濾介質(zhì)，有高公司生產(chǎn)的新型凝膠過(guò)濾介質(zhì)，有高交聯(lián)度多孔交聯(lián)度多孔瓊脂糖瓊脂糖與與葡聚糖葡聚糖共價(jià)結(jié)合而成，共價(jià)結(jié)合而成，是目前分是目前分辨率和選擇性最高的凝膠過(guò)濾介質(zhì)辨率和選擇性最高的凝膠過(guò)濾介質(zhì)。其物理化學(xué)性質(zhì)。其物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，能耐受強(qiáng)去垢劑與變性劑的影響，可高溫消毒穩(wěn)定，能耐受強(qiáng)去垢劑與變性劑的影響，可高溫消毒，流速快，分辨率高。現(xiàn)有，流速快，分辨率高?，F(xiàn)有Superdex30Superdex30 S

20、uperdex75 Superdex75 Superdex200Superdex200三種型號(hào)。三種型號(hào)。 （5 5）SuperdexSuperdex： 生物大分子的純化生物大分子的純化 分子量測(cè)定分子量測(cè)定 脫鹽及去除小分子雜質(zhì)脫鹽及去除小分子雜質(zhì) 3.3.凝膠層析的應(yīng)用凝膠層析的應(yīng)用凝膠層析的優(yōu)點(diǎn)凝膠層析的優(yōu)點(diǎn) 凝膠是一種不帶電荷的惰凝膠是一種不帶電荷的惰性載體，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。性載體，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。操作條件較溫和。操作條件較溫和。(1)(1)樣品得率高，重復(fù)性好，樣品得率高，重復(fù)性好，可進(jìn)行大量樣品的分離純可進(jìn)行大量樣品的分離純化?；Ｄz層析的缺點(diǎn)凝膠層析的缺點(diǎn)要求樣品和洗脫液的粘度很要求樣品和

21、洗脫液的粘度很低。低。凝膠顆粒網(wǎng)絡(luò)孔徑大小非常凝膠顆粒網(wǎng)絡(luò)孔徑大小非常有限有限, ,所以可被純化的物質(zhì)的所以可被純化的物質(zhì)的分子量范圍受到限制。分子量范圍受到限制。(1)(1)凝膠結(jié)構(gòu)對(duì)某些溶質(zhì)分子具凝膠結(jié)構(gòu)對(duì)某些溶質(zhì)分子具有吸附作用。有吸附作用。4. 4. 凝膠層析的特點(diǎn)凝膠層析的特點(diǎn)（二）（二）離子交換層析離子交換層析 離子交換層析是在以離子交換層析是在以離子交換劑離子交換劑為固定相。利用其對(duì)為固定相。利用其對(duì)需要分離的需要分離的各種離子結(jié)合力的差異各種離子結(jié)合力的差異而將混合物中的不同離而將混合物中的不同離子進(jìn)行分離的層析技術(shù)。子進(jìn)行分離的層析技術(shù)。 此法廣泛應(yīng)用于很多生化物質(zhì)此法廣泛應(yīng)

22、用于很多生化物質(zhì)( (例如氨基酸、多肽、例如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、糖類、核苷和有機(jī)酸等蛋白質(zhì)、糖類、核苷和有機(jī)酸等) )的分析、制備、純化，的分析、制備、純化，以及溶液的中和、脫色等方面。以及溶液的中和、脫色等方面。 離子交換層析是用離子交換層析是用離子交換劑離子交換劑（具有離子交換性能（具有離子交換性能的物質(zhì)）的物質(zhì)）作固定相作固定相，利用它與流動(dòng)相中的某種離子進(jìn)行，利用它與流動(dòng)相中的某種離子進(jìn)行可逆的交換可逆的交換性質(zhì)來(lái)分離性質(zhì)來(lái)分離離子型混合物離子型混合物的層析方法。的層析方法。 依據(jù)各種依據(jù)各種離子或離子化合物離子或離子化合物與與離子交換離子交換劑劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行分離純化。的結(jié)合力

23、不同而進(jìn)行分離純化。 1 1. .離子交換層析的基本原理離子交換層析的基本原理離子交換層析的基本原理離子交換層析的基本原理離子交換劑離子交換劑不溶于水的帶有電荷基團(tuán)的惰性高分子不溶于水的帶有電荷基團(tuán)的惰性高分子聚合物。聚合物。包括包括基質(zhì)基質(zhì)、電荷基團(tuán)電荷基團(tuán)( (或功能基團(tuán)或功能基團(tuán)) )和和反離子反離子三三部分。部分。離子交換劑的基質(zhì)是一類具有特殊網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的聚合離子交換劑的基質(zhì)是一類具有特殊網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的聚合物顆粒，其物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于水和許多有機(jī)溶物顆粒，其物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于水和許多有機(jī)溶劑。劑?；|(zhì)上交聯(lián)有較多的酸性或堿性基團(tuán)基質(zhì)上交聯(lián)有較多的酸性或堿性基團(tuán)，這些酸性或

24、，這些酸性或堿性基團(tuán)通過(guò)靜電作用可結(jié)合帶堿性基團(tuán)通過(guò)靜電作用可結(jié)合帶相反電荷的離子相反電荷的離子（反離（反離子）。當(dāng)流動(dòng)相中存在帶電荷的離子時(shí)，就可與先結(jié)合子）。當(dāng)流動(dòng)相中存在帶電荷的離子時(shí)，就可與先結(jié)合在離子交換劑上的反離子進(jìn)行可逆的交換。在離子交換劑上的反離子進(jìn)行可逆的交換。纖維素纖維素 O O CH CH2 2 COOCOO- -NaNa+ +纖維素陽(yáng)離子交換劑組成示意圖纖維素陽(yáng)離子交換劑組成示意圖p根據(jù)可交換離子的性質(zhì)，離子交換劑分為根據(jù)可交換離子的性質(zhì)，離子交換劑分為陽(yáng)離子交換劑陽(yáng)離子交換劑和和陰離子交換劑。陰離子交換劑。p陽(yáng)離子交換劑：交聯(lián)酸性基團(tuán)，能和流動(dòng)相中的陽(yáng)離子交換。例如：

25、陽(yáng)離子交換劑：交聯(lián)酸性基團(tuán)，能和流動(dòng)相中的陽(yáng)離子交換。例如： R-SOR-SO3 3- -H H+ +Na+Na+ +R-SOR-SO3 3- -NaNa+ +H+H+ +膠膠體體膠膠體體p陰離子交換劑：交聯(lián)堿性基團(tuán)，能和流動(dòng)相中的陰離子陰離子交換劑：交聯(lián)堿性基團(tuán)，能和流動(dòng)相中的陰離子交換。例如：交換。例如： R-N+(CHR-N+(CH3 3) )3 3OHOH- -+Cl+Cl- -R-N+(CHR-N+(CH3 3) )3 3ClCl- -+OH+OH- -離子交換層析的基本原理離子交換層析的基本原理n離子交換層析的基本原理示意圖離子交換層析的基本原理示意圖+流動(dòng)相中，流動(dòng)相中，不同離子

26、化合物帶電荷數(shù)量不同不同離子化合物帶電荷數(shù)量不同，與與離子交換劑相互作用的強(qiáng)弱也不同離子交換劑相互作用的強(qiáng)弱也不同。因此，因此，可以通過(guò)提高流動(dòng)相中的離子強(qiáng)度或改變可以通過(guò)提高流動(dòng)相中的離子強(qiáng)度或改變pH值得方法，將結(jié)合在離子交換劑上的反離子值得方法，將結(jié)合在離子交換劑上的反離子從離子交換柱上依次洗脫下來(lái)，達(dá)到分離純化的從離子交換柱上依次洗脫下來(lái)，達(dá)到分離純化的目的。目的。離子交換層析的基本原理離子交換層析的基本原理帶電荷量少，親和力小的先被洗脫下來(lái)；帶電荷量少，親和力小的先被洗脫下來(lái)；帶帶電荷量多，親和力大的后被洗脫下來(lái)。電荷量多，親和力大的后被洗脫下來(lái)。 兩性離子如蛋白質(zhì)、酶類、多肽和核苷

27、酸等物質(zhì)與離子交換劑的兩性離子如蛋白質(zhì)、酶類、多肽和核苷酸等物質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的物理化學(xué)性質(zhì)和在特定結(jié)合力，主要取決于它們的物理化學(xué)性質(zhì)和在特定pH條件下呈現(xiàn)的條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。當(dāng)離子狀態(tài)。當(dāng)pH低于等電點(diǎn)低于等電點(diǎn)(pI)時(shí)，它們帶正電荷能與陽(yáng)離子交換劑時(shí)，它們帶正電荷能與陽(yáng)離子交換劑結(jié)合；反之，結(jié)合；反之，pH高于高于pI時(shí)，它們帶負(fù)電荷能與陰離子交換劑結(jié)合時(shí)，它們帶負(fù)電荷能與陰離子交換劑結(jié)合 。pH與與pI的差值越大，帶電量越大，與交換劑的結(jié)合力越強(qiáng)。的差值越大，帶電量越大，與交換劑的結(jié)合力越強(qiáng)。 離子交換層析之所以能成功地把各種無(wú)機(jī)離子、有機(jī)離子或生物離子交換

28、層析之所以能成功地把各種無(wú)機(jī)離子、有機(jī)離子或生物大分子物質(zhì)分開(kāi)，其主要依據(jù)是離子交換劑對(duì)各種離子或離子化合物大分子物質(zhì)分開(kāi)，其主要依據(jù)是離子交換劑對(duì)各種離子或離子化合物有不同的結(jié)合力。有不同的結(jié)合力。離子交換層析的基本原理離子交換層析的基本原理離子交換層析的基本原理離子交換層析的基本原理2.2.離子交換劑離子交換劑通過(guò)化學(xué)方法將酸性或堿性基團(tuán)交聯(lián)在惰性基質(zhì)上可獲得離子交換通過(guò)化學(xué)方法將酸性或堿性基團(tuán)交聯(lián)在惰性基質(zhì)上可獲得離子交換劑。劑。常用的基質(zhì)有纖維素，葡聚糖凝膠，交聯(lián)瓊脂糖凝膠，聚丙烯常用的基質(zhì)有纖維素，葡聚糖凝膠，交聯(lián)瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠等。根據(jù)交換基團(tuán)酸堿性的強(qiáng)弱，陽(yáng)離子交換劑又

29、分為強(qiáng)酰胺凝膠等。根據(jù)交換基團(tuán)酸堿性的強(qiáng)弱，陽(yáng)離子交換劑又分為強(qiáng)酸型和弱酸型，陰離子交換劑又分為強(qiáng)堿型和弱堿型。酸型和弱酸型，陰離子交換劑又分為強(qiáng)堿型和弱堿型。在實(shí)際工作中，可根據(jù)被分離的物質(zhì)的性質(zhì)，選用適當(dāng)類型的離子在實(shí)際工作中，可根據(jù)被分離的物質(zhì)的性質(zhì)，選用適當(dāng)類型的離子交換劑。分離堿性蛋白質(zhì)常用陽(yáng)離子交換劑，分離酸性蛋白質(zhì)常用交換劑。分離堿性蛋白質(zhì)常用陽(yáng)離子交換劑，分離酸性蛋白質(zhì)常用陰離子交換劑。分離蛋白質(zhì)樣品時(shí)一般常用弱型交換劑。陰離子交換劑。分離蛋白質(zhì)樣品時(shí)一般常用弱型交換劑。p離子交換劑對(duì)溶液中不同離子具有不同的結(jié)合力，這種結(jié)合離子交換劑對(duì)溶液中不同離子具有不同的結(jié)合力，這種結(jié)合力

30、的大小是由離子交換劑的選擇性決定的。力的大小是由離子交換劑的選擇性決定的。 強(qiáng)酸性強(qiáng)酸性(陽(yáng)性陽(yáng)性)離子交換劑對(duì)離子交換劑對(duì)H的結(jié)合力比對(duì)的結(jié)合力比對(duì)Na的小；的小； 強(qiáng)堿性強(qiáng)堿性(陰性陰性)離子交換劑對(duì)離子交換劑對(duì)OH的結(jié)合力比對(duì)的結(jié)合力比對(duì)Cl的小得的小得多多； 弱酸性離子交換劑對(duì)弱酸性離子交換劑對(duì)H的結(jié)合力遠(yuǎn)比對(duì)的結(jié)合力遠(yuǎn)比對(duì)Na的大；的大； 弱堿性離子交換劑對(duì)弱堿性離子交換劑對(duì)OH的結(jié)合力比對(duì)的結(jié)合力比對(duì)Cl的大。的大。離子交換劑離子交換劑低低鹽鹽高高鹽鹽分離結(jié)分離結(jié)束束3.3.洗脫洗脫在離子交換層析中一般常用在離子交換層析中一般常用梯度洗脫梯度洗脫，通常有，通常有改變離子改變離子強(qiáng)度

31、強(qiáng)度和和改變改變pHpH兩種方式。兩種方式。 改變離子強(qiáng)度改變離子強(qiáng)度洗脫過(guò)程中逐步增大離子強(qiáng)度，洗脫過(guò)程中逐步增大離子強(qiáng)度，從而使與離子交換劑結(jié)合的各個(gè)組分被洗脫下來(lái)。從而使與離子交換劑結(jié)合的各個(gè)組分被洗脫下來(lái)。 改變改變pHpH的洗脫的洗脫對(duì)于陽(yáng)離子交換劑一般是對(duì)于陽(yáng)離子交換劑一般是pHpH從低從低到高洗脫，陰離子交換劑一般是到高洗脫，陰離子交換劑一般是pHpH從高到低。從高到低。 由于由于pHpH可能對(duì)蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，故一般可能對(duì)蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，故一般通常采用通常采用改變離子強(qiáng)度改變離子強(qiáng)度的梯度洗脫。的梯度洗脫。 增強(qiáng)洗脫液與離子交換劑的結(jié)合力增強(qiáng)洗脫液與離子交換劑

32、的結(jié)合力降低分離物與離子交換劑的結(jié)合力降低分離物與離子交換劑的結(jié)合力4.4.離子交換層析的特點(diǎn)離子交換層析的特點(diǎn)樣品處理量大，分離過(guò)程具有濃縮作用；分辨樣品處理量大，分離過(guò)程具有濃縮作用；分辨效率較高，所需柱長(zhǎng)較短，可在較高流速下操效率較高，所需柱長(zhǎng)較短，可在較高流速下操作；吸附作用機(jī)理明確，非特異性吸附小，產(chǎn)作；吸附作用機(jī)理明確，非特異性吸附小，產(chǎn)品回收收率高。品回收收率高。離子交換層析既可用于生物大分子物質(zhì)的分離離子交換層析既可用于生物大分子物質(zhì)的分離純化，又可用于小分子物質(zhì)的分離純化，還可純化，又可用于小分子物質(zhì)的分離純化，還可以用于硬水軟化以及污水處理等方面。以用于硬水軟化以及污水處理

33、等方面。5.5.離子交換層析的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用離子交換層析的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用除去離子（純凈水）聚苯乙烯樹(shù)脂廣泛的應(yīng)用于高純水的制備、硬水軟化以及污水處理等方面聚苯乙烯樹(shù)脂廣泛的應(yīng)用于高純水的制備、硬水軟化以及污水處理等方面 分離純化多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他帶電的生物分子改變成分（青霉素-Na青霉素-K ）濃縮與提?。股?、蛋白質(zhì)、工業(yè)廢液中微量金屬的提?。╇x子型化合物分離發(fā)展：自動(dòng)化方向與光譜技術(shù)結(jié)合專門用途的綜合性自動(dòng)分析儀與計(jì)算機(jī)相連進(jìn)行自動(dòng)分析與自動(dòng)控制四、應(yīng)用四、應(yīng)用分離多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他分離多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他帶電的生物分子帶電的生物分子53（三）吸附層析（三）吸附層析（

34、adsorption chromatographyadsorption chromatography）吸附作用是指某些物質(zhì)能夠從溶液中將溶質(zhì)濃集在其表面的現(xiàn)象。吸附劑吸附能力的強(qiáng)弱與被吸附物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)、溶劑的本質(zhì)有關(guān)。在不同條件下，吸附劑與被吸附物之間的吸附力不同。當(dāng)改變吸附劑周圍溶劑成分時(shí)，吸附劑對(duì)被吸附物質(zhì)的親和力便發(fā)生變化，使被吸附物質(zhì)從吸附劑上解脫下來(lái)，這一解脫過(guò)程稱為“洗脫”或“展層”。1.吸附層析概念吸附層析概念541.吸附層析概念吸附層析概念指混合物隨流動(dòng)相通過(guò)吸附劑時(shí)，由于吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同，從而使混合物分離的方法。吸附層析就是以吸附劑為固定相，根據(jù)待分離組分與吸附

35、劑之間的物理或化學(xué)吸附力差別而達(dá)到分離目的的層析技術(shù)。 優(yōu)點(diǎn)：容易保持組分活性，操作簡(jiǎn)單 缺點(diǎn)：吸附容量小，選擇性差，無(wú)機(jī)吸附劑性能不穩(wěn)定55物理作用的范德華吸附：無(wú)選擇性，吸附速度快，吸附的過(guò)程是可逆的?；瘜W(xué)吸附：由原子價(jià)力的作用引起。有選擇性，吸附速度較慢，不易解吸。吸附層析概念吸附層析概念562.吸附層析基本原理吸附層析基本原理 由于吸附劑的吸附能力可受溶劑影響而發(fā)生改變，樣品中物質(zhì)被吸附劑吸附后，用適當(dāng)?shù)南疵撘簺_洗，改變吸附劑的吸附能力，使之解吸，隨洗脫液向下移動(dòng)。當(dāng)解吸下來(lái)的物質(zhì)向下移動(dòng)時(shí)，又遇到前面新的吸附劑又重新被吸附。此被吸附的物質(zhì)再被后來(lái)的洗脫液洗脫下來(lái)而使其下移動(dòng)。經(jīng)如此反

36、復(fù)的吸附解吸再吸附再解吸的過(guò)程，物質(zhì)可沿著洗脫液的前進(jìn)方向移動(dòng)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間以后，該物質(zhì)會(huì)向下移動(dòng)一定距離。吸附層析基本原理吸附層析基本原理此距離的長(zhǎng)短與吸附劑對(duì)該物質(zhì)的吸附力以及溶劑對(duì)該物質(zhì)的解吸(溶解)能力有關(guān)。不同的物質(zhì)由于吸附力和解吸力不同，移動(dòng)速度也不同。吸附力弱而解吸力強(qiáng)的物質(zhì)，移動(dòng)速度就較快。所以在洗脫過(guò)程中各組分便會(huì)由于移動(dòng)速率不同而逐漸分離出來(lái)，這就是吸附層析的基本過(guò)程。吸附層析基本原理吸附層析基本原理根據(jù)操作方式不同3.吸附層析分類吸附層析分類柱層析（column chromatography）薄層層析（thin layer chromatography）吸附層析薄層層析(

37、Thin layer chromatography)薄層層析是以涂布于玻璃板或塑料膜等載體上的基質(zhì)為固定相，使之形成均勻的薄層，以液體為流動(dòng)相的一種層析方法。層析板層析板展開(kāi)劑展開(kāi)劑薄層色譜薄層色譜薄層層析(Thin layer chromatography)其方法是把吸附劑均一地鋪在一塊玻璃板或塑料膜上形成薄層，待分離的樣品點(diǎn)在薄層一端，在密閉容器中用適宜的溶劑（展開(kāi)劑）展開(kāi)，由于吸附劑對(duì)不同物質(zhì)吸附力大小不同，因此當(dāng)溶劑流過(guò)時(shí)，不同物質(zhì)在吸附劑和溶劑之間發(fā)生連續(xù)不斷地吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，易被吸附的物質(zhì)相對(duì)移動(dòng)的較慢，較難吸附的物質(zhì)則相對(duì)地移動(dòng)得快一些。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的展開(kāi)，不同的

38、物質(zhì)就被彼此分開(kāi)，最后形成互相分離的斑點(diǎn)。戊糖（木糖）：黃綠戊糖（木糖）：黃綠已糖（果糖、葡萄糖）：棕紅、已糖（果糖、葡萄糖）：棕紅、灰綠灰綠二糖（蔗糖）：蘭褐二糖（蔗糖）：蘭褐三糖三糖薄層層析的優(yōu)點(diǎn)：1.展層時(shí)間短，薄層層析分離混合物一般僅需15-60min；2.設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，既適用于分析，也適用于制備；3.靈敏度高，可檢出微量物質(zhì)。4.分離能力強(qiáng)，斑點(diǎn)集中。經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間以后，不同的物質(zhì)各自形成區(qū)帶，如果被分離的是有色物質(zhì)的話，就可以清楚地看到色帶(色層)。如果被吸附的物質(zhì)沒(méi)有顏色，可用適當(dāng)?shù)娘@色劑（噴霧顯色）或紫外光觀察定位。4. 吸附層析顯色吸附層析顯色5. 吸附層析的應(yīng)用吸附層

39、析的應(yīng)用 氨基酸、肽、糖類、脂類、苷（皂苷）類物質(zhì)的分離、鑒定 純凈水、醫(yī)藥用水的制備 藥液脫色分配系數(shù)：當(dāng)一種溶質(zhì)分布在兩個(gè)互不相溶的溶劑中時(shí)，它在流動(dòng)相和固定相兩相內(nèi)的濃度之比是個(gè)常數(shù)，稱為分配系數(shù)。 c2)(1)(物質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度物質(zhì)在固定相中的濃度c K（分配系數(shù)）= 分配系數(shù)與溫度、溶質(zhì)和溶劑的性質(zhì)有關(guān)，當(dāng)兩相做相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，不同組分可得到分離。( (五）分配層析（五）分配層析（partition chromatographypartition chromatography） 利用混合物在兩種或兩種以上的不同溶劑中的分配系數(shù)不同而使物質(zhì)分離的方法，叫分配層析。1.概念概念 固定在載

40、體上的液體稱為固定相，用做洗脫的液體稱為流動(dòng)相，則混合物各組分在兩相間發(fā)生不同的分配現(xiàn)象而逐漸分開(kāi)，形成色層。 載體在分配層析中只起負(fù)擔(dān)固定作用，它們是一些吸附力小、反應(yīng)性弱的惰性物質(zhì)如淀粉、纖維素、濾紙等。 固定相液體均勻覆蓋于載體表面，固定相除水外，還有稀硫酸、甲醇、仲酰胺等強(qiáng)極性溶液。 流動(dòng)相采用比固定相極性小或非極性的有機(jī)溶劑。概念概念分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動(dòng)相中的分配的數(shù)量多，移動(dòng)慢；分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相分配的數(shù)量多，移動(dòng)快，因此可彼此分開(kāi)。2.分配層析基本原理分配層析基本原理hH紙層析是以濾紙作為載體的層析技術(shù)，分配原理屬于分配層析的范疇。濾紙纖維上的羥基具有親水性(能吸收22%

41、左右的水)，吸附一層水作為固定相，紙纖維與有機(jī)溶劑的親和力很小，所以某些有機(jī)溶劑，如醇、酚等為常用的流動(dòng)相。3.紙層析紙層析紙層析紙層析基本過(guò)程基本過(guò)程將待分離物質(zhì)上樣于濾紙一端，使流動(dòng)相溶劑浸入移動(dòng)。當(dāng)流動(dòng)相沿濾紙經(jīng)過(guò)樣品時(shí)，樣品在水和有機(jī)溶劑這兩相之間不斷進(jìn)行分配，由于幾種待分離物質(zhì)有不同的分配系數(shù)，因而在兩相之間發(fā)生分配現(xiàn)象，最后逐漸分布到濾紙的不同部位。分配系數(shù)較大的成分，在紙上隨流動(dòng)相移動(dòng)速率就小，其層析點(diǎn)位置離原點(diǎn)的位置就較近。反之，分配系數(shù)較小的成分，其移動(dòng)速率就大，層析點(diǎn)位置離原點(diǎn)也遠(yuǎn)。紙層析紙層析基本過(guò)程基本過(guò)程原點(diǎn)溶劑前沿氨基酸顯色點(diǎn)XY紙層析示意圖Rf= YX原點(diǎn)至溶劑前沿的距離原點(diǎn)至色斑中心的距離物質(zhì)在濾紙上移動(dòng)的速率可用Rf值(比移值)表示： Rf值取決于被分離物質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)以及兩相的體積比。由于在同一實(shí)驗(yàn)條件下，兩相體積比是一常數(shù)，所以Rf值決定于分配系數(shù)。不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同，Rf值也不相同，由此可以根據(jù)Rf值的大小對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析。 紙層析紙層析Rf值值(比移值比移值)Y