凝固酶陰性葡萄球菌

1、凝固酶陰性葡萄球菌凝固酶陰性葡萄球菌致病性分子標志物的建立與應(yīng)用致病性分子標志物的建立與應(yīng)用11、立題依據(jù)、立題依據(jù)u凝固酶陰性葡萄球菌（凝固酶陰性葡萄球菌（CoNS）廣泛存在于人體皮膚、）廣泛存在于人體皮膚、黏膜等組織表面，常在血液、痰液、尿液、深靜脈置黏膜等組織表面，常在血液、痰液、尿液、深靜脈置管等各種標本中檢出。管等各種標本中檢出。 文獻報道，文獻報道，1995-1996年美國年美國48個醫(yī)學中心個醫(yī)學中心2596份份血標本中，血標本中， CoNS的分離率達的分離率達32.2%。 盡管血液等無菌體液培養(yǎng)出盡管血液等無菌體液培養(yǎng)出CoNS臨床意義較大，臨床意義較大，但據(jù)報道單次血培養(yǎng)但據(jù)

2、報道單次血培養(yǎng)CoNS污染的可能性仍高達污染的可能性仍高達85%。第一部分第一部分 研究背景和意義研究背景和意義2u近年來由于介入性診療操作、免疫抑制劑及廣譜抗生素近年來由于介入性診療操作、免疫抑制劑及廣譜抗生素的廣泛使用，的廣泛使用，CoNS已成為院內(nèi)感染的重要病原菌，而已成為院內(nèi)感染的重要病原菌，而且耐藥菌株比金黃色葡萄球菌更為多見。且耐藥菌株比金黃色葡萄球菌更為多見。 葉聯(lián)華等報道人工瓣膜術(shù)后心內(nèi)膜炎中，約有葉聯(lián)華等報道人工瓣膜術(shù)后心內(nèi)膜炎中，約有40%-50%由凝固酶陰性葡萄球菌引起；由凝固酶陰性葡萄球菌引起； 2009年中國年中國CHINET細菌耐藥監(jiān)測結(jié)果細菌耐藥監(jiān)測結(jié)果MRCoN

3、S檢檢出率平均為出率平均為71.7%,大于大于MRSA的的52.7%。研究背景和意義研究背景和意義3uCoNS CoNS 作為皮膚黏膜定植菌，在越來越多的標本中被作為皮膚黏膜定植菌，在越來越多的標本中被分離出來，常常引起臨床困惑。其是否能作為感染的分離出來，常常引起臨床困惑。其是否能作為感染的病原菌是臨床關(guān)心的問題。病原菌是臨床關(guān)心的問題。u有鑒于此，有鑒于此，實驗室建立對實驗室建立對CoNS污染菌和致病菌界定污染菌和致病菌界定的方法十分必要，是臨床明確診斷和制定合理治療方的方法十分必要，是臨床明確診斷和制定合理治療方案的重要前提案的重要前提 。研究背景和意義研究背景和意義4CoNS致病物質(zhì)u

4、在在 CoNS 感染的發(fā)病過程中，細菌先黏附繼而形成難以感染的發(fā)病過程中，細菌先黏附繼而形成難以清除的生物膜是其最為重要的致病機制清除的生物膜是其最為重要的致病機制 ；u其中其中CoNS產(chǎn)生的產(chǎn)生的多糖胞間黏附素（多糖胞間黏附素（polysacchatide intercellular adhesion，PIA）是細菌生物膜形成聚集階是細菌生物膜形成聚集階段所必需的物質(zhì)，在感染過程中起重要的作用，是鑒定段所必需的物質(zhì)，在感染過程中起重要的作用，是鑒定其致病性的物質(zhì)基礎(chǔ)。其致病性的物質(zhì)基礎(chǔ)。u Heilmann 等發(fā)現(xiàn)等發(fā)現(xiàn) ica 操縱子操縱子對合成對合成 PIA 以及在細菌形以及在細菌形成成

5、熟的生物膜中起到非常重要的作用。成成熟的生物膜中起到非常重要的作用。 研究背景和意義研究背景和意義5ica 基因結(jié)構(gòu)uica 基因座定位于細菌染色體，全長基因座定位于細菌染色體，全長 3.4 kb，包括，包括 icaR 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)基因及串聯(lián)存在的基因及串聯(lián)存在的 icaA、icaD、icaB 和和 icaC 結(jié)構(gòu)基因。結(jié)構(gòu)基因。 其中，其中，icaADBC 4 個基因構(gòu)成一個操縱子，可以通過檢測個基因構(gòu)成一個操縱子，可以通過檢測 icaADBC 基因來反映基因來反映ica 操縱子的存在。操縱子的存在。 icaB 不直接參與胞間黏附素的合成不直接參與胞間黏附素的合成,因為重組因為重組icaADC

6、就能就能使細胞積聚；使細胞積聚； icaA 單獨呈現(xiàn)低的單獨呈現(xiàn)低的N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶活性；乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶活性； icaC涉及到把不斷合成的多糖物質(zhì)轉(zhuǎn)運至細胞表面；涉及到把不斷合成的多糖物質(zhì)轉(zhuǎn)運至細胞表面； 生物膜的形成要求生物膜的形成要求icaD編碼的產(chǎn)物具有最佳活性。編碼的產(chǎn)物具有最佳活性。 因此因此,我們選擇了我們選擇了icaD 作為本試驗的目的基因片段。作為本試驗的目的基因片段。研究背景和意義研究背景和意義6u獲得獲得CoNS特異的致病性分子標志物；特異的致病性分子標志物；u確立敏感、準確、快速的醫(yī)院感染相關(guān)性確立敏感、準確、快速的醫(yī)院感染相關(guān)性CoNS特異基因診斷方法；特異基因診

7、斷方法；u能夠準確鑒定致病性與非致病性能夠準確鑒定致病性與非致病性CoNS。研究背景和意義研究背景和意義 2、實驗?zāi)康?、實驗?zāi)康?7 研究研究CoNS的生物標志物對該菌在醫(yī)院獲的生物標志物對該菌在醫(yī)院獲得性感染中的臨床微生物學診斷與鑒定，追得性感染中的臨床微生物學診斷與鑒定，追蹤傳染源，探索其在醫(yī)院感染中的確切作用蹤傳染源，探索其在醫(yī)院感染中的確切作用和地位、傳播與感染規(guī)律，從而對控制傳播和地位、傳播與感染規(guī)律，從而對控制傳播途徑、建立準確有效的防治措施具有重要實途徑、建立準確有效的防治措施具有重要實際意義和經(jīng)濟價值。際意義和經(jīng)濟價值。研究背景和意義研究背景和意義 3、臨床意義、臨床意義8u陰

8、性對照：表皮葡萄球菌陰性對照：表皮葡萄球菌ATCC12228，購自中國，購自中國藥品鑒定所，經(jīng)基因組測序證明其藥品鑒定所，經(jīng)基因組測序證明其ica操縱子缺失操縱子缺失 ；u陽性對照：表皮葡萄球菌陽性對照：表皮葡萄球菌1-97-337，瑞金醫(yī)院倪語，瑞金醫(yī)院倪語星教授惠贈，含有完整星教授惠贈，含有完整ica操縱子；操縱子；u待測樣本：自待測樣本：自2006年年1月至月至2007年年9月，收集我院月，收集我院臨床各科室共臨床各科室共114例疑是感染性標本。例疑是感染性標本。 第二部分第二部分 材料和方法材料和方法1、研究對象、研究對象92、主要試劑、主要試劑u培養(yǎng)基：培養(yǎng)基： 哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、

9、哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、 剛果紅瓊脂剛果紅瓊脂 培養(yǎng)基、培養(yǎng)基、 LB肉湯增菌液。肉湯增菌液。u引物：引物： SodA引物引物（ 5-CCITAYICITAYGAYGCIYTIGARCC-3 及及 5-ARRTARTAIGCRTGYTCCCAIACRTC-3）；）； icaD引物引物（5-AGGCAATA TCCAACGGTAA-3及及 5-GTCACGACCTTTCTTATATT-3）；）； 16S rDNA 引物引物（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3及及 5-CCGTCAATTCCATTTRAG TTT-3）。）。 材料和方法材料和方法103、主要儀器設(shè)備、主要儀器設(shè)備uPCR

10、儀：儀：PTC100 PCR儀，美國儀，美國MJ Research Inc.；u恒壓恒流電泳儀、電泳槽：恒壓恒流電泳儀、電泳槽：DF-C型，北京東方特力科貿(mào)型，北京東方特力科貿(mào)中心；中心；u凝膠成像系統(tǒng)：凝膠成像系統(tǒng)：GDS8000 ，美國，美國UVP Inc.； u核酸核酸/蛋白定量儀：蛋白定量儀：DU640，美國，美國Beckman；u酶標儀：美國雷杜，深圳組裝；酶標儀：美國雷杜，深圳組裝；uATB Expression：法國：法國bioMrieux Inc；u生物安全柜：生物安全柜：BSC-1500 B2，濟南鑫貝西生物技術(shù)有限，濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；公司；u全自動快速微生物培養(yǎng)檢

11、測系統(tǒng)：全自動快速微生物培養(yǎng)檢測系統(tǒng)：BacT/ALERT 3D 60，法國法國bioMrieux Inc；材料和方法材料和方法114、實驗設(shè)計及方法、實驗設(shè)計及方法標本采集標本采集陰、陽性對照陰、陽性對照菌種鑒定菌種鑒定PIA檢測檢測PCR擴增擴增icaD基因基因sodA基因基因 16SrDNA序列序列生物膜形成實驗生物膜形成實驗DNA測序、測序、生物信息學分析生物信息學分析確定特征片段確定特征片段臨床驗證臨床驗證比較分析比較分析材料和方法材料和方法12部分樣品剛果紅試驗結(jié)果34 1、剛果紅試驗、剛果紅試驗第三部分第三部分 結(jié)果和討論結(jié)果和討論13表2.1: 114例CoNS的菌種組成及剛果

12、紅試驗結(jié)果結(jié)果和討論結(jié)果和討論14u剛果紅試驗通過培養(yǎng)剛果紅試驗通過培養(yǎng)48h后菌落的顏色變化來反映后菌落的顏色變化來反映 CoNS 表達多糖胞間黏附素的情況，進而間接地反映其表達多糖胞間黏附素的情況，進而間接地反映其致病性。致病性。u114例樣品中剛果紅試驗陽性率例樣品中剛果紅試驗陽性率21.1%，由于，由于CoNS分泌分泌的的PIA在培養(yǎng)過程中可以丟失，使陽性結(jié)果偏低；另外，在培養(yǎng)過程中可以丟失，使陽性結(jié)果偏低；另外，其方法學本身易于受多種因素影響，比如：蔗糖的濃其方法學本身易于受多種因素影響，比如：蔗糖的濃度、氯化鈉和瓊脂的濃度、氣體條件等，干擾了實驗度、氯化鈉和瓊脂的濃度、氣體條件等，

13、干擾了實驗結(jié)果的正確性，不能滿足臨床要求。結(jié)果的正確性，不能滿足臨床要求。 結(jié)果和討論結(jié)果和討論152、ica D基因片段的擴增基因片段的擴增 a b c d e f g20001000500250(bp)圖2.2 ：部分樣品的icaD基因片段的 PCR 擴增結(jié)果結(jié)果和討論結(jié)果和討論16表2.2: 114例CoNS不同菌種icaD片段PCR擴增的結(jié)果 結(jié)果和討論結(jié)果和討論17 結(jié)果和討論結(jié)果和討論18圖2.3 : 部分樣品的定性黏附性實驗結(jié)果 3、體外黏附性實驗、體外黏附性實驗 結(jié)果和討論結(jié)果和討論19 表2.4 : 9例icaD（ + ）菌株半定量黏附性實驗結(jié)果 結(jié)果和討論結(jié)果和討論20u通

14、過體外半定量黏附實驗測得通過體外半定量黏附實驗測得88.9%（8/9）icaD（ + ）菌株是粘附株。）菌株是粘附株。u可見以半定量黏附試驗結(jié)果作為生物膜形成能可見以半定量黏附試驗結(jié)果作為生物膜形成能力的判定標準，力的判定標準，ica 操縱子的存在與操縱子的存在與CoNS粘附粘附及其生物膜形成密切相關(guān)。及其生物膜形成密切相關(guān)。u體外黏附性實驗用光吸收原理檢測生物膜成分，體外黏附性實驗用光吸收原理檢測生物膜成分，但生物膜本身的結(jié)構(gòu)會受到破壞；且由于方法但生物膜本身的結(jié)構(gòu)會受到破壞；且由于方法比較復雜，需要嚴格控制實驗條件才能獲得較比較復雜，需要嚴格控制實驗條件才能獲得較好的重復性，不適合臨床常規(guī)

15、應(yīng)用。好的重復性，不適合臨床常規(guī)應(yīng)用。 結(jié)果和討論結(jié)果和討論214、16S rDNA及及sodA基因片段擴增基因片段擴增 a b c d e 20001000500100(bp)圖2.5：部分樣品的16S rDNA片段 PCR擴增結(jié)果 結(jié)果和討論結(jié)果和討論22 圖圖2.6： 部分樣品的部分樣品的sodA 片段片段PCR 擴增結(jié)果擴增結(jié)果 a b c d e 20001000500250(bp) 結(jié)果和討論結(jié)果和討論23圖7： 部分樣品sodA PCR擴增產(chǎn)物的測序圖譜 結(jié)果和討論結(jié)果和討論24u 37例例CoNS樣品進行了樣品進行了16S rDNA基因及基因及sodA基因片段基因片段的的PCR

16、擴增，電泳檢測結(jié)果顯示全部樣品均能準確地擴增，電泳檢測結(jié)果顯示全部樣品均能準確地擴增出相應(yīng)的片段，其片段大小分別為擴增出相應(yīng)的片段，其片段大小分別為16S rDNA 926bp及及sodA 482bp，且均為單一條帶；，且均為單一條帶；u序列測定表明所有樣品序列測定表明所有樣品16S rDNA 及及sod A PCR產(chǎn)物序產(chǎn)物序列均相同，未發(fā)現(xiàn)與感染相關(guān)的特異性分子序列。列均相同，未發(fā)現(xiàn)與感染相關(guān)的特異性分子序列。 結(jié)果和討論結(jié)果和討論25uica操縱子可出現(xiàn)在多種操縱子可出現(xiàn)在多種CoNS中，臨床實驗室中，臨床實驗室建立并常規(guī)進行建立并常規(guī)進行CoNS致病性分子標志物的檢致病性分子標志物的檢

17、測方法是有意義、有必要的；測方法是有意義、有必要的；u通過本實驗我們確立了的敏感、準確、快速的通過本實驗我們確立了的敏感、準確、快速的醫(yī)院感染相關(guān)性醫(yī)院感染相關(guān)性CoNS基因診斷新方法，即基因診斷新方法，即ica D基因擴增方法；基因擴增方法； 第四部分第四部分 結(jié)論結(jié)論26結(jié)論結(jié)論u本研究首次報道了除表皮葡萄球菌以外的其本研究首次報道了除表皮葡萄球菌以外的其他種的凝固酶陰性葡萄球菌產(chǎn)生多糖胞間粘他種的凝固酶陰性葡萄球菌產(chǎn)生多糖胞間粘附因子的情況；附因子的情況；u表皮葡萄球菌在臨床表皮葡萄球菌在臨床CoNS中檢出最多，是攜中檢出最多，是攜帶帶icaD操縱子的主要菌種，其致病性應(yīng)引起操縱子的主要菌種，其致病性應(yīng)引起足夠重