基因克隆題源

1、1、 限制性核酸內(nèi)切酶：簡稱限制酶，是一類能夠識別雙鏈DNA分子中某些特定的核苷酸序列，并在該序列切割DNA雙鏈結構的核酸內(nèi)切酶。2、 同尾酶：末端是相同的限制性核酸內(nèi)切酶。3、 DNA聚合酶：是指那些以DNA或RNA為模板催化合成互補新鏈的酶，這類沒大都需要一個引物來引發(fā)DNA的聚合作用，參與DNA復制和DNA損傷的修復。4、 DNA連接酶：簡稱連接酶，是指在雙鏈DNA分子單鏈間斷處或是兩條DNA片段接頭位置上相鄰的5P和3OH之間催化形成一個磷酸二酯鍵，使兩個DNA片段或DNA單鏈間斷連接起來的一種酶。5、 基因克隆技術：是包括把來自不同生物的基因同有自主復制能力的載體DNA在體外人工連接

2、，構建成新的重組的DNA，然后送入受體生物中去表達。從而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)和狀態(tài)的轉移和重新組合。6、 載體： 要把一個有用的基因通過基因工程手段送進生物細胞中，需要運載工具，攜帶外源基因進入受體細胞的這種工具叫載體。7、 質(zhì)粒：是細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子，是一類亞細胞有機體，結構簡單，沒有蛋白質(zhì)外殼，沒有細胞外的生命周期，可以在宿主細胞內(nèi)獨立增殖，可以隨宿主細胞的分裂而被遺傳下去。8、 轉化：是感受態(tài)的大腸桿菌細胞捕獲和克隆或表達質(zhì)粒DNA分子的基因轉化方法。9、 轉染：是感受態(tài)的大腸桿菌細胞捕獲和表達噬菌體DNA分子的基因轉化方法。10、感受態(tài)細胞：為了有效地使細菌吸收外源 DNA分

3、子，通常要對它們進行一些物理或化學處理，處理后的細胞吸收外源DNA分子的能力大大提高，這種細胞被稱為感受態(tài)細胞。11、藍白篩選：當帶有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中加有X-gal及一種ß-半乳糖苷酶的誘導物IPT是，那些能合成完整ß-半乳糖苷酶的未重組子就會因它能酶解X-gal而變成深藍色，而重組子因lacz基因被破壞不能合成完整的ß-半乳糖苷酶而呈白色。12、融合蛋白：由一條短的多肽和真核蛋白質(zhì)結合在一起的蛋白。13、開放閱讀框：在DNA鏈上，由蛋白質(zhì)合成的起始密碼開始，到終止密碼子為止的一個連續(xù)編碼序列。14、星活性：是指在非最適的反應條件下，有些酶的識別特異性會降低，

4、表現(xiàn)出松弛的專一性。15、基因組文庫：將某種生物的全部遺傳組成（DNA）切成適當長度的片段，連接在載體上，轉化到宿主細胞中而構建的基因文庫。16、cDNA文庫：通過一系列的酶催作用，使總Poly（A）mRNA轉變成雙鏈cDNA群體，并插入到適當?shù)妮d體分子上，然后再轉化給大腸桿菌寄主菌株的細胞內(nèi)。如此便構成了包含著所有基因編碼序列的cDNA基因文庫。17、目的基因表達系統(tǒng)：泛指目的基因與表達載體重組后，導入合適的宿主細胞，并能在其中有效表達，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物（目的蛋白）18、間斷：在DNA的一條鏈上某一位置兩個相鄰的核苷酸之間的磷酸二酯鍵發(fā)生斷裂。19、粘性末端：大多數(shù)限制性核酸內(nèi)切酶在DNA的

5、兩條鏈錯開24個核苷酸切斷，這樣產(chǎn)生的DNA末端會帶有5突出或是3突出的DNA單鏈，這種末端稱為粘性末端。20、質(zhì)粒的不親和性：是指沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。其基礎是由于它們在復制功能之間的相互干擾造成的。一、 填空題1.（1973年）被評定為基因工程誕生之年。而Cohen創(chuàng)立了基因工程的基本模型，是基因工程的創(chuàng)始人。（1996年）世界上第一只基于核移植技術的克隆動物“Dolly”誕生。2. DNA聚合酶的Klenow片段是用（枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶）切割DNA聚合酶得到的分子質(zhì)量為76kDa的大片段，具有兩種酶活性：（53

6、合成酶的活性）；（35外切核酸酶）的活性。3. 切口移位法標記DNA的基本原理在于利用（DNA聚合酶）的（53外切核酸酶）和（53合成酶）的作用。4. 反轉錄酶除了催化DNA合成外，還具有（核酸水解酶H）的作用，可以將DNA-RNA雜種雙鏈中的（RNA）水解掉。5. 就克隆一個基因來說，最簡單的質(zhì)粒載體也必須包括三分部分：（復制區(qū)）、（選擇標記）、（克隆位點）。另外，一個理想的質(zhì)粒載體必須具有低分子質(zhì)量。6. pBR322是一種改造型的質(zhì)粒，它的復制子來源于（pMB1），它的四環(huán)素抗性基因來自于（pSC101），它的氨芐青霉素抗性基因來自于（pSF2124或R質(zhì)粒）。7. pBR322的最大容

7、載能力是（6kb），DNA的最大容載能力是（23kb）。8. 既能在又能在中自我復制的載體DNA稱為（穿梭載體）。9.型限制性核酸內(nèi)切酶屬于（復合核酸酶），既具有（內(nèi)切酶的活性）又具有（甲基化酶）的活性。10. 正丁醇抽提法是用于去掉插入DNA中的（EB）。11. pUC質(zhì)粒載體的復制起點來自（pBR322），還含有大腸桿菌（-半乳糖酶基因）的啟動子及其編碼（-肽鏈）的DNA序列，此結構特稱為lacZ基因。12. taqDNA聚合酶具有一種（非模板依賴性）活性，這種活性可以在PCR產(chǎn)物的（3端）加上（一個）非配對的脫氧腺嘌呤核苷。13. 型限制性核酸內(nèi)切酶一般識別（4-6）個堿基，也有6個以上

8、的，這些序列具有（雙重螺旋對稱）的結構形式，換言之，這些核苷酸對的序列是呈（回文）結構的。14. 通過比較不同組合的限制性內(nèi)切核酸酶處理某一特定基因區(qū)域所得到的不同大小的片段，可以構建顯示該區(qū)域各限制性內(nèi)切核酸酶切點相互位置的（限制性酶切圖譜），又叫做（物理圖譜）。15. 在酶切反應管加完各種反應物后，需要離心2s，其目的是（混合均勻）和（防止部分酶切）。16. 由于DNA是由四種堿基組成的，所以任何限制性內(nèi)切核酸酶的切割頻率的理論值應該是（4n ）。17. 核酸雜交探針可分為兩大類：DNA探針和RNA探針。其中DNA探針又分為（基因組DNA）探針和（cDNA）探針。18. 限制性內(nèi)切核酸酶是

9、按屬名和種名相結合的原則命名的，第一個大寫字母取自（屬名的第一個字母），第二、三兩個字母取自（種名的前2個字母），第四個字母則用（菌株名）。19. 在抽提DNA的過程中加入異戊醇的目的是（起消泡的作用，并使蛋白質(zhì)層緊密，使水相和有機相分層較好）。20. 在采用乙醇沉淀法進行DNA溶液的濃縮時，應該向含（一價陽離子）的DNA溶液中加入（2體積）的無水乙醇，并使溫度在（-20），從而使DNA沉淀。21. 限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA常用的方法有（單酶切法）、（雙酶切法）和（部分酶切）等幾種。22. 利用載體的雙抗藥性，再次篩選真正的重組DNA分子的操作過程中需要進行（平板影 ?。?，以免出現(xiàn)大量的假陰

10、性或假陽性重組子現(xiàn)象。23. 由于RNA分子與硝酸纖維素膜結合能力相對較差，Northern印跡雜交法中采用的疊氮化的（活性濾紙或尼龍膜）。24. 具有Ampr Tets 表型的細胞所攜帶的pBR322，在其（Tet）基因內(nèi)帶有插入的外源基因。25. 經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，通過（毛細管或電導或虹吸）作用被轉移到濾膜上。26. cosmid 克隆載體能克隆（40kb）左右的外源DNA片段，所以被廣泛地用于構建基因組文庫。27. 平末端DNA分子的連接，可以利用（T4DNA）連接酶能連接平末端分子的特性直接進行載體和目的基因的連接，實現(xiàn)重組。28.（轉化反應）是使重組DNA在熱休克

11、的短暫時間內(nèi)被導入宿主細胞的過程。29.（細菌）RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子。30. 從（真核）基因轉錄的mRNA缺乏SD序列，不能結合到核糖體蛋白上。31. DNA分子連接分為（平末端連接）、（粘性末端連接）。32.（S1核酸酶）是一種特異性單鏈核苷酸內(nèi)切酶，能降解單鏈DNA和單鏈RNA，雙鏈核酸分子的單鏈區(qū)。33.（多核苷酸激酶）可以催化ATP的磷酸基團轉移至DNA或RNA的5羥基末端。34. DNA重組技術主要涉及兩大核心技術：（DNA重組）和（克隆）。35. 一個完整的基因克隆過程應包括：目的基因的獲取，（載體）的選擇與改造，（目的基因與載體）的連接，重組 DNA 分子（導入）

12、受體細胞，（篩選）出含感興趣基因的重組 DNA 轉化細胞。 36 .限制性核酸內(nèi)切酶是由（細菌）產(chǎn)生的一類識別 （細菌），并在識別位點切割（磷酸二酯）鍵的核酸內(nèi)切酶。 37. 科學家感興趣的外源基因又稱（目的基因），其來源有（制備基因組文庫）、（構建cDNA文庫）、（PCR擴增）、（人工合成DNA技術）等幾種途徑。38. 常用的目的基因與載體連接的方式有（黏性末端連接）、（平頭末端連接）、（人工接頭法）、（同源多聚尾連接法）。 49. 根據(jù)采用的克隆載體性質(zhì)不同，將重組 DNA 分子導入細菌的方法有（轉化）、（轉導）等。 40. Northern印跡雜交將（RNA）進行變性電泳后，再轉移到固相

13、支持物上與探針雜交的一種核酸分子雜交技術，可用于檢測目的基因在（轉錄）水平上的變化。41. 基因組文庫指存在于（轉化細菌或宿主細胞）內(nèi)、由克隆載體所攜帶的（所有基因組DNA片段）的集合?；蚪MDNA文庫涵蓋了基因組全部基因信息。42. cDNA文庫是指從組織細胞中分離得到純化（mRNA）的，然后以之為模板，利用（逆轉錄酶）合成其互補DNA，再復制成雙鏈片段（ cDNA ），與適當載體連接后導入受體菌內(nèi)，擴增，構建cDNA文庫。43. 基因組文庫含有組織或細胞的（DNA)信息，cDNA文庫含有組織或細胞的(mRNA）信息。44. 具有相同識別序列的限制性核酸內(nèi)切酶稱為（同裂酶）。45. 如果用限

14、制性內(nèi)切核酸酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生5突出的黏性末端，則可以用（Klenow酶填補的方法）進行3端標記。如果用限制性內(nèi)切核酸酶切割DNA產(chǎn)生的是3突出的黏性末端，則可以用（T4 DNA聚合酶）進行3端標記。46.將酵母染色體DNA的（端粒復制序列）、（自主復制序列）和（著絲粒）以及必要的選擇標記克隆到大腸桿菌智力pBR322中就構建成了YAC克隆體。47.目前常用的DNA探針標記方法有（缺口平移標記法）、（隨機引物標記法）、（末端標記法）、（酶直接標記法）及（PCR反應標記法）等。48.大腸桿菌lac操縱子由（啟動子）、（操縱子）和（結構基因）三部分組成。49.目的基因起始轉錄后，保持（mRNA的

15、有效延伸）、（終止及穩(wěn)定存在）是外源基因有效表達的關鍵。50.噬菌體基因組的中間區(qū)段約占噬菌體基因組的（40%），包括（編碼基因調(diào)節(jié)）、（溶源狀態(tài)的發(fā)生）、（維持)以及(遺傳）重組所需要的基因。51. 可用T4DNA聚合酶進行平末端DNA標記，因為這種酶具有（53 合成酶）和（35外切核酸酶）的活性。52. 人工感受態(tài)的大腸桿菌細胞在溫度為（0）時吸附DNA，在溫度為（42）時攝入DNA。53. 感受態(tài)的兩種假說：（局部原生質(zhì)化假說）；（酶受體假說）54. 基因工程的兩個基本特點：（分子水平操作）；（細胞水平表達）55. 噬菌體之所以被選為基因工程的載體，主要有兩方面的原因：它在細菌中能夠（大

16、量繁殖），這樣有利于外源DNA的擴增；對某些噬菌體如噬菌體的遺傳結構和功能研究的比較清楚，其（大腸桿菌宿主系統(tǒng)）的遺傳也研究得比較詳盡56. 噬菌體的基因組DNA為（）kb，有（60）多個基因。在體內(nèi)，它有兩種復制方式，擴增時按（凱恩斯模型）復制，成熟包裝時則是按（滾環(huán)）復制。它有一個復制起點，進行（雙）向復制。噬菌體的DNA既可以以線性存在又可以以環(huán)狀形式存在，并且能夠自然成環(huán)。其主要原因是在噬菌體線性DNA分子的兩端各有一個（12）個堿基組成的天然黏性末端。這種黏性末端可以自然成環(huán)。成環(huán)后的黏性末端部位就叫作（cos）位點。57. 重組體的篩選有兩層含義：將攜帶有（外源插入DNA片段）的克

17、隆挑選出來；將攜帶有特定外源插入片段的（重組體）挑選出來58. Northern印記和Southern印記有兩點根本的區(qū)別：印記的對象不同，（Northern印記）是RNA，（Southern印記）是DNA；電泳條件不同，（Northern印記）是變性條件，（Southern印記）是非變性條件。59. 根據(jù)外源片段提供的遺傳表型篩選重組體，必須考慮三種因素：（克隆的是完整的基因）；（使用的是表達載體）；（不含內(nèi)含子）。60. 噬菌斑形成選擇法有兩種判斷標準：（能否形成噬菌斑）；（形成斑的清晰度）。二、 判斷對錯1. 克隆是指生物體通過體細胞進行的無性繁殖，以及由無性繁殖形成的表現(xiàn)型完全相同的后

18、代個體組成的種群。×（基因型）2. 類型I限制性內(nèi)切酶屬于復合核酸酶，既具有內(nèi)切酶的活性又具有甲基化酶的活性。3. 星活性是指某種限制性核酸內(nèi)切酶在最適反應條件下，60min內(nèi)完全切割1mgDNA所需要的酶活性。×（1ug)4. 同尾酶是指識別序列不完全相同，但切割DNA產(chǎn)生的末端是相同的限制性核酸內(nèi)切酶。5. 大腸桿菌有細胞壁。6. pBR322質(zhì)粒載體上含有氨芐青霉素抗性基因和卡納霉素抗性基因。×（四環(huán)素抗性基因）7. M13噬菌體的結構式是頭尾狀的。×（纖維狀）8. 噬菌體感染大腸桿菌后，線形DNA注入細胞內(nèi)，或者進行溶菌生長途徑，黏性末端連接，成

19、為環(huán)形DNA分子。9. 重組體篩選的轉入階段，DNA分子以雙鏈的形式進入細胞。×（單鏈）10. 藍白篩選過程中，大腸桿菌株系修飾過的lacZ基因編碼-半乳糖苷酶的N末端-肽鏈。×（ C末端）11. Northern印跡雜交探針可用RNA也可用DNA。12. Northern印跡雜交的受體是DNA片段。×（RNA）13. 開放閱讀框ORF不是外顯子集合。14. 開放閱讀框ORF開始全是起始密碼子AUG。×（不全是）15. 真核生物的轉錄起始位點是加帽位點。16. 真核生物的翻譯起始位點是起始密碼子。×（不是）17. 原核基因表達系統(tǒng)不具備真核生物

20、的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達產(chǎn)物無特定的空間構象。18. 當通過RT-PCR得到cDNA片段,利用末端轉移酶將oligo(dA)加到cDNA第一鏈末端，通過另一個特異引物來擴增5區(qū),這一技術稱為RACE。×（dT）19. 末端轉移酶催化作用不需要模板。20. 將導入外緣基因DNA分子后能穩(wěn)定存在的宿主細胞稱為重組子。×(轉化子）21. 嚴謹型質(zhì)粒通常是一些具有自身傳遞功能的大質(zhì)粒。22. 轉化過程中熱擊溫度是37度。×（42度）23. SD序列與起始密碼子之間的距離為39個堿基.24. SD序列為原核生物特有。25. 質(zhì)粒提取過程中溶液I的作用是使蛋白質(zhì)和DNA變性。&

21、#215;（溶液II)26. TapDNA聚合酶具有非模板介導的核苷酸轉移酶活性，可在雙鏈DNA末端加上一個單一的3突出的dATP 。27. 藍白篩選中培養(yǎng)基涂布的IPTG是乳糖類似物。×（-半乳糖苷酶的誘導物）28. 限制性內(nèi)切酶型酶的識別與切割順序全是呈回文結構。29. DNA的濃縮中，在含一價陽離子的DNA溶液中加入1體積的無水乙醇，使DNA沉淀。×（2倍體積）對稱。三、 簡答題答：（1）DNA純度：純度越高，酶切效果越好； （2）DNA甲基化程度：甲基化的堿基將不能被酶切，所以要降低甲基化程度； （3）酶切消化反應的溫度：溫度要在酶的最適反應溫度； （4）DNA的分

22、子結構：切割超螺旋DNA的酶量比線性DNA高出許多倍； （5）緩沖液：pH和離子濃度對酶切效果也有顯著影響。答：（1）能在宿主細胞獨立地自我復制與表達； （2）分子量應較??； （3）應具有兩個以上的容易檢測的遺傳標記； （4）應具有位于遺傳標記基因內(nèi)的多個酶切單一位點。3. 簡述pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點答：（1）具有較小的分子量； （2）具有Amp和Tet兩種抗性基因可供作轉化子的選擇記號； （3）具有較高的拷貝數(shù)。答：（1）具有很小的分子量 （2）具有很高的拷貝數(shù) （3）可用組織化學法檢測重組體，如藍白篩選，簡單方便 （4）具有多克隆位點噬菌體的生長途徑答：噬菌體感染大腸桿菌之后，線性DN

23、A注入細胞內(nèi)， （1）進入溶菌生長途徑： 形成環(huán)形DNA分子，合成蛋白質(zhì)，復制DNA，包裝成子代噬菌體顆粒，并使宿主細胞破裂，釋放噬菌體感染新細胞。 （2）進入溶源生長途徑：DNA整合到宿主細胞染色體上，隨著染色體的復制而復制。只有在一定條件下，DNA才會脫離染色體，重新進入溶菌生長途徑。答：（1）局部原生質(zhì)體化假說 即局部失去了細胞壁結構或局部溶解細胞壁，使外源DNA分子能通過質(zhì)膜進入細胞 （2）酶受體假說 感受態(tài)細胞表面形成一種能接受DNA的酶切位點，使DNA分子能進入細胞。答：（1）吸附階段：完整的雙鏈DNA分子吸附于感受態(tài)細胞的表面； （2）轉入階段：雙鏈DNA解鏈，以單鏈的形式進入細

24、胞，另一鏈被降解； （3）自身穩(wěn)定階段：外源質(zhì)粒在細胞內(nèi)又復制成雙鏈環(huán)狀DNA； （4）表達階段：目的基因隨質(zhì)粒一起復制，并轉錄翻譯。答：（1）RNA聚合酶亞基發(fā)現(xiàn)啟動子序列與-35區(qū)結合，并進一步與-10區(qū)結合；（2）DNA解鏈，模板被暴露；（3）因子識別并起始啟動位點，開始轉錄；（4）因子解離，RNA聚合酶繼續(xù)轉錄向前移動；（5）轉錄終止。答：（1）外源基因是否插入在正確的閱讀框； （2）目的基因的有效轉錄，如啟動子的作用； （3）mRNA的有效翻譯，如SD序列的作用； （4）轉錄后，翻譯后的適當修飾和加工過程。答：（1）SD序列與rRNA的16s亞基3末端序列之間的互補程度； （2）起始

25、密碼子AUG與SD序列之間的距離以及SD序列的核苷酸組成； （3）起始密碼子之后的一個核苷酸對mRNA與核糖體的結合也有影響； （4）基因末端轉錄終止區(qū)的影響。答：（1）細菌RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子；所以載體上的啟動子要用原核細胞的啟動子。 （2）從真核基因轉錄的mRNA缺乏SD序列，不能結合到核糖體蛋白上；所以要在載體上加上SD序列。 （3）原核細胞沒有轉錄后修飾系統(tǒng)，真核基因mRNA的內(nèi)含子不能被切除，以致不能表達成蛋白；所以應從真核細胞中分離mRNA并反轉錄成cDNA來導入載體。 （4）真核基因表達的蛋白在原核細胞中不穩(wěn)定，容易被細菌蛋白酶破壞；所以應將真核基因插在幾個原核密

26、碼之后，這樣，翻譯表達出來的真核基因產(chǎn)物就與原核多肽連在一起，形成融合蛋白而不會被降解。12請簡述堿裂解法提取質(zhì)粒的原理。答案：堿裂解法是基于DNA的變性與復性差異而達到分離目的的。兩種DNA在強堿環(huán)境都會變性。由于質(zhì)粒和主染色體的拓撲結構不同，變性時前者雖然兩條鏈分離，卻仍然纏繞在一起不分開；但后者完全變性甚至出現(xiàn)斷裂，因此，當溶液pH值恢復較低的近中性水平時，質(zhì)粒的兩條小分子單鏈可迅速復性恢復雙鏈結構，但是主染色體DNA則交纏成網(wǎng)狀難以復性。在離心時，大部分主染色體與細胞碎片，雜質(zhì)等纏繞一起被沉淀，而可溶性的質(zhì)粒DNA留在上清液中。13在連接過程中，如何提高平末端的連接效率？答案：1.增加

27、連接酶的用量，通常是粘性末端連接酶用量的10倍。2.增加DNA平末端的濃度，提高平末端之間的碰撞幾率。3.適當提高連接反應的溫度，平末端連接與退火無關，適當提高反應溫度既可以提高底物末端或分子之間的碰撞幾率，又可增加連接酶的反應活性，一般選擇20-25°C適合。4.還可延長反應時間。14將目的片段重組后轉入到受體細胞中時，共有哪幾種可能進入到受體的DNA 分子？15在對重組體的篩選中，電泳篩選法中有哪兩種方法？什么時候用第一種方法？什么時候用第二種方法？這兩種方法各有什么特點？答案：直接提質(zhì)粒跑電泳及用酶切下的目的片段跑電泳兩種方法。 （1）直接提質(zhì)粒跑電泳的方法：在目的片段比較大的

28、時候用此方法。此時所用的Marker較大，因此精確度不高，由于片段較長，所用的膠濃度小。 （2）酶切后的目的片段跑電泳：在目的片段比較小的時候用此方法。此時所用的Marker較小，因此精確度較高，由于片段較短，所用的膠濃度大。16若想將一段真核生物的基因在原核生物中表達,哪些結構是一定必須的，此外在表達載體上還需哪些結構才能使基因順利表達？答案：至少需要外顯子的全部序列之和。若這段序列不含起始密碼子或終止密碼子，則都得在表達載體上加上。此外，這個載體還需要一個啟動子，SD序列及終止子。四、 問答題1、 實驗得到一原核基因，想要通過發(fā)酵獲得大量基因表達產(chǎn)物應選哪種表達系統(tǒng)？為了使目的基因高效表達

29、應注意哪些問題？基因表達產(chǎn)物又應該如何分離純化？答：原核表達系統(tǒng)。1）外源基因是否插入在正確的閱讀框架2）目的基因的有效轉錄（如啟動子的作用）3）mRNA的有效翻譯（如SD序列等作用）4）轉錄后，翻譯后的適當?shù)男揎椇图庸み^程細胞破碎離心-沉淀法-超濾、濃縮法分離特異表達蛋白-進一步分離柱層析-聚丙烯凝膠電泳2、 我們知道要實現(xiàn)外源目的基因的克隆，除了選擇理想的載體，合適的受體及成功的構建重組體外，還必須選擇合適的方法將重組DNA導入宿主細胞。簡要列舉幾種將重組DNA導入宿主細胞的方法；選擇適合的方法可以有效的提高轉化率，轉化率是轉化效率的評估指標，請問，當我們用1ng 1kb DNA進行轉化處

30、理，如果得到100個轉化子，那么計算該重組DNA的轉化效率是多少？（已知：1ng 10kb DNA的分子數(shù)為1×108個）解：1）將重組DNA導入宿主細胞的方法目前主要有：轉化、轉染、顯微注射技術、電轉化法、基因槍法、脂質(zhì)體介導法、花粉管通道法等。2）已知1ng 10 kb DNA的分子數(shù)為1×108個，則1ng1kb DNA 的分子數(shù)為1×109個，那么轉化率為100÷1×109=10-73、 實驗中有哪些方法篩選出含有DNA重組體的宿主細菌？答案：直接篩選法：1）藥物抗性檢測：用于細菌, 真菌, 植物和動物細胞的各種抗生素抗性基因-若克隆載

31、體攜帶某種抗菌性標志基因，轉化后只有含這種抗菌基因的子細菌，才能在含該抗生素的培養(yǎng)板上形成菌落；2）標志補救：轉化或轉染的外源基因表達產(chǎn)物可彌補基因缺陷性宿主菌的性狀；3）分子雜交：對于整合型載體, 則應該利用DNA雜交或RNA雜交法證實：用 探針與DNA克隆片段進行雜交，直接選擇鑒定。免疫學方法：利用特異抗體，與目的基因表達產(chǎn)物作用，進行篩選，包括免疫化學和酶免疫檢測分析。鑒定目的基因的特異表達產(chǎn)物，特異性強、靈敏度高，適用于篩選無任何選擇標記的基因4、在植物某基因編碼區(qū)的全長獲得時，某人僅有此基因的EST，且現(xiàn)在所有的數(shù)據(jù)庫中并沒有此基因的全長序列，現(xiàn)在他想要獲得此基因編碼區(qū)的所有序列，并

32、克隆至表達載體上，請你幫助他設計一下實驗。請寫出EST的中文名，并按適當?shù)捻樞?，列出所用到的酶，及其作用。答：EST：表達序列標簽。 首先提取此種植物的mRNA，進行分析mRNA的純度，是否達到下一步操作的要求。隨后進行5'RACE、3'RACE（或新RACE），獲得此基因mRAN的cDNA。將cDNA克隆至T載體上，進行測序。將通過測序獲得序列進行生物信息學分析。隨后通過帶有酶切位點的引物獲得兩端帶有酶切位點的cDNA，隨后酶切連入表達載體上。反轉錄酶以mRNA為模板復制出單鏈cDNA；DNA聚合酶以單鏈cDNA為模板合成雙鏈DNA；末端脫氧核苷酸轉移酶，在cDNA的3

33、9;端加上尾巴；（磷酸酶IP使無帽子結構的mRNA去磷酸化；煙草酸性焦磷酸酶TAP去除帽子結構；RNA連接酶將一段的RNA寡核苷酸與全長mRNA5'端相連；）用限制性內(nèi)切酶切割載體；用DNA連接酶將cDNA插入載體中。5、我們現(xiàn)有一個質(zhì)粒，圖譜如圖一、圖二，并有一段原核基因序列，我們?nèi)绾卫么溯d體讓此基因表達，并獲得表達型載體。請寫出構建載體的實驗流程，并寫出理由。T7啟動子為通用強啟動子。圖 一圖 二序列如下，共有504bp： CAACT ACAA CAGG GACA ACGA TGGT AGAT CTGA CTAG TAAA GGAG AA GA. CCAC C ACC ACCA

34、CGTG TGAT ACCA TAAT TCAT答： 首先我們分析得到從21個堿基處開始至491處是該序列的編碼區(qū)，因此我們把這段序列克隆入載體中。根據(jù)載體可知，T7啟動子為強啟動子，我們可以利用它來啟動基因的表達（需用IPTG來誘導）。根據(jù)載體圖譜可知rbs（核糖體結合位點）后的第一個ATG位于Nco I酶切位點上，且原核細胞翻譯的起始通常為離SD或rbs最近的ATG開始。因此我們可以根據(jù)基因序列設計引物，使基因上游引物都有Nco I的酶切位點，且起始密碼子與Nco I酶切位點中的ATG重合；對于下游引物，帶有載體上Nco I后面的任意一個酶切位點，且酶切位點后帶有終止密碼子，通過PCR獲得

35、此基因。隨后提取載體質(zhì)粒，并對質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進行雙酶切，然后用連接酶進行連接，轉化入感受態(tài)中，用卡那霉素進行篩選。篩選后先以含有重組質(zhì)粒的菌液或重組質(zhì)粒為模板進行PCR鑒定，得到陽性菌落后，再次陽性菌落提取質(zhì)粒進行雙酶切，電泳后若出現(xiàn)與PCR產(chǎn)物大小一致的片段，即成功獲得重組質(zhì)粒。其中感受態(tài)細胞的基因組具有能夠編碼T7DNA聚合酶的能力，例如JM109、BL21等。利用卡那霉素進行篩選因為載體上帶由此抗性基因。對于終止子，此載體上帶有T7終止子。6、 請你寫出七種DNA聚合酶及其特性與特點和用途。答：1）大腸桿菌DNA聚合酶I（全酶）:具有以單鏈為模板5'到3'DNA聚合酶的

36、活性，3'到5'外切核酸酶活性能降解單鏈或雙鏈DNA，5'到3'DNA外切核酸酶活性能降解DNA雙鏈。用途：用切口平移（缺口轉移）方法標記DNA。2) 大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）:具有5'到3'聚合酶活性和3'到5'外切酶活性。用途：補平限制酶切割DNA產(chǎn)生的3'凹端。在許多情況下，用限制酶消化DNA及隨后用Klenow片段補平3'凹端；用32PdNTP補平3'凹端，對DNA片段進行末端標記。3) T4噬菌體DNA聚合酶:具有5'到3'聚合酶活性和3'到5'

37、外切酶活性，此活性對單鏈作用比對雙鏈強。用途：補平或標記限制性內(nèi)切酶消化DNA后產(chǎn)生的3'凹端；對帶有3'突出端的DNA分子進行末端標記。4) T7噬菌體DNA聚合酶:具有5'到3'聚合酶活性，是目前所有已知DNA聚合酶中持續(xù)合成能力最強的，還有3'到5'外切酶活性。用途：用于拷貝長段模板的引物延伸反應；通過補平或交換（置換）反應進行快速末端標記。5) Taq DNA聚合酶:具有耐熱性，5'到3'DNA聚合酶的活性，和5'到3'DNA外切核酸酶活性。用途：可使特定序列擴增106倍；用于聚合酶鏈式反應（PCR），對D

38、NA片段進行體外擴增。6) 逆轉錄酶:性質(zhì)RNA指導的DNA合成反應；DNA指導的DNA合成反應；RNA的水解的反應，具有RNaseH活性。用途：將真核基因的mRNA轉錄成cDNA，構建cDNA文庫，進行克隆實驗；標記5'突出端的DNA片段；代替Klenow大片段，用于DNA序列測定。7) 末端轉移酶:是一種無需模板的DNA聚合酶，催化脫氧核苷酸結合到DNA的3'羥基端。用途：催化DNA3'末端添加同聚物；DNA3'末端標記。7、 給出下面一段序列，請寫出HindIII的識別序列最可能為哪幾個，可能產(chǎn)生哪幾種末端，寫出末端序列，并寫出限制性核酸內(nèi)切酶的分類，及其

39、各類特點及以HindIII為例說明命名規(guī)則。 AAT CCG GTT AAG CTT TCG AAT TCC GGA TCG TTA GGC CAA TTC GAA AGC TTAAGG CCT AGC答:識別序列為AAGCTT 可能產(chǎn)生平末端 AAG 5'黏性末端 A 3'黏性末端 T TTGCAA TTG TTGCAA TTGCAA限制性核酸內(nèi)切酶可分為三類，I型、II型和III型:I型限制性核酸內(nèi)切酶，屬于復合核酸酶，既具有內(nèi)切酶的活性又具有甲基化酶的活性。所識別的DNA序列長度約為十幾個核苷酸，切割位置具有不確定性。II型限制性核酸內(nèi)切酶，不但能特異性地識別DNA序列，

40、而且識別的DNA序列與酶切割DNA的位置是一致的，識別序列一般為4-8個堿基，識別序列具有回文結構，可產(chǎn)生平末端和黏性末端。III型限制性核酸內(nèi)切酶，既具有內(nèi)切酶的活性，又具有甲基化酶的活性，能識別特定的DNA序列，但切割DNA的位點往往在識別結合位點相鄰的位置。命名規(guī)則：H為宿主微生物屬名的第一個字母，大寫、斜體；in為種名的前兩個字母，小寫、斜體；d為菌株名，大小寫依菌株名而定，正體；III表示在這個菌株中發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶的順序號，羅馬數(shù)字，正體。1、T4 聚合酶與Klenow酶一樣，具有53聚合酶和3 5外切酶兩種活性，但它的3 5外切酶活性比Klenow酶強倍。該酶的DNA3 5外

41、切酶活性既能作用單鏈DNA，也能作用于雙鏈DNA，不過作用于 鏈的活性要強于鏈。2,性質(zhì)粒載體的最大容載能力是 。 3、限制性內(nèi)切酶是按屬名和種名相結合的原則命名的，第一個大寫字母取自，第二、三兩個字母取自稱 ，第四個字母則用。 4、關于細菌的感受態(tài)本質(zhì)與存在，目前主要有兩種假說，一種為 ；另一種為。5、經(jīng)過修飾的DNA最多可以插入大小的外源基因。6、型限制性內(nèi)切酶識別序列一般是個堿基，而且這些序列大多呈 結構。7、粘性末端連接技術通常有、。9、根據(jù)測定的對象不同，可將分子雜交法分為三類，鑒別DNA的雜交稱為 、鑒別RNA的雜交稱為、鑒別蛋白質(zhì)的雜交稱為 。10、在DNA的一條鏈上某一位置兩個

42、相鄰的核苷酸之間的磷酸二脂鍵發(fā)生斷裂稱為 ，而在某一位置上丟失了一個或幾個核苷酸則稱為 。11,用不對稱PCR合成單鏈DNA探針時，兩個引物的濃度比為。12.、人工感受態(tài)的大腸桿菌細胞在溫度為時吸附DNA，時攝入DNA。三、判斷是非題（每題1分，共10分，對者在括號內(nèi)填“對”；錯者在括號內(nèi)填“錯”）1、1972年，美國斯坦福大學的學者首先在體外進行了DNA改造的研究，他們把SV40 的DNA和大腸桿菌DNA分別進行切割，又將兩者連接在一起，成功地構建了第一個體外重組的人工DNA分子。（ ）2、Ecoli菌株有一種降低噬菌體DNA生物活性的功能，同時又對噬菌體DNA分子進行修飾，使其在下一次重新

43、感染菌株過程中能有效生長，這兩個功能前者稱為“限制”，后者稱為“修飾”。（ ）3、類型限制性內(nèi)切酶識別的DNA順序長約十幾個核苷酸，在離識別序列一端約1000bp的位置上切割DNA。（ ）4、T4噬菌體DNA聚合酶是所有已知DNA聚核酶中持續(xù)合成能力最強的一個，具有53聚合酶活性及35外切核酸酶活性。（ ）5、末端轉移酶的催化作用不需要模板，并強烈偏向于以帶3突出端的DNA為受體。（ ）6、Ecoli連接酶和T4DNA連接酶都有連接單鏈多核苷酸的功能，這種功能RNA連接酶也聚有。（ ）7、接合型質(zhì)粒又叫做傳遞性質(zhì)粒，可以從一個細胞轉移至培養(yǎng)液里的所有其他細胞中。（ ）8、在細菌中，能發(fā)展感受態(tài)

44、的細胞只占少數(shù)，而且只有萬分之一的的質(zhì)粒分子能夠進入感受態(tài)細胞，在攝入質(zhì)粒DNA后能良好增殖的菌體也只有及少數(shù)。（ ）9、在DNA包裝時，包裝系統(tǒng)對DNA的大小有嚴格的要求，只有長度與野生型DNA長度完全相等的重組DNA才能得到有效的包裝。（ ）10、外源基因?qū)胝婧思毎男瘦^高，而且在真核細胞內(nèi)，由于外源基因表達的蛋白可被糖基化，成為糖蛋白。（ ）4、已知某一內(nèi)切核酸酶在一環(huán)狀DNA上有三個切點，因此，用此酶切割該環(huán)狀DNA，可得到三個片段。5、EGTA是鎂離子螯合劑，加入反應液后，可以抑制所有需要鎂離子作為輔助因子的酶活性。6、型限制性內(nèi)切核酸酶與型限制性酶的限制與修飾作用來源于兩種不同

45、的酶，而型酶則屬于復合核酸酶。7、 T4 DNA連接酶和連接酶都能催化雙鏈DNA和單鏈DNA的連接8,外源基因（或DNA片段）插入到某一基因內(nèi)的位點后，這個基因不再有任何功能。10、pBR322可以用于粘性末端連接、平末端連接和同聚物加尾法連接，無論用哪種方法連接，都可以用同一種酶回收外源片段。1、200，單鏈DNA，雙鏈DNA2、3545 Kb。 3、細菌屬名，細菌種名的前兩個字母，菌株的類型4、局部原生質(zhì)體化假說，5、10Kb20Kb。6、46,回文。7、銜接體技術、接合體技術、同聚體加尾技術。9、Southern Blot 、 Northern Blot、 Western Blot 。1

46、0、間斷，缺刻 。1、錯2、對3、對4、錯5、對6、錯7、對8、對9、錯10、錯1、在基因工程中，載體應具備的一些基本性質(zhì)。答：第一，載體必須具有能夠在某些宿主細胞中獨立地自我復制和表達的能力。只有這樣，外源目的基因裝入該載體后，才能在載體的帶動下一起復制，達到無性繁殖的目的。第二、載體DNA的分子量應該較小，既可在受體細胞內(nèi)擴增較多的拷貝，又便于結合更大的目的基因，同時在實驗操作中不易被機械性剪切，而且易于從宿主細胞中分離并進行純化。第三，載體上最好應具有兩個以上的容易檢測的遺傳標記（如抗藥性基因等），以賦予宿主細胞以不同的表型。第四，載體應具有多個限制性內(nèi)切酶的單一切點，這些單一酶切位點越

47、多，就越容易從中選出一種酶，使它在目的基因上沒有切點，保持目的基因的完整性。載體上的單一酶切位點最好是位于檢測表型的遺傳標記之內(nèi)。這樣目的基因是否已連接載體就可以通過這一表型的改變與否而得知，有利于篩選重組體。2、 堿裂解法制備質(zhì)粒DNA的實驗原理是什么？答：堿裂解法是一種用得最廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，它是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復性的差異而達到分離的目的，當細胞在有NaOH和SDS的溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與染色體DNA發(fā)生變，加入溶液醋酸鉀中和后，質(zhì)粒DNA復性，質(zhì)粒DNA以原來的構型保存在原溶液中，進行離心后，蛋白質(zhì)與染色體DNA隨細胞碎片沉淀下來，質(zhì)粒DNA則留在上清液中。

48、1、 YAC載體。答：YAC是酵母人工染色體Yeast Artificial Chromosome的縮寫。真核生物染色體有幾個部分是最為關鍵的，一是著絲粒，它主管染色體在細胞分裂過程中正確地分配到各子細胞中，二是端粒，端粒位于染色體的末端，它們對于染色體末端的復制以及防止染色體被核酸外切酶切斷具有重要意義，三是復制起點。YAC帶有天然染色體所有的功能元件，包括一個著絲粒，一個DNA復制起點，兩個端粒，由于酵母染色體DNA至少有幾百Kb長，因此人工染色體所能裝進的外源DNA片段可達到幾百Kb長，最大達到1000 Kb長，這是質(zhì)粒與粘粒半不到的。2、 請說出在細菌中l(wèi)acZ基因的“藍-白”篩選原理

49、。答：有些株系的帶有修飾過的lacZ基因，只編碼半乳糖苷酶的肽，即缺少lacZ的lacZ基因（lacZ基因編碼半乳糖苷酶的一部分），這些株系的細胞只有吸收了向PUC8這樣的帶有丟失的lacZ基因的質(zhì)粒分子的情況下，才能夠合成完整的半乳糖苷酶。半乳糖苷酶可以將Xgal分解成一種深藍色的產(chǎn)物，這個反應很靈敏。當帶有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中加有Xgal及一種半乳糖苷酶的誘導物IPTG時，那些能合成完整半乳糖苷酶的未重組克隆就會因它能酶解Xgal而變成深藍色，而重組子因lacZ基因被破壞不能合成完整的半乳糖苷酶而呈白色，此謂藍白選擇。五、問答題（10分）試述RAPD技術。答：1、基本原理：RAPD是隨即擴

50、增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA）的英文縮寫，建立于PCR技術基礎上，如果雙鏈DNA分子在一定長度內(nèi)具有反向平行又與引物互補的片段，利用一系列不同的隨即排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈為引物，模板在9294變性解鏈后，在足夠低的溫度下根據(jù)堿基互補法則，單個引物退火到基因組DNA模板兩條反向鏈的不同位置上，在有足夠DNA聚合酶活性的條件下，dNTP從引物的3端摻入，從引物延伸到一定長度，得到一段新的互補DNA鏈，在反應中，某一引物可能會與單鏈DNA的多個位點互補結合，但只有這些引物的位置是在彼此可擴增的距離內(nèi)（引物間距為2002000bp），那么不連續(xù)

51、的分子量為2002000bp的DNA片段就會通過PCR產(chǎn)生。經(jīng)過40個循環(huán)后就可以合成240條新鏈。如此高產(chǎn)的DNA片段經(jīng)電泳分離和EB染色后，可直接在紫外光下觀察。2、RAPD反應體系：模板DNAdNTP 10XPCR緩沖液 引物Taq DNA聚合酶水補足體積溫度循環(huán)：94預變性2min 94變性30 s；36退火30 s；72延伸30 s 共3540循環(huán)72延伸7 min3、 技術問題：（1）引物：引物的合成是隨機的，但必需滿足以下條件，引物的長度以10個堿基為宜，引物太短結合到模板DNA分子上有困難，引物太長，成本提高，且合成多態(tài)性DNA的可能性降低。（2）Mg2+濃度的要求：任何一種酶

52、都要求最適的反應條件。Taq DNA聚合酶需要Mg2+激活。由于引物和模板的雙鏈雜交體的解鏈和退火溫度受二價離子的影響，因此必需運用梯度試驗確定擴增反應的最佳Mg2+。4、RAPD技術的應用：RAPD技術簡單、容易掌握。在短期內(nèi)可獲得大量的遺傳標記，這些優(yōu)點逐漸被人們接受后，發(fā)展神速，在生物學的諸多領域，如遺傳育種、生物多樣性、細胞生物學、園藝學、植物生理與病理、物種起源與進化的研究中得到廣泛應用，對于流行病診斷、法醫(yī)鑒定等醫(yī)療、環(huán)保與公安部門也具有使用價值。主要應用：遺傳指紋作圖、檢測遺傳多樣性與穩(wěn)定性（品種檢定、物種起源與進化）1、200，單鏈DNA，雙鏈DNA2、3545 Kb。3、細菌

53、屬名，細菌種名的前兩個字母，菌株的類型4、局部原生質(zhì)體化假說，5、10Kb20Kb。6、46,回文。7、銜接體技術、接合體技術、同聚體加尾技術。9、Southern Blot 、 Northern Blot、 Western Blot 。10、間斷，缺刻 。3、載體DNA分子轉化進入細菌感受態(tài)細胞的四個階段是什么？答：第一個是吸附階段，完整的雙鏈DNA分子吸附于感受態(tài)細胞的表面，第二個為轉入階段，雙鏈的DNA分子解鏈，以單鏈的形式進入細胞，而另一鏈則被降解；第三階段是自身穩(wěn)定階段，外源質(zhì)粒DNA在細胞內(nèi)又復制成雙鏈環(huán)狀DNA；第四階段是表達階段，即目的基因隨同質(zhì)粒的復制子一起復制，并被轉錄、翻譯。（ ）2、Bal 31核酸酶是Ca2+依賴性的，在反應混合物中加入EDTA便可以抑制它的活性。（ ）3、DNA聚合酶有三種酶活性，其中35外切酶的活性在較多的dNTP存在下，常被5 3合成酶的活性所掩蓋。（ ）4、有A、B、C三個質(zhì)粒，因為A和B能夠共存于一個細胞，A和C也可共存于同一個細胞，所以B和C一定能夠共存于同一個細胞。（ ）5、氯霉素擴增DNA時，加氯霉素的時間是重要的，因為加得太早，菌數(shù)不夠；加入時間過遲，菌齡過老，容易自溶。（ ）6、用限制性內(nèi)切核酸酶切割載體DNA、供體DNA后，要加入EDTA-SDS終止液使限制性內(nèi)切核酸酶失活，這樣有利