酵母細(xì)胞的沉降特點(diǎn)和酵母泥回收使用方法的研究分析

1、福建省燕京惠泉啤酒股份有限公司 馬勝平 林旭峰 362100【摘 要】本文通過(guò)對(duì)同種酵母菌種不同代數(shù)菌株在主酵和后酵階段細(xì)胞沉降情況的分析比對(duì)，掌握到現(xiàn)代啤酒大生產(chǎn)所采用的圓柱錐形底的發(fā)酵罐對(duì)酵母泥沉降及其回收的影響，進(jìn)而更合理地對(duì)酵母進(jìn)行使用，使整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程處于一個(gè)優(yōu)化狀態(tài)?！娟P(guān)鍵詞】錐形底 發(fā)酵罐 酵母沉降 酵母回收酵母質(zhì)量是影響啤酒質(zhì)量和風(fēng)味一致性的關(guān)鍵因素之一。酵母保存、擴(kuò)培、使用等的管理是啤酒生產(chǎn)過(guò)程工藝衛(wèi)生管理的重要內(nèi)容。在大生產(chǎn)中，我們需要酵母在以下幾個(gè)方面表現(xiàn)其優(yōu)良特性：起酵與主酵速度，雙乙酰峰值與還原速度，發(fā)酵度，風(fēng)味物質(zhì)生成情況，凝集情況，耐壓情況及遺傳穩(wěn)定性等。但是我們?cè)?/p>

2、生產(chǎn)過(guò)程的實(shí)際控制中發(fā)現(xiàn)，諸多因素影響了以上幾個(gè)方面的穩(wěn)定。從麥汁進(jìn)罐開(kāi)始到降溫倒罐結(jié)束（由于后期貯酒過(guò)程不在本文討論范圍內(nèi)，在此將不予體現(xiàn)），我們可以將整個(gè)過(guò)程詳細(xì)分解為很多區(qū)間段來(lái)考察，真正將這些細(xì)節(jié)過(guò)程考慮清楚了，對(duì)整個(gè)發(fā)酵狀態(tài)的穩(wěn)定控制都將有著無(wú)法比擬的作用。本文就從分析起發(fā)降糖和酵母沉降等的角度來(lái)討論一下。下圖一為400噸發(fā)酵大罐，四段式氨冷卻，三個(gè)溫度探點(diǎn)（分別處在60噸位、160噸位和390噸位的位置上），一個(gè)無(wú)菌取樣閥門處在60噸位溫度探點(diǎn)的平行位置。圖一 發(fā)酵大罐結(jié)構(gòu)示意圖°P，執(zhí)行工藝滿罐、9°P升溫至11°P封罐），經(jīng)歷了適應(yīng)期、出芽期、穩(wěn)定

3、期（時(shí)間相對(duì)較短）和沉降期等幾個(gè)階段。表一：項(xiàng)目/時(shí)間6小時(shí)24小時(shí)48小時(shí)72小時(shí)94小時(shí)120小時(shí)144小時(shí)168小時(shí)糖度（°P）/細(xì)胞數(shù)（107個(gè)/毫升）出芽率42%33%17%6%/pH值適應(yīng)期的長(zhǎng)短與整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的控制、酵母細(xì)胞活性的保持等多個(gè)方面相關(guān)，也隨著酵母泥的添加工藝變化而不同。如果在發(fā)酵過(guò)程控制良好，酵母細(xì)胞活性保持穩(wěn)定的前提下，采用進(jìn)罐第一批麥汁中添加酵母泥的工藝操作方案，則在間隔兩個(gè)半小時(shí)后的第二批麥汁進(jìn)罐時(shí)適應(yīng)期就已經(jīng)結(jié)束，并開(kāi)始進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的合成，該過(guò)程可以在下表三的數(shù)據(jù)中體現(xiàn)。°P時(shí)，細(xì)胞仍保留著少量的出芽能力，但是由于此時(shí)沉降速度的加快，細(xì)

4、胞數(shù)的峰值并沒(méi)有出現(xiàn)，而是向前，約在糖度值67°P時(shí)出現(xiàn)。因而也可以認(rèn)為穩(wěn)定期是出芽期和沉降期之間的短暫連接部分，存在一定的相對(duì)性，只對(duì)于酵母細(xì)胞的增殖能力判斷上有一定的研究意義。另外，從細(xì)胞數(shù)的跟蹤觀察與檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定期之前可能是由于對(duì)流的強(qiáng)烈和此時(shí)細(xì)胞的活性狀態(tài)原因，使得細(xì)胞間的凝集性還不明顯，分散性較好，計(jì)數(shù)的相對(duì)準(zhǔn)確性較高，而且出芽期間存在有較多的自溶細(xì)胞和較少的冷凝固物。但在之后，隨著整體酵母細(xì)胞的凝集沉降，下部細(xì)胞沉到錐底，中上部細(xì)胞逐步沉到下部，使得在下部取樣計(jì)數(shù)觀察時(shí)準(zhǔn)確度較低，而且存在的死亡、自溶細(xì)胞較少，冷凝固物量增加（如圖二的酵母細(xì)胞沉降示意圖和圖三、四的

5、發(fā)酵液懸浮細(xì)胞狀況圖所示）。并且，我們還在沉降過(guò)程中的封罐前五六個(gè)小時(shí)左右，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)短暫的酵母細(xì)胞數(shù)回高的現(xiàn)象，也對(duì)細(xì)胞沉降的區(qū)段劃分提供了數(shù)據(jù)支持（發(fā)酵罐圖片、細(xì)胞分散與凝集圖片）圖二 酵母細(xì)胞沉降示意圖圖三 發(fā)酵液懸浮細(xì)胞狀況（1）圖四 發(fā)酵液懸浮細(xì)胞狀況（2）另外，從發(fā)酵液懸浮酵母細(xì)胞狀況來(lái)看，可以明顯看到細(xì)胞被包裹在冷凝固物中，反映出酵母細(xì)胞的沉降性能不僅僅與酵母種的遺傳特性有關(guān)，和發(fā)酵液中的冷凝固物含量也呈一定的相關(guān)性。封罐后，隨著壓力的逐步上升，酵母細(xì)胞迅速沉降。20小時(shí)后背壓壓力基本穩(wěn)定時(shí)，大部分細(xì)胞都沉降至取樣線（60噸位）以下（如表一所示94小時(shí)與120小時(shí)檢測(cè)細(xì)胞數(shù)）。而

6、此后發(fā)酵液中懸浮酵母細(xì)胞數(shù)仍有少量變化，說(shuō)明沉降過(guò)程還在繼續(xù)但已趨緩。這就從一個(gè)側(cè)面說(shuō)明，取樣位以下部分的酵母細(xì)胞也仍在沉降過(guò)程中，下表三中不同時(shí)期回收酵母泥的細(xì)胞濃度檢測(cè)數(shù)據(jù)也為此提供例證。直至封罐約四天后，酵母細(xì)胞的沉降過(guò)程才基本結(jié)束，而此時(shí)酵母泥中的細(xì)胞濃度也將達(dá)到最大值。表二：回收酵母時(shí)間120小時(shí)144小時(shí)168小時(shí)192小時(shí)酵母泥濃度（108個(gè)/毫升）9151819 前面我們對(duì)整個(gè)酵母細(xì)胞增殖及沉降過(guò)程做了最詳盡的分解，其目的就是為了確定一個(gè)比較合理的酵母泥的回收方式與時(shí)間，以在酵母的轉(zhuǎn)代使用中最大限度地保持細(xì)胞的活性，并在一定程度上對(duì)衰老退化酵母進(jìn)行淘汰，進(jìn)而在可能情況下對(duì)酵母細(xì)

7、胞的發(fā)酵性能進(jìn)行強(qiáng)化。 一般來(lái)講，酵母泥的回收、貯藏和使用過(guò)程要注意壓力、溫度等多個(gè)因素的變化及控制穩(wěn)定。酵母細(xì)胞對(duì)于壓力的反應(yīng)，已有國(guó)外文獻(xiàn)進(jìn)行了闡述，影響不大，在此將不予贅述，而只是將回收壓力控制在一個(gè)穩(wěn)定范圍內(nèi)對(duì)溫度問(wèn)題予以考察。目前從大多數(shù)生產(chǎn)廠家的情況總結(jié)來(lái)看，酵母的回收方式主要有兩種，一種是貯存罐回收方式，另一種是罐對(duì)罐回收方式。從理論上講，二者都各有優(yōu)缺點(diǎn)。貯存罐回收方式，其基本工作方式為在發(fā)酵雙乙酰還原階段（主要是在還原后期，淡季可能是在貯酒期），將錐底少量酵母泥先期排掉，然后將剩余酵母泥泵入一個(gè)備壓無(wú)菌貯存罐中，緩慢攪拌冷卻至4以下，在不超過(guò)30小時(shí)的時(shí)間內(nèi)分兩批兩次或一批一

8、次加入冷卻后充氧麥汁中進(jìn)罐（主要是根據(jù)泵速條件，一個(gè)罐所需的酵母泥量如果無(wú)法在第一批麥汁中一次添加完成，則在四批滿罐的控制程序中前兩批麥汁中各加一半）。優(yōu)點(diǎn)在于酵母泥可以進(jìn)行必要的處理，如冷卻、洗滌等，而且在經(jīng)過(guò)攪拌后，不同沉降期的沉降酵母（表現(xiàn)在錐底酵母泥的分層）可以進(jìn)行一定的混合，使得前后罐使用的酵母狀態(tài)比較具有均一性。缺點(diǎn)在于酵母泥的損失量大，被污染的可能性增加，配套設(shè)備多，CIP要求高且耗費(fèi)大，細(xì)胞受機(jī)械剪切力影響大，回收使用周期長(zhǎng)，特別是后一罐酵母泥，在保存過(guò)程中如果攪拌開(kāi)啟不足會(huì)重新沉結(jié)，影響添加量的控制和滿罐酵母的準(zhǔn)確計(jì)量。罐對(duì)罐回收方式，其基本工作方式為在發(fā)酵雙乙酰還原階段，將

9、錐底少量酵母泥先期排掉后，分兩次分別將酵母泥經(jīng)過(guò)直通管道泵入準(zhǔn)備好的發(fā)酵罐中，然后分批進(jìn)麥汁進(jìn)行發(fā)酵。其優(yōu)缺點(diǎn)在很大程度上是上述方式的相反面。不管以哪種方式回收使用，其最基本的問(wèn)題是選擇回收的時(shí)機(jī)。從前面對(duì)酵母細(xì)胞的沉降特點(diǎn)來(lái)看，在封罐后34天的時(shí)間里回收是最理想的。此時(shí)的酵母泥中的細(xì)胞密度剛剛達(dá)到最大值，并且細(xì)胞處于緊密狀態(tài)的時(shí)間很短，這就既能保證酵母的最大回收量，又能避免在最大密度時(shí)（營(yíng)養(yǎng)缺乏、細(xì)胞間競(jìng)爭(zhēng)加?。┘?xì)胞的衰老自溶。當(dāng)然，如果酵母的沉降性能更強(qiáng)或者是高代酵母的話，則可根據(jù)實(shí)際沉降效果對(duì)回收時(shí)間加以提前。我們?cè)趯?shí)踐中發(fā)現(xiàn)，如果是新擴(kuò)培到發(fā)酵罐內(nèi)的零代酵母，則必須要在封罐三天后回收，

10、否則就會(huì)出現(xiàn)酵母泥量嚴(yán)重不足和細(xì)胞沉降性能明顯降低的情況。其次是回收時(shí)溫度的控制問(wèn)題。一般地說(shuō)，在回收前不采取任何形式的溫度控制措施的話，則在封罐三天后回收（不含降溫以后回收）時(shí)的酵母泥溫度將會(huì)比發(fā)酵罐內(nèi)下部溫度探頭顯示的溫度高23。此時(shí)的酵母泥在正?；厥帐褂眠^(guò)程中不會(huì)有任何問(wèn)題，但如果糖化出現(xiàn)故障或其它情況造成進(jìn)罐時(shí)間異常的話，則酵母泥在高溫留存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)就會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞活性并進(jìn)而導(dǎo)致主酵降糖進(jìn)程異常。比較有效的溫度控制措施是在封罐一天后，當(dāng)發(fā)酵罐錐底部分酵母泥沉降還不夠緊密時(shí)，冷卻傳遞效果較好，此時(shí)定期開(kāi)啟最底部氨冷卻帶（如圖一所示）進(jìn)行冷卻，比如說(shuō)每4小時(shí)冷卻15分鐘，到酵母泥回收時(shí)溫度就

11、會(huì)基本控制在發(fā)酵罐內(nèi)下部溫度探頭顯示溫度的水平，進(jìn)而使細(xì)胞活性得到最大限度的保持。第三個(gè)方面是回收過(guò)程的控制。酵母泥沉降時(shí)的分層現(xiàn)象比較明顯，其中最底部的酵母泥是最早沉降下來(lái)的，其在錐底部分留存時(shí)間長(zhǎng)，衰老死亡率較高，因此需要將此部分酵母泥在回收時(shí)進(jìn)行排除。但到底需要排除多少呢？我們?cè)趯?shí)踐中發(fā)現(xiàn)，雖然錐底部分具有70度斜角，但由于酵母泥的粘性和漏斗效應(yīng)，實(shí)際上并不能將低活性酵母細(xì)胞全部排除，這就需要一個(gè)取舍。如果準(zhǔn)備回收使用兩罐，那么有效的排除量將在0.50.8噸之間；如果只需要回收使用一個(gè)罐，則可以將有效排除量控制在3.54.0噸之間。我們有數(shù)據(jù)證明在回收使用兩罐的情況下，使用貯存罐進(jìn)行回收

12、，則前后罐之間的降糖時(shí)間將相差10小時(shí)左右（由于回收管徑和酵母泥的粘稠特性，先回收的酵母泥在貯存罐中的上部，使用時(shí)則后用，后回收的酵母泥在貯存罐中的下部，使用時(shí)先用）；如果回收使用一罐的情況，有效排除量控制在3.54.0噸之間來(lái)回收使用的發(fā)酵罐的降糖時(shí)間將比有效排除量在0.50.8噸之間來(lái)回收使用的發(fā)酵罐的降糖時(shí)間縮短10小時(shí)左右。第四，使用貯存罐時(shí)留存過(guò)程的控制。這包括有三個(gè)方面的內(nèi)容，一是貯存壓力的控制，一是背壓氣體的選擇，另一是溫度的控制。關(guān)于貯存壓力的控制主要是考慮酵母細(xì)胞的耐壓性能，而一般來(lái)說(shuō)發(fā)酵罐15米左右的高度將產(chǎn)生1.5bar的壓力，加上封罐時(shí)背壓1.0bar，這樣錐底部分的酵

13、母泥受到2.5bar左右的壓力，麥汁進(jìn)罐時(shí)酵母添加管路的壓力在2.0bar左右，因此在前后壓力變化不是很大，而且依據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)的報(bào)道，在壓力變化不太大的情況下，酵母細(xì)胞的活性影響不大，因此貯存罐的壓力一般選擇在1.0bar。背壓氣體的選擇上應(yīng)該說(shuō)是比較有分歧的一點(diǎn)，在使用無(wú)菌空氣或者是CO2的問(wèn)題上，各有各的說(shuō)法，但依據(jù)我們的實(shí)踐顯示，具體使用哪一種氣體進(jìn)行背壓對(duì)細(xì)胞活性的影響都不大。最后是溫度控制的問(wèn)題，如前面所述，酵母泥中的細(xì)胞濃度達(dá)到18×108個(gè)/毫升時(shí)，其粘度相當(dāng)大，使用氨系統(tǒng)進(jìn)行冷卻的話，其效果比較差，而且會(huì)導(dǎo)致接觸冷媒的靠近外壁的酵母細(xì)胞受到冷傷害。因此我們不建議對(duì)酵母貯

14、存罐進(jìn)行外夾套式的冷卻，可以如回收時(shí)溫度控制方法進(jìn)行源頭控制，效果會(huì)比較好。或者是采用另外一個(gè)手段，在貯存罐中通入低溫脫氧水（由于通入時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的泡沫，因此對(duì)貯存罐的容積有一定要求，一般是需要洗滌酵母泥體積量的1.51.8倍。），通過(guò)將酵母泥進(jìn)行稀釋來(lái)加強(qiáng)攪拌槳的作用，不僅可以將整個(gè)罐內(nèi)的溫度均勻降至一個(gè)比較低的水平，酵母泥中細(xì)胞粘附的冷凝固物量減少（通過(guò)顯微鏡的觀察）改善沉降性能，而且可以通過(guò)洗滌后期細(xì)胞的沉降作用將部分衰老死亡細(xì)胞進(jìn)行淘汰（依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，洗滌前后的酵母泥細(xì)胞死亡率將下降1個(gè)百分點(diǎn)），提高使用酵母泥的整體活性（我們?cè)谶M(jìn)行洗滌與否的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)比較中可以發(fā)現(xiàn)，在不進(jìn)行酵母泥

15、洗滌的發(fā)酵過(guò)程出現(xiàn)的前后兩個(gè)使用罐的降糖時(shí)間差在洗滌后進(jìn)行發(fā)酵的兩個(gè)使用罐中不出現(xiàn)，而且在整個(gè)降糖時(shí)間上有所減少）。第五，添加方式的選擇控制。添加方式的選擇主要體現(xiàn)在直接添加到發(fā)酵罐中或者是添加到麥汁中，或者是在四批滿罐的麥汁的第幾批中添加，以及采取什么樣的充氧方式。一般的研究方法是對(duì)后期酵母細(xì)胞的發(fā)酵性能、沉降性能、雙乙酰還原性能和風(fēng)味物質(zhì)形成情況等進(jìn)行分析。我們采用的是一個(gè)比較簡(jiǎn)單的評(píng)測(cè)方法對(duì)滿罐過(guò)程中的溶解氧變化情況和酵母起酵性能進(jìn)行評(píng)估。以貯存罐回收使用方式為例，采用前三批麥汁充氧工藝，控制麥汁溶解氧水平在10ppm。在第一批麥汁中加入全部酵母（0.9%酵母泥添加量、8批麥汁/天），在進(jìn)第二、三、四批麥汁前分別對(duì)發(fā)酵液中溶解氧、酵母細(xì)胞數(shù)和出芽率進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)如下表四所示：表三：項(xiàng)目/時(shí)間溶解氧（ppm）酵母數(shù)（107個(gè)/毫升）出芽率（%）第一批麥汁10/第一批麥汁進(jìn)罐后發(fā)酵液0第二批麥汁進(jìn)罐前發(fā)酵液0第二批麥汁10/第三批麥汁進(jìn)罐前發(fā)酵液7第三批麥汁10/第四批麥汁進(jìn)罐前發(fā)酵液17第四批麥汁/滿罐6小時(shí)后42 由于缺乏有效的實(shí)驗(yàn)手段，難以對(duì)酵母細(xì)胞的代謝調(diào)控做深入的研究，依據(jù)一般的微生物生長(zhǎng)特點(diǎn)，結(jié)合對(duì)出芽率變化的考察，我們認(rèn)為在0.1p