Maldi-tof技術(shù)與質(zhì)譜儀的使用PPT課件

1、2021/6/71MALDI-TOF技術(shù)與質(zhì)譜儀的使用南開大學(xué)元素所 張森2021/6/72MALDI技術(shù) 離子化技術(shù)：離子化技術(shù)：MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization MALDI技術(shù)的原理技術(shù)的原理 樣品與基質(zhì)，在樣品靶表面形成的共結(jié)晶薄膜 激光照射，基質(zhì)吸收能量 基質(zhì)把能量傳遞給樣品分子，將電荷轉(zhuǎn)移給樣品，樣品電離。2021/6/73MALDI技術(shù)中基質(zhì)的作用技術(shù)中基質(zhì)的作用 基質(zhì)的作用基質(zhì)的作用把樣品分子彼此分開(基質(zhì)：樣品=10，000：1)，削弱樣品分子之間的相互作用。基質(zhì)吸收激光的能量，并將部分能量傳遞給樣品。幫助樣品

2、離子化。2021/6/74常用基質(zhì)及選擇基質(zhì)樣品HCCA蛋白，多肽，糖，小分子，極性聚合物DHB 蛋白，多肽，糖，小分子，極性聚合物HPA 核苷酸Dithranol非極性聚合物2021/6/75LaserSample TargetDetectorClockTime-of-FlightMolecular MassTOF的基本原理的基本原理 2021/6/76Enabling Life Science Tools Based on Mass SpectrometryTMEk = zqU Ek = 1/2mV2V2 = 2qU z/m = 2qU / (m/z)2021/6/77triggerdio

3、de laservariableattenuator250 l/sturbo250 l/sturbo3.4 m reflector1.8 m linearMALDI TOF MS的構(gòu)成的構(gòu)成檢測器檢測器1：線性模式：線性模式檢測器檢測器2：反射模式：反射模式2021/6/78反射模式下TOF的分辨率高于線性模式2021/6/79線性模式和反射模式優(yōu)缺點(diǎn)所選方法（即flexcontrol methods）反射模式（linear）一般測試分子量小于4000的樣品分辨率高，單同位素清晰準(zhǔn)確線性模式（reflection）一般測試大分子量樣品（M4000）分辨率低，得到是平均分子量的質(zhì)荷比2021/6

4、/710樣品和標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)靶 標(biāo)準(zhǔn)品的作用：對儀器參數(shù)進(jìn)行校準(zhǔn)，使樣品測試的質(zhì)量準(zhǔn)確度更高。注意：樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，必須點(diǎn)靶方式一致，所選基質(zhì)一樣。2021/6/711內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法 內(nèi)標(biāo)法: 樣品與標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)在同一靶點(diǎn)。 優(yōu)點(diǎn)：樣品和標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)條件一致，質(zhì)量準(zhǔn)確度更高，質(zhì)荷比可準(zhǔn)確到0.02。 缺點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)品干擾樣品出峰。 外標(biāo)法: 樣品與標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)在不同靶點(diǎn)。 優(yōu)點(diǎn)：無標(biāo)準(zhǔn)品干擾 缺點(diǎn)：質(zhì)量準(zhǔn)確度低，質(zhì)荷比準(zhǔn)確到0.1。2021/6/712MALDI常用點(diǎn)靶方法 干滴法（Dried Droplet） 樣品和基質(zhì)充分混合，點(diǎn)樣樣品靶上。注意：以HCCA和DHB為基質(zhì)的樣品，一般用干滴法點(diǎn)靶薄層法

5、先將基質(zhì)點(diǎn)于靶上，帶基質(zhì)結(jié)晶后，再把樣品溶液點(diǎn)于基質(zhì)的層上。注意：以HPA為基質(zhì)的樣品，都要采用薄層法。2021/6/713matrixanalytesample solutionsample depositionAnalyte dispersed throughout matrix crystalsEnabling Life Science Tools Based on Mass SpectrometryTM2021/6/714MALDI-TOF質(zhì)譜儀的使用標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)靶；樣品點(diǎn)靶；進(jìn)樣品靶；質(zhì)譜測試和圖譜保存：flexcontrol軟件；圖譜讀取和分析：flexanalysis軟件2021/6

6、/715點(diǎn)靶注意事項 移液槍的使用 取不同試劑，需要更換一次性槍頭。 點(diǎn)靶注意事項 防止基質(zhì)污染，防止標(biāo)準(zhǔn)品污染，防止樣品靶污染，防止試劑污染 防止樣品靶跌落 點(diǎn)靶時，槍頭請勿接觸樣品靶（懸點(diǎn)） 點(diǎn)完靶，請在靶表相應(yīng)位置標(biāo)明樣品名2021/6/716進(jìn)靶和退靶點(diǎn)擊儀器右側(cè)面的綠色按鈕（load and eject按鈕）。在flexControl軟件里，點(diǎn)擊carrier后面按鈕進(jìn)退靶按鈕進(jìn)退靶按鈕2021/6/717質(zhì)譜測試和圖譜保存質(zhì)譜測試的軟件是：flexcontrol打開軟件選擇方法校準(zhǔn)儀器的參數(shù)（與與ESI-MS（LCQ）差別）差別）掃描樣品保存數(shù)據(jù)上傳數(shù)據(jù)至大型儀器管理平臺文件系統(tǒng)2

7、021/6/718打開桌面打開桌面Flexcontrol軟件軟件雙擊打開雙擊打開flexcontrol2021/6/719選擇方法選擇方法選擇方法選擇方法2021/6/720方法的選擇根據(jù)分子量大小分子量大小選擇相應(yīng)的方法方法路徑：D:methodsflexcontrolmethodsusual method一般樣品正離子都能出峰；對于正離子模式不出峰的樣品，改換為負(fù)離子模式的方法掃描。更換方法時，對以前的方法不要不要保存。2021/6/721選擇方法L: 線性模式R: 反射模式P: 正離子模式N: 負(fù)離子模式PepMix: 多肽混合物，適合范圍700-4000 DaProtMix: 蛋白混合

8、物，適合范圍5000 20000 DaClinProt: 多肽/蛋白化合物，適合范圍1000 20000Da66kDa: 大分子蛋白，適合范圍20000-100000 DaProteomics_HPC: 高精度校正，適合范圍700-4000 DaRP_lowmolecular_HPC高精度校準(zhǔn)，適合范圍100-1000Da2021/6/7222. 反射模式；正離子；高精度；反射模式；正離子；高精度；700-4000Da；與與RP_PepMix.par差別不大差別不大1. 反射模式；正離子；反射模式；正離子；700-4000Da3. 線性模式；正離子；線性模式；正離子；700-4000Da4.

9、反射模式；負(fù)離子；反射模式；負(fù)離子；700-4000Da5. 線性模式；正離子；線性模式；正離子；5000-20000Da6. 線性模式；負(fù)離子；線性模式；負(fù)離子；700-4000Da7. 反射模式；正離子；反射模式；正離子；100-10002021/6/723Flexcontrol的按鈕檢測范圍，可微調(diào)檢測范圍，可微調(diào)掃描掃描區(qū)區(qū)放大放大表峰表峰顯示單次掃描顯示單次掃描顯示疊加圖顯示疊加圖2021/6/724保存數(shù)據(jù)的按鈕2021/6/725校準(zhǔn)儀器的參數(shù)2021/6/726掃描標(biāo)準(zhǔn)品時，出峰太弱，多疊加幾次。點(diǎn)擊Calibrate，選中疊加圖，點(diǎn)擊自動校準(zhǔn)（automatic assign

10、），點(diǎn)擊apply，即完成自動校正。如果自動校準(zhǔn)通過不了，進(jìn)行手動校準(zhǔn)。注意：必須有三個以上的點(diǎn)匹配上，匹配點(diǎn)越多越好2021/6/727手動校準(zhǔn)手動校準(zhǔn)2021/6/728掃描樣品和保存數(shù)據(jù)找到樣品點(diǎn)的位置掃描樣品，疊加并保存數(shù)據(jù) 注意：數(shù)據(jù)要保存到課題文件夾內(nèi)，例如：劉育課題組數(shù)據(jù)保存到D:dataLiuyu2011062021/6/729在flexAnalysis打開保存的路徑樣品的名字保存的是疊加圖FlexAnalysis方法，可不選擇2021/6/730數(shù)據(jù)的上傳 找到所保存的數(shù)據(jù)文件 右鍵點(diǎn)擊發(fā)送到壓縮文件夾（zipped） 打開大型儀器管理系統(tǒng)網(wǎng)站（）文件系統(tǒng)，上傳壓縮后的數(shù)據(jù)文件夾。2021/6/7312021/6/732MALDI質(zhì)譜圖解析 常見離子峰： 正電荷模式：加質(zhì)子峰；加合堿金屬峰（加Na+峰；加K+峰）;減e-峰 負(fù)電荷模式：加e-峰，加Cl- 多出現(xiàn)單電荷分子離子峰，雙電荷和多電荷峰弱或幾乎不出現(xiàn)。2021/6/733MALDI-TOF對樣品的要求 MALDI優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：耐受高濃度的鹽、緩沖劑和其他非揮發(fā)