外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用

1、 外顯子捕獲外顯子捕獲 余晗余晗 2017120120171201 外顯子 是真核生物基因的一部分，它在剪接后仍會(huì)被保存下來，并可在蛋白質(zhì)生物合成過程中被表達(dá)為蛋白質(zhì)。 在人類基因中大約有180,000個(gè)外顯子，占人類基因組的1%，約30MB。人類基因組的蛋白編碼區(qū)域大約包含85%的致病突變。 外顯子測(cè)序是指利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的基因組分析方法。是一種選擇基因組的編碼序列的高效策略，外顯子測(cè)序相對(duì)于基因組重測(cè)序成本較低，對(duì)研究已知基因的SNP、Indel等具有較大的優(yōu)勢(shì)。 對(duì)腫瘤基因突變檢測(cè)具有顯著意義，因?yàn)橥怙@子測(cè)序容易提高深度，可以輕易達(dá)到1

2、00X、200X。 而因?yàn)橥怙@子捕獲是有偶然性的，對(duì)小片段結(jié)構(gòu)變異、拷貝數(shù)變異很難檢測(cè)。 外顯子測(cè)序簡(jiǎn)介外顯子測(cè)序簡(jiǎn)介外顯子組包含合成蛋白質(zhì)所需要的重要信息序列。外顯子序列捕獲芯片（或溶液）可在同一張芯片上以高特異性和高覆蓋率捕獲研究者感興趣的目標(biāo)外顯子區(qū)域，后續(xù)測(cè)序直接解析數(shù)據(jù)。 背景介紹發(fā)現(xiàn)外顯子區(qū)的絕大部分的疾病相關(guān)變異可發(fā)現(xiàn)常見變異和頻率5%低頻突變只對(duì)基因組的約1%測(cè)序，更加經(jīng)濟(jì)、高效人的全基因是3G，如果要把全基因都測(cè)一下，一般要平均30 x的覆蓋。也就是要90G的數(shù)據(jù)。這樣的測(cè)序量，成本大約是一個(gè)樣本6萬多元。如果樣本多的話，費(fèi)用上可能負(fù)擔(dān)不起。而外顯子只占人全部基因序列的1%，

3、而且是最關(guān)鍵的1%。把外顯子全都測(cè)了，就相當(dāng)于抓住了問題的主要矛盾。同時(shí)測(cè)序量大大降低。這就是用外顯子測(cè)序來替代全基因重測(cè)序的第一個(gè)原因。在相同預(yù)算情況下，可提供更高深度測(cè)序第二個(gè)原因是在做腫瘤測(cè)序的時(shí)候，腫瘤本身存在著較大異質(zhì)性。腫瘤的基因序列是不穩(wěn)定的，一直在變的，也就是腫瘤的深部、淺部可能其基因序是不一樣的。為了測(cè)出各種突變，就需要有較深的測(cè)序重度，比如100 x、甚至200 x的測(cè)序深度。這時(shí)候外顯子測(cè)序就可以做到高的測(cè)序覆蓋度，同時(shí)費(fèi)用不會(huì)太高。 技術(shù)優(yōu)勢(shì)劣勢(shì)：外顯子測(cè)序是全基因重測(cè)序的一個(gè)較為經(jīng)濟(jì)的替代手段，對(duì)研究基因的SNP、Indel等具有較大的優(yōu)勢(shì)，但無法研究基因組結(jié)構(gòu)變異如

4、染色體斷裂重組等，一般在疾病研究中，會(huì)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序一起研究。 目前市場(chǎng)主要外顯子捕獲試劑盒目前市場(chǎng)主要外顯子捕獲試劑盒SeqCap EZ Human Exome Library v3.0 （Roche）SureSelectXT Human All Exon V6 （Agilent）TruSeq Exome Library Prep Kit （Illumina）TruSeq Rapid Exome Library Prep Kit （Illumina） 四種測(cè)序試劑盒比較四種測(cè)序試劑盒比較Nimblegen和Illumina的捕獲試劑盒中的探針是DNA探針，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)；Agilent的捕獲試劑

5、盒是RNA探針，有可能RNA不是很穩(wěn)定。 Roche 羅氏2008 年推出 NimbleGen 序列捕獲2.1M 外顯子組芯片，隨之在 2009 年底推出的 EZ 外顯子組序列捕獲能提供液相的工作流程并以 DNA 液相探針雜交來捕獲目的片段。 SeqCap EZ Human Exome Library使用高密度探針的方法，主要是利用雜交和 DNA 微陣列技術(shù)基因分離原理來捕獲目標(biāo)區(qū)域。產(chǎn)物可以覆蓋20000個(gè)以上的基因，超過二百萬個(gè)DNA寡核苷酸探針捕獲目標(biāo)區(qū)域，覆蓋區(qū)域的總大小可以達(dá)到64 Mb，編碼區(qū)覆蓋度達(dá)到97%以上，而且檢測(cè)靈敏度較高。 Library Prep KitPure Ca

6、pture Bead KitAdapter Kit (A and/or B)pcr ReadyMixHybridization and Wash KitDNA Covaris打斷儀DNA 真空濃縮儀金屬浴片段大?。?80220bp測(cè)序平臺(tái)：Illumina Genome Analyzer II、HiSeq 或MiSeq 測(cè)序儀實(shí)驗(yàn)周期：2天 Roche詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)1.雜交（47，16-20h）注意事項(xiàng)： Roche詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)16到20cot1-DNA Roche詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié) Roche詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié) Roche詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié) 外顯子捕獲

7、效率是什么？外顯子捕獲效率是什么？外顯子測(cè)序過程中要用到雜交過程。在人的染色體上有許多與外顯子有同源性的部分，這些有同源性的部分很可能在雜交過程中也被捕獲下來。所以，測(cè)到的序列中，有一部分不是外顯子序列。我們把測(cè)序得是外顯子的部分占全部測(cè)序序列的比列稱為捕獲效率。 Nimblegen大約是70% Agilent大約是60% Illumina大約是50% Roche詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)2.磁珠捕獲及洗脫 洗脫試劑配制-洗捕獲磁珠-孵育捕獲-洗脫非目標(biāo)核酸 Roche詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)3.pcr擴(kuò)增9-11 Roche詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié) AgilentSureSelectXT Hu

8、man All Exon V61 SureSelect Library Prep Kit.2 SureSelect Target Enrichment Kit Indexing Hyb Module Box #23 Herculase II Fusion DNA Polymerase4 SureSelect Target Enrichment Kit Box #1片段大?。?50-200bp測(cè)序平臺(tái)： Illumina HiSeq、 MiSeq 實(shí)驗(yàn)周期：2天 illumina Illumina, TruSeq Exome Enrichment Kit 是近年來剛推出的一種溶液型的序列捕獲方法，利用雜交選擇分離出人類基因組中的目的外顯子區(qū)域。 通過與目標(biāo)區(qū)域特異的生物素標(biāo)記DNA探針雜交，富集目標(biāo)區(qū)域，富集的DNA片段隨后從磁珠上洗脫，并雜交進(jìn)行第二次富集反應(yīng)，從而提高目的片段捕獲的特異性。 而且較其他產(chǎn)品，i