小鼠間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)擴增后生物學(xué)特性研究

1、小鼠間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)擴增后生物學(xué)特性研究            作者：解琳娜, 王健民,邱慧穎, 高磊, 周虹, 龔勝蘭【摘要】  本研究目的是分離富集小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（mMSC），鑒定其生物學(xué)特性和多向分化潛能。取4-5周齡雄性C57BL/6小鼠骨髓細胞，采用全骨髓貼壁法和單克隆培養(yǎng)法分離、純化和擴增mMSC；分析細胞免疫表型、生長曲線、細胞周期；進行多向分化潛能鑒定；傳代培養(yǎng)達30代后，進行成瘤性檢測。結(jié)果表明：建立的小鼠間充質(zhì)干細胞系在體外可連續(xù)傳代培養(yǎng)達30代，細

2、胞仍保持多向分化潛能，細胞高表達CD29、CD44、Sca?1、MHC?并瘢?中度表達CD13、CD90.2，不表達CD117、CD45、Flk?1、MHC?并蚶囁乖?。mMSC體外能誘導(dǎo)分化成骨、脂肪、軟骨細胞。結(jié)論：全骨髓貼壁法和集落培養(yǎng)法富集可獲得mMSC，其在體外連續(xù)傳代30代以上仍能維持生物學(xué)特性穩(wěn)定，具有高度的增殖和多向分化潛能，無成瘤性。 【關(guān)鍵詞】  間充質(zhì)干細胞骨髓細胞培養(yǎng)生物學(xué)特性Enrichment  and Biological Characteristics of Murine Mesenchymal Stem Cells  &

3、#160;   Abstract    The study was aimed to isolate and establish mesenchymal stem  cell line  from adult murine bone marrow as well as  to identify its biological characteristics and differentiation potential. Bone marrow cells (BMCs) were collected by flushin

4、g the femurs and tibias of 4?5?week?old male C57BL/6 mice, and were inoculated  at a concentration of 1×106/cm2.  mMSCs were isolated, enriched and expanded by using bone marrow adherant culture and monoclonal culture. The characteristics of the cells, such as morphology, growth patte

5、rn, cell cycle, phenotype, karyotype and multipotent differentiation potential, cytogenetic stability and tumorigenesis were determined. The results indicated that the cell population consisted of spindle? and star?shaped cells,   they were highly positive for CD29, CD44, Sca?1, MHC?并?, mo

6、derate positive for CD13, CD90.2 and negative for CD117, CD45, Flk?1 and MHC?并?. mMSCs could be induced to differentiate into adipocytes, osteoblast cells and chondrocytes. It is concluded that mMSC can be isolted, expanded and enriched by using bone marrow adhcrent culture and monoclonal culture. N

7、o tumor formations are observed for 3 months in nude mice after subcutaneous injection. mMSCs  retain  their properties after at least 30 passages in culture as well as from frozen stocks.    Key words    mesenchymal stem cell; bone marrow; cell culeure; biolo

8、gical characteristics    J Exp Hematol 2007; 15(3):542-546    間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells,MSC）是來源于中胚層的一種成體干細胞，MSC易于富集和擴增，不涉及倫理學(xué)問題，已被越來越廣泛地應(yīng)用到組織工程中,是理想的種子細胞。目前已從大鼠1、貓2、狗3、狒狒4、兔5、豬6、山羊7、綿羊8等多種哺乳類動物中成功分離MSC。由于小鼠MSC的分離、純化較其它動物困難，故這方面的報道相對少見。然而，小鼠與人類基因有90%同源性，是非常好的生理和病理的哺乳

9、動物模型，如果能分離、純化小鼠MSC，并應(yīng)用到動物模型的研究中，就可以更好地推進MSC的臨床研究，為其廣泛應(yīng)用打下基礎(chǔ)。故我們進行了小鼠間充質(zhì)干細胞分離、富集培養(yǎng)，并對其生物學(xué)特性進行了分析。    材料和方法    主要材料    DMEM?LG （Gibco 公司產(chǎn)品）； 胎牛血清 （Hyclone公司產(chǎn)品）；小鼠單克隆抗體PE CD13、MHC?并瘢?Serotec公司產(chǎn)品）；抗小鼠單克隆抗體PE CD29、CD44、CD90.2、CD117、Sca?1、Flk?1、MHC?并頡?PE/Cy5?CD

10、45（Biolegend公司產(chǎn)品）。L?補勸濱貳嗔疵顧亍厝?米松、1?布諄?3?慘於?不凄堰剩?IBXM）、吲哚美辛、牛胰島素、?哺視土姿崮啤?生素（均為Sigma公司產(chǎn)品）。    實驗動物    雄性C57BL/6小鼠，3-4周齡，購自第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。    mMSC的原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)    用頸椎脫臼法處死小鼠，于75%乙醇中浸泡5分鐘，無菌條件下沖取小鼠骨髓細胞；用維持培養(yǎng)液（DMEM?LG+10% FBS+4 mmol/L L?補勸濱?+100 U/ml

11、青霉素+100 g/ml鏈霉素）重懸，按1×106/cm2接種，于37、5% CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于24-36小時后全量換液，每3日換液1次；當(dāng)貼壁細胞約75%匯合時消化細胞，在96孔板按10個/孔的密度接種原代培養(yǎng)的貼壁細胞（30/cm2），每3天換液1次；消化孔中有克隆長出的細胞，再分別接種6孔板，此時記為P1代，純化的mMSC細胞維持培養(yǎng)密度為（1.5-3）×103/cm2，細胞匯合率達80%-90，每36-48 小時需消化傳代1次。    細胞生長曲線測定    分別取P5、P10、P1

12、5、P30代mMSC，以5 000/well的密度接種于24孔板內(nèi)，于培養(yǎng)第1天至第8天定時消化3個復(fù)孔細胞，計數(shù)，繪制細胞生長曲線。    細胞周期分析    分別取生長融合達30%-40和90%以上的mMSC，以4預(yù)冷的70%冰乙醇固定，4放置24小時；用PBS洗滌2次；加入RNA酶10 g和碘化丙錠（PI）  0.3 ml重懸細胞（4，30分鐘）。用流式細胞儀以FL2紅色熒光條件檢測。應(yīng)用Modfit LT 2.0軟件分析細胞周期。    細胞免疫表型鑒定   

13、; 收集P5、P10、P15、P30代mMSC，以Trypsin?EDTA消化，取約106細胞，分別加入熒光標(biāo)記單克隆抗體CD13?PE、CD29?PE、CD44?PE、CD90.2?PE、CD117?PE、Sca?1?PE、Flk?1?PE、MHC?并癃?PE、MHC?并顙?PE、CD45?PE/Cy5，于室溫避光孵育30分鐘，加入2 ml的PBS，260×g離心5分鐘，棄上清，加入300 l的PBS重懸細胞，設(shè)空白/陰性對照，進行流式細胞儀檢測，以Cellquest軟件采集數(shù)據(jù)，分析陽性細胞比例。    多向分化潛能鑒定  

14、60; 分別取P5、P15代mMSC，以1×104/cm2的密度接種于6孔板中（內(nèi)含預(yù)處理的小玻片，設(shè)實驗組與對照組）。    向脂肪細胞誘導(dǎo)  誘導(dǎo)培養(yǎng)條件參見文獻9，mMSC培養(yǎng)10-14天。取出細胞爬片，用PBS沖洗，10%甲醛固定10分鐘，用PBS洗，油紅O染色30分鐘，鏡下觀察。    向成骨細胞誘導(dǎo)  按文獻9誘導(dǎo)培養(yǎng)mMSC 3周，取出細胞爬片，用PBS沖洗后進行AKP（堿性磷酸酶）檢測、Von kossa 染色鈣鹽沉著鑒定、型膠原的免疫組織化學(xué)(中山公司產(chǎn)品)檢測等進行成骨細胞鑒定。

15、60;   向成軟骨細胞誘導(dǎo)  mMSC于誘導(dǎo)培養(yǎng)液（10% FBS/DMEM?LG+4 mmol/L L?補勸濱?+100 U/ml青霉素+100  g/ml鏈霉素+10-8mol/L地塞米松+10 ng/ml  hTGF?撥?1 +50 ng/ml hIGF?1+50 g/ml維生素C）培養(yǎng)3周，取出細胞爬片進行HE染色和型膠原免疫組織化學(xué)(中山公司產(chǎn)品)檢測。    mMSC細胞遺傳學(xué)分析（染色體G顯帶）    取對數(shù)生長期的P5、P10、P15代mMSC（約2×106

16、個細胞），培養(yǎng)液中加入秋水仙胺（終濃度為0.05   g/ml），置于37溫箱中1小時，棄培養(yǎng)液；Trypsin?EDTA消化獲得細胞；制備染色體標(biāo)本10。    mMSC成瘤性檢測    BALB/C?nu/nu小鼠15只，隨機分為3組。接種物無菌接種于小鼠背部脊柱右側(cè)皮下。陰性對照組3只, 接種0.2 ml PBS；陽性對照組6只，接種小鼠纖維肉瘤細胞系MCA207/HER2細胞懸液，密度2.0×106/0.2 ml PBS；實驗組6只，接種P15 mMSC細胞懸液，密度5.0×106/0.

17、2 ml PBS。接種后持續(xù)觀察小鼠的一般狀況、體重及接種位點變化；在接種3個月后處死裸鼠，檢查接種部位是否成瘤。百事通     結(jié)    果    mMSC細胞系的建立    利用mMSC貼壁生長的特點，將全骨髓貼壁法和單克隆培養(yǎng)法相結(jié)合，選原代貼壁細胞，以30/cm2的密度種植，細胞生長匯合至70%-80傳代，維持培養(yǎng)密度為（1.5-3）×103/cm2，每48-60小時傳代1次。細胞傳代至30代以上，生長狀態(tài)良好，呈紡錘樣或星狀，核大漿少，1-2個核仁者居多。

18、達100融合時細胞呈輻射狀、漩渦狀排列。實驗中共獲得4個細胞株，對2株進行了誘導(dǎo)鑒定。細胞形態(tài)見圖1，生長曲線變化見圖2。    Figure 1. Morphology of the cells in vitro culture.  A:colony of primary culture;  B:mMSCs (common light microscope， ×100); C:mMSCs showing a swirl growth;  D:mMSCs shown with Wright?Giemsa's 

19、; staining.    細胞增殖特征    細胞群體倍增時間為30.8±0.96小時。當(dāng)mMSC達30-40%或90%以上融合的時，G0/G1期細胞百分比分別為40.62和82.36，S/G2/M期細胞百分比分別為59.38和17.64（圖3）。    體外分化潛能    mMSC細胞系具有向成骨、成脂肪、成軟骨細胞分Figure 2. Growth curve of mMSCs.  There is no diffe? rence in the d

20、ifferent passages.（P0.05）    化的潛能。成骨誘導(dǎo)后，偶氮偶聯(lián)法堿磷酶染色見胞漿有深紫色沉淀，陽性細胞率 91.25±3.15（圖4B）；Von kossa 染色,顯示黑褐色鈣鹽沉積（圖4C）；骨型膠原表達，陽性細胞率 89.56±4.55（圖4D）。成脂肪誘導(dǎo)的陽性細胞比例 65.25±4.15%（圖4E、F）。成軟骨細胞誘導(dǎo)后，細胞體積變大，呈多角形或類圓形，多核或單核，胞漿豐富，型膠原陽性細胞率 62.5±3.5（圖4G、H）。討    論  

21、  小鼠是研究MSC細胞生物學(xué)特征的理想模型。然而，應(yīng)用標(biāo)準的黏附分離法獲得相對純化的MSC卻很困難,其原因：MSC數(shù)量約2-5個/106骨髓單個核細胞11，含量極低；MSC所處的位置接近于骨內(nèi)膜和骨密質(zhì)12,13，緊密的骨質(zhì)使得細胞不易被獲??；造血細胞的干擾,小鼠骨髓黏附細胞中除MSC外，還包含大量造血細胞。造血細胞是通過表面的黏附分子，細胞因子受體和細胞外基質(zhì)蛋白等的促進作用而直接黏附在培養(yǎng)皿上，且在缺乏外源性生長因子的情況下，基質(zhì)細胞仍具有支持粒系和B淋巴細胞的功能,故傳代后造血細胞仍可混雜在培養(yǎng)體系中；MSC無獨特的免疫表型，而且黏附的MSC在沒有分化誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件下也可表達

22、分化的表型14,免疫分選法可能會造成間充質(zhì)干細胞損失；小鼠品系的不同,品系的差異對mMSCs的分離、培養(yǎng)也有一定影響。Anjos?Afonso等15比較了NOD/SCID、NOD/SCID?撥?2null、C57BL/6  3種品系小鼠MSC的分離培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)NOD/SCID來源的MSC較野生型C57BL/6具有更高的細胞純化、擴增能力。國內(nèi)實驗中多采用BABL/c來源的MSC16,但在培養(yǎng)傳代中發(fā)現(xiàn)，MSC在傳代至第8代后細胞增殖能力明顯下降17。    大多數(shù)研究者為富集mMSC，采用磁珠分選法和生長因子參與培養(yǎng)傳代的方法。Tropel等18將C57B

23、L/6小鼠全骨髓細胞以2×106/cm2的密度接種，磁珠分選貼壁細胞，獲得CD11b-單個核細胞，以1×103 /cm2的密度接種在FN包被的塑料培養(yǎng)皿中，并在培養(yǎng)體系中添加了EGF（表皮生長因子）10 ng/ml和PDGF?AA(血小板源生長因子)10 ng/ml（可以促進全骨髓細胞的CFU?F形成），直到成纖維細胞集落出現(xiàn)。上述方法雖然獲得mMSC純度高，但成本亦高，無法滿足大規(guī)模動物實驗的要求。    為達到簡單、低成本獲得mMSC的目的，在本實驗中我們采用過密度梯度離心法，全骨髓細胞裂解紅細胞后直接貼壁法，定期換液去除懸浮生長的造血細胞

24、。獲得的貼壁細胞數(shù)量均較少，傳代后細胞無集落樣生長。分析原因：密度梯度離心法造成一定數(shù)量單個核細胞損失；裂解紅細胞法雖然避免了單個核細胞數(shù)量的損失，但影響了干細胞的生長。最終我們采用全骨髓細胞貼壁法，將分離獲得的全骨髓細胞懸液，以1×106/cm2較高密度接種，24-36小時首次換液，爾后定期換液去除懸浮生長的細胞，待貼壁細胞集落形成、細胞融合達70%-80后收集細胞，按每孔10個細胞的密度接種于96孔板（30/cm2），約2的孔中有集落形成，貼壁細胞約1/5×103。我們將全骨髓貼壁法和集落化培養(yǎng)相結(jié)合的方法，達到低成本分離、純化mMSC的目的。而且，在未添加細胞因子的生

25、長條件下，mMSC的擴增能力未受影響，細胞擴增至30代以上，生物學(xué)特征穩(wěn)定。全骨髓貼壁法培養(yǎng)體系中，造血細胞和非MSC細胞的存在可以為MSC的生長提供適宜的微環(huán)境，還可能分泌PDGF、EGF等生長因子促進其早期的集落形成。MSC完成原代集落形成之后，對生長因子的依賴性減低，此時再進行集落的培養(yǎng)，可以獲得高富集度的MSC，且細胞擴增能力穩(wěn)定。    間充質(zhì)干細胞無特異性表面標(biāo)志。我們的結(jié)果提示，mMSC高表達Sca?1、CD29、CD44、MHC?并窶嚳腫櫻恢斜澩?CD13、CD90.2（Thy?1.2，在C57BL/6品系小鼠細胞中特異表達）；低表達造血前體細胞標(biāo)

26、志CD117（c?kit）、CD45（白細胞共同抗原）、Flk?1（血管內(nèi)皮生長因子受體）、MHC?并蚶嚳腫印?Phinney等19等獲得FVB/N小鼠的MSC低表達CD11b、CD31、CD34、CD45、CD117等造血系和內(nèi)皮細胞系表型，表達CD9、CD29、CD44、CD81、CD106和Sca?1等典型標(biāo)記的結(jié)果相符。    干細胞和腫瘤細胞具有高遷徙性、自我更新能力、永生性和異質(zhì)性等潛能。Masako等20將C57BL/6小鼠來源的MSC連續(xù)傳代1年以上，細胞獲得無限繁殖的能力，且傳代中積累的染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的缺失等非克隆性異常逐漸演變成克隆性異常，成

27、為惡性細胞群，在體內(nèi)可以形成纖維肉瘤。為后期應(yīng)用體內(nèi)實驗做準備，我們對獲得的mMSC細胞遺傳學(xué)性狀及潛在成瘤性進行了檢測。染色體G顯帶分析未發(fā)現(xiàn)明顯染色體異常。mMSC種植于裸鼠皮下3個月后未見腫瘤形成。    綜上所述，本實驗用直接法簡便分離、培養(yǎng)的mMSC在體外傳代培養(yǎng)至30代仍保持生物學(xué)特性穩(wěn)定，無致瘤性，可安全應(yīng)用于體內(nèi)。這為更好地以小鼠為模型，研究MSC在造血干細胞移植中的作用提供實驗依據(jù)?！緟⒖嘉墨I】  1Inoue S, Popp FC, Koehl GE, et al. Immunomodulatory effects of mesenc

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