帕金森病的干細(xì)胞移植治療

1、帕金森病的干細(xì)胞移植治療帕金森病又名震顫麻痹，是一種由于黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元 等進(jìn)行性變性缺失所致的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，隨著人口的老年 化，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。 2006 年中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分 會(huì)運(yùn)動(dòng)障礙及帕金森組制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)1-2 :運(yùn)動(dòng)減少。至少符合以下1項(xiàng)：a：肌肉僵直；b：靜止性震顫；c：姿勢(shì) 不穩(wěn)。至少符合以下 4項(xiàng)中的3項(xiàng)：a :單側(cè)起病；b:靜止性 震顫；c :逐漸進(jìn)展；d:發(fā)病后多為持續(xù)性不對(duì)稱性受累。盡管 近 10 多年對(duì)帕金森病的發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)及治療手段探索均有長足 的進(jìn)步， 但尚無法對(duì)其徹底根治。 近年來對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)可塑性的研 究及對(duì)神經(jīng)再生和干細(xì)胞的認(rèn)識(shí)逐漸加深，干細(xì)胞

2、工程迅速發(fā) 展。干細(xì)胞由于具有自我更新能力和多向分化潛能的特性， 運(yùn)用 干細(xì)胞移植治療帕金森病成為可能，極具發(fā)展前景和應(yīng)用價(jià)值。1 神經(jīng)干細(xì)胞的特點(diǎn)1.1神經(jīng)干細(xì)胞（NSCS是一群能自我更新并具有多種分化 潛能的細(xì)胞， 它來源于神經(jīng)組織并可生成神經(jīng)組織， 在適當(dāng)條件 下可分化成神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞。 Ourednik 等認(rèn) 為神經(jīng)干細(xì)胞是最適合于中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的替代治療和基因 治療的細(xì)胞。表皮1.2 神經(jīng)干細(xì)胞可直接來源于胚胎成年哺乳動(dòng)物的腦組織。在補(bǔ)充適量的促有絲分裂試劑如堿性成纖維細(xì)胞生長因子、生長因子或白血病抑制因子后， 神經(jīng)干細(xì)胞可在無血清的或含血 清的培養(yǎng)液中生長。另一個(gè)

3、提高增殖和延長培養(yǎng)時(shí)間的方法是， 在神經(jīng)元祖細(xì)胞中轉(zhuǎn)染增殖調(diào)節(jié)基因。 V-myc 基因可轉(zhuǎn)染神經(jīng)干 細(xì)胞，建立長久分化的神經(jīng)干細(xì)胞系。最近研究表明，源于胚胎 中樞神經(jīng)系統(tǒng)各區(qū)域的 NSCs具有不同的分化潛能，中腦來源的 NSCs(mesencephalic neural stem cells，mNSC)s 更易于分化為DA神經(jīng)元，是細(xì)胞移植治療PD的理想細(xì)胞源。然而由于機(jī)體 局部微環(huán)境的影響，僅少量 mNSC可在體內(nèi)分化為DA神經(jīng)元。2 影響神經(jīng)干細(xì)胞分化的因素 首先，移植的神經(jīng)干細(xì)胞的分化受其本身內(nèi)在性質(zhì)的影響。 其次，神經(jīng)干細(xì)胞所處的局部微環(huán)境因素和營養(yǎng)因素對(duì)神經(jīng)干細(xì) 胞的分裂和分化也具有

4、一定的誘導(dǎo)作用。 移植干細(xì)胞的分化與所 處環(huán)境的神經(jīng)類型和神經(jīng)發(fā)育階段有關(guān)。 向體外培養(yǎng)的干細(xì)胞中 加入不同組合的誘導(dǎo)因子如血清、 組織提取液、各種細(xì)胞因子等， 可使神經(jīng)干細(xì)胞繼續(xù)增值或向不同方向誘導(dǎo)分化。 神經(jīng)干細(xì)胞自 然分化為多巴胺能神經(jīng)元的比例只占細(xì)胞總數(shù)的0.5 %5%,而在一定條件下， 神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的比例甚至 可達(dá)到 80%。一些因子在多巴胺能神經(jīng)元的分化中起作用。 Nurrl 和 Ptx3 等轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化。 膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子( glial cell line derivedneurotrophic factor , GDNF

5、是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的 DA神經(jīng)營養(yǎng)因 子，然而由于血腦屏障和腦組織結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)， 使其應(yīng)用受到了限 制 3。3 神經(jīng)干細(xì)胞移植后的生物學(xué)特性Alcksandrova 等 4 將源于胚胎大鼠和人胚的神經(jīng)干細(xì) 胞分別移植于新生及成年大鼠腦內(nèi)， 于移植后 1 個(gè)月應(yīng)用放射自 顯影技術(shù)觀察， 發(fā)現(xiàn)源于胚胎大鼠的神經(jīng)干細(xì)胞在移植到成年大 鼠腦后并未停止發(fā)育，它能夠繼續(xù)分裂、遷移，形成神經(jīng)元和膠 質(zhì)細(xì)胞，免疫組化顯示它能夠表達(dá)特異性的神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽。 將來源于812周胚胎的人神經(jīng)干細(xì)胞， 移植前培養(yǎng)兩周，然后 將其移植入大鼠腦內(nèi)，于移植后 1020d，光鏡下，所有的受體 腦內(nèi)均可見培養(yǎng)的人神經(jīng)干細(xì)胞。成簇的移

6、植細(xì)胞位于尾狀核、 側(cè)腦室、白質(zhì)、腦皮質(zhì)，移植的細(xì)胞周圍可見巨噬細(xì)胞，但未見 明顯的免疫反應(yīng)。 移植細(xì)胞的濃度從注射區(qū)向周圍逐漸減少干細(xì) 胞中可見有絲分裂細(xì)胞， 表明在新的微環(huán)境下干細(xì)胞仍有增殖潛 能。大鼠和人神經(jīng)干細(xì)胞移植于成年大鼠腦后， 表現(xiàn)相似的生物 學(xué)行為并分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。 移植后， 兩者都可以連續(xù)地 進(jìn)行有絲分裂， 從移植區(qū)遷移至受體腦的周圍組織。 大鼠腦內(nèi)移 植可作為人神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育的生物模型。 Brustle 等將源于 8周 人胚的神經(jīng)干細(xì)胞移植入大鼠胚胎腦室，也可見有神經(jīng)元的分 化，移植細(xì)胞可以在軸突、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì) 胞等各個(gè)水平廣泛整合。成體中區(qū)神經(jīng)

7、系統(tǒng)中存在神經(jīng)干細(xì)胞，也可以在體外培養(yǎng) 擴(kuò)增后移植到腦內(nèi)。 從成鼠前腦室下帶中分離出神經(jīng)干細(xì)胞， 然 后進(jìn)行單細(xì)胞克隆、擴(kuò)增、收集，分別移植至大鼠切割海馬傘側(cè) 和正常側(cè)的海馬齒狀回中， 發(fā)現(xiàn)移植至海馬齒狀回中的神經(jīng)干細(xì) 胞能夠存活， 并可沿正常海馬齒狀回中固有的神經(jīng)干細(xì)胞遷移路 徑即顆粒下層遷移。 切割海馬傘側(cè)海馬內(nèi)存活和遷移的神經(jīng)干細(xì) 胞明顯多于正常海馬內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞。 提示切割海馬傘側(cè)海馬齒 狀回內(nèi)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的存活并誘導(dǎo)其遷移、分化的物質(zhì)增強(qiáng)。 移植到小鼠嗅球的室管膜下區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞可與該處的神經(jīng)元 發(fā)生廣泛的整合。 將神經(jīng)干細(xì)胞移植入大鼠海馬， 觀察到由神經(jīng) 干細(xì)胞分化來的神經(jīng)元與宿

8、主的神經(jīng)元形成功能性的突觸聯(lián)系， 體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)。 所以，神經(jīng)干細(xì)胞有望從解剖和功能 上對(duì)受到損傷或變性的腦組織進(jìn)行修復(fù)。 移植的神經(jīng)干細(xì)胞在大 鼠腦內(nèi)表現(xiàn)多巴胺的特性。 Villa等5報(bào)道，應(yīng)用V-myc轉(zhuǎn) 染的人胚神經(jīng)干細(xì)胞， 可以建立人神經(jīng)干細(xì)胞系， 使體外大量擴(kuò) 增神經(jīng)干細(xì)胞成為可能。對(duì)于帕金森病，產(chǎn)生人多巴胺能神經(jīng)元是我們治療的主要 目的。胚胎和成年腦組織干細(xì)胞均可產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)元， 從而 為帕金森病的移植治療提供細(xì)胞來源。 在增殖時(shí)， 這些細(xì)胞形成 表達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)祖細(xì)胞標(biāo)記（ nestin ）免疫活性的細(xì)胞球。在 包含有IL-1b , IL-11 , LIF和GDN等分

9、化介質(zhì)中可形成 TH免疫 活性的細(xì)胞， 這些細(xì)胞表現(xiàn)為多巴胺能神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)和功能的 特性， 包括多巴胺的產(chǎn)生和釋放。 目前已經(jīng)培育出分化為酪氨酸 羥化酶（TH）陽性細(xì)胞比例達(dá)98%的單克隆神經(jīng)干細(xì)胞系。這些 細(xì)胞可進(jìn)一步擴(kuò)增，可在液氮中儲(chǔ)存，復(fù)蘇后可以重新擴(kuò)增。這 些單克隆細(xì)胞系移植后可產(chǎn)生更高的多巴胺水平。 源于人胚胎中 腦的神經(jīng)干細(xì)胞也可移植于被毀損的大鼠腦內(nèi)， 成功地恢復(fù)多巴 胺水平。利用神經(jīng)干細(xì)胞作為基因治療的載體是一種新興的方法。 在體外將外源基因?qū)肷窠?jīng)干細(xì)胞，再經(jīng)過培養(yǎng)、擴(kuò)增，導(dǎo)入腦 內(nèi)，可以廣泛用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病及腫瘤的治療。 應(yīng)用單 個(gè)或多個(gè)外源基因?qū)ι窠?jīng)干細(xì)胞進(jìn)行修

10、飾， 使其攜帶補(bǔ)充外源性 多巴胺基因及營養(yǎng)因子基因， 然后導(dǎo)入腦內(nèi)， 可用于帕金森病和 阿爾茨海默病的治療。植入的神經(jīng)干細(xì)胞受局部微環(huán)境的影響， 在植入部位分裂增殖為相應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞， 補(bǔ)充和替代受損的細(xì)胞 并與宿主的局部細(xì)胞整合，建立功能性突觸聯(lián)系；另一方面，外 源基因在移植部位表達(dá)，發(fā)揮治療作用。Park等將NT-3 (神經(jīng)營養(yǎng)素-3 )轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞， 發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)時(shí)分化為神經(jīng)元的比 例可達(dá) 90%，移植到梗死灶后，有 20%的細(xì)胞可向神經(jīng)元方向分 化，移植到缺血半暗帶后，向神經(jīng)元方向分化的比率可達(dá)80%。Ryu等6將TH聯(lián)合GTPCH-理因修飾的C17.2系NSC移植到 PD鼠模型紋狀體

11、中，發(fā)現(xiàn) NSC能夠很好的存活、遷移和分化， 并能明顯地改變動(dòng)物行為。Kim等采用TH聯(lián)合GTPCH-基因修 飾的永生化系mNS(HB1.F3)移植治療PD,能改善動(dòng)物行為， 并在移植區(qū)有大量的 TH陽性細(xì)胞表達(dá)，表明NSC是基因治療PD 的有效理想載體。 研究發(fā)現(xiàn)孤兒核受體 (Nurr1 )基因可促進(jìn) NSC 系如C17.2分化為DA神經(jīng)元，減少其分化為膠質(zhì)細(xì)胞的比例。Nurrl基因修飾后的胚胎干細(xì)胞分化為DA神經(jīng)元的比例可從15%增至 50%。這些神經(jīng)元能表達(dá)中腦特異性的標(biāo)志物，包括 TH， Ret，Pitx3 ， Enl ；而且將這些神經(jīng)元移植到 6-羥基多巴胺大鼠模型 腦內(nèi)可產(chǎn)生功能性

12、整合， 并出現(xiàn)行為學(xué)改善。 因而 Nurr1 基因的 移植可通過增加外源性 DA神經(jīng)元的數(shù)量對(duì)PD起治療作用。O KeeffeFE等7過度表達(dá)Pirx3于NSCs中，然后暴露于E11, 這導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞分化的明顯增強(qiáng)，再植入6- 羥基多巴胺毀損帕金森病大鼠腦內(nèi)，導(dǎo)致明顯運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。另外，有 大量Girkz陽性NSC起源的A9神經(jīng)元在移植周圍。這證明給予 正確的信號(hào)，NSC能誘導(dǎo)成多巴胺能神經(jīng)元。Li等通過腺病毒載 體將Nurr1轉(zhuǎn)染于NSC后，移植到6-羥基多巴胺大鼠模型腦內(nèi)， 發(fā)現(xiàn)其比單純NS%植治療PD的病理學(xué)行為學(xué)改善更明顯。膠 質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF是目前發(fā)現(xiàn)針對(duì)DA神

13、經(jīng)元的一種 最有效和特異性的神經(jīng)營養(yǎng)因子。Liu等發(fā)現(xiàn)將表達(dá)NTN的C17.2-NSC植入PD模型鼠紋狀體，移植細(xì)胞能夠存活、分化， 保護(hù)DA神經(jīng)元，抵制6-羥基多巴胺對(duì)DA神經(jīng)元的毒性并能改 善動(dòng)物旋轉(zhuǎn)行為，其保護(hù)效果可持續(xù) 4 個(gè)月以上。褪黑素（ MT） 具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。Sharma等8應(yīng)用MT聯(lián)合C17.2-NSC 移植治療PD模型，發(fā)現(xiàn)對(duì)PD模型損害側(cè)黑質(zhì)紋狀體的 TH免疫 反應(yīng)有明顯保護(hù)作用。 目前， 免疫調(diào)節(jié)蛋白或神經(jīng)保護(hù)因子聯(lián)合 NSC用于細(xì)胞移植后免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)也是PD細(xì)胞移植治療的研究熱點(diǎn)丿Li八、八、4 前景與展望神經(jīng)干細(xì)胞移植治療帕金森病目前已成為一種研究和治療 的方向，但對(duì)其分子機(jī)制、免疫排斥、移