光學顯微鏡的結構與使用方法

1、【 目的要求 】1、熟悉光學顯微鏡的主要構造及其性能。2、掌握低倍鏡及高倍鏡的使用方法。3、初步掌握油鏡的使用方法。4、了解光學顯微鏡的維護方法?！?實驗原理 】光學顯微鏡(light microscope)是生物科學和醫(yī)學研究領域常用的儀器，它在細胞生物學、組織學、病理學、微生物學及其他有關學科的教學研究工作中有著極為廣泛的用途，是研究人體及其他生物機體組織和細胞結構強有力的工具。光學顯微鏡簡稱光鏡，是利用光線照明使微小物體形成放大影像的儀器。目前使用的光鏡種類繁多，外形和結構差別較大，有些類型的光鏡有其特殊的用途，如暗視野顯微鏡、熒光顯微鏡、相差顯微鏡，倒置顯微鏡等，但其基本的構造和工作原

2、理是相似的。一臺普通光鏡主要由機械系統(tǒng)和光學系統(tǒng)兩部分構成，而光學系統(tǒng)則主要包括光源、反光鏡、聚光器、物鏡和目鏡等部件。光鏡是如何使微小物體放大的呢？物鏡和目鏡的結構雖然比較復雜，但它們的作用都是相當于一個凸透鏡，由于被檢標本是放在物鏡下方的12倍焦距之間的，上方形成一倒立的放大實相，該實相正好位于目鏡的下焦點（焦平面）之內，目鏡進一步將它放大成一個虛像，通過調焦可使虛像落在眼睛的明視距離處，在視網(wǎng)膜上形成一個直立的實像。顯微鏡中被放大的倒立虛像與視網(wǎng)膜上直立的實像是相吻合的，該虛像看起來好像在離眼睛25cm處。分辨力是光鏡的主要性能指示。所謂分辨力(resolving power)也稱為辨率

3、或分辨本領，是指顯微鏡或人眼在25cm的明視距離處，能清楚地分辨被檢物體細微結構最小間隔的能力，即分辨出標本上相互接近的兩點間的最小距離的能力。據(jù)測定，人眼的分辨力約為100 µm。顯微鏡的分辨力由物鏡的分辨力決定，物鏡的分辨力就是顯微鏡的分辨力，而目鏡與顯微鏡的分辨力無關。光鏡的分辨力（R）（R值越小，分辨率越高）可以下式計算：這里n為聚光鏡與物鏡之間介質的折射率（空氣為1、油為1.5）；q 為標本對物鏡鏡口張角的半角，sin的最大值為1；l 為照明光源的波長（白光約為）。放大率或放大倍數(shù)是光鏡性能的另一重要參數(shù)，一臺顯微鏡的總放大倍數(shù)等于目鏡放大倍數(shù)與物鏡放大倍數(shù)的乘積。一、光學

4、顯微鏡的基本構造及功能（一）機械部分1、鏡筒：為安裝在光鏡最上方或鏡臂前方的圓筒狀結構，其上端裝有目鏡，下端與物鏡轉換器相連。根據(jù)鏡筒的數(shù)目，光鏡可分為單筒式或雙筒式兩類。單筒光鏡又分為直立式和傾斜式兩種。而雙筒式光鏡的鏡筒均為傾斜的。鏡筒直立式光鏡的目鏡與物鏡的中心線互成45度角，在其鏡筒中裝有能使光線折轉45度的棱鏡。2、物鏡轉換器：又稱物鏡轉換盤。是安裝在鏡筒下方的一圓盤狀構造，可以按順時針或反時針方向自由旋轉。其上均勻分布有34個圓孔，用以裝載不同放大倍數(shù)的物鏡。轉動物鏡轉換盤可使不同的物鏡到達工作位置（即與光路合軸）。使用時注意憑手感使所需物鏡準確到位。3、鏡臂：為支持鏡筒和鏡臺的彎

5、曲狀構造，是取用顯微鏡時握拿的部位。鏡筒直立式光鏡在鏡臂與其下方的鏡柱之間有一傾斜關節(jié)，可使鏡筒向后傾斜一定角度以方便觀察，但使用時傾斜角度不應超過45度，否則顯微鏡則由于重心偏移容易翻倒。在使用臨時裝片時，千萬不要傾斜鏡臂，以免液體或染液流出，污染顯微鏡。4、調焦器：也稱調焦螺旋，為調節(jié)焦距的裝置，位于鏡臂的上端（鏡筒直立式光鏡）或下端（鏡筒傾斜式光鏡），分粗調螺旋（大螺旋）和細調螺旋（小螺旋）兩種。粗調螺旋可使鏡筒或載物臺以較快速度或較大幅度的升降，能迅速調節(jié)好焦距使物像呈現(xiàn)在視野中，適于低倍鏡觀察時的調焦。而細調螺旋只能使鏡筒或載物臺緩慢或較小幅度的升降（升或降的距離不易被肉眼觀察到），

6、適用于高倍鏡和油鏡的聚焦或觀察標本的不同層次，一般在粗調螺旋調焦的基礎上再使用細調焦螺旋，精細調節(jié)焦距。有些類型的光鏡，粗調螺旋和細調螺旋重合在一起，安裝在鏡柱的兩側。左右側粗調螺旋的內側有一窄環(huán)，稱為粗調松緊調節(jié)輪，其功能是調節(jié)粗調螺旋的松緊度（向外轉偏松，向內轉偏緊）。另外，在左側粗調螺旋的內側有一粗調限位環(huán)凸柄，當用粗調螺旋調準焦距后向上推緊該柄，可使粗調螺旋限位，此時鏡臺不能繼續(xù)上升但細調旋仍可調節(jié)。5、載物臺：也稱鏡臺，是位于物鏡轉換器下方的方形平臺，是放置被觀察的玻片標本的地方。平臺的中央有一圓孔，稱為通光孔，來自下方光線經(jīng)此孔照射到標本上。6、鏡柱：為鏡臂與鏡座相連的短柱。7、鏡

7、座：位于顯微鏡最底部的構造，為整個顯微鏡的基座，用于支持和穩(wěn)定鏡體。有的顯微鏡在鏡座內裝有照明光源等構造。（二）光學系統(tǒng)部分光鏡的光學系統(tǒng)主要包括物鏡、目鏡和照明裝置（反光鏡、聚光器和光圈等）。1、目鏡：又稱接目鏡，安裝在鏡筒的上端，起著將物鏡所放大的物像進一步放大的作用。每個目鏡一般由兩個透鏡組成，在上下兩透鏡（即接目透鏡和會聚透鏡）之間安裝有能決定視野大小的金屬光闌視場光闌，此光闌的位置即是物鏡所放大實像的位置，故可將一小段頭發(fā)粘附在光闌上作為指針，用以指示視野中的某一部分供他人觀察。另外，還可在光闌的上面安裝目鏡測微尺。每臺顯微鏡通常配置23個不同放大倍率的目鏡，常見的有5×、

8、10×和15×（×表示放大倍數(shù)）的目鏡，可根據(jù)不同的需要選擇使用，最常使用的是10×目鏡。2、物鏡：也稱接物鏡，安裝在物鏡轉換器上。每臺光鏡一般有34之個不同放大倍率的物鏡，每個物鏡由數(shù)片凸透鏡和凹透鏡組合而成，是顯微鏡最主要的光學部件，決定著光鏡分辨力的高低。常用物鏡的放大倍數(shù)有10×、40×和100×等幾種。一般將8×或10×的物鏡稱為低倍鏡（而將5×以下的叫做放大鏡）；將40×或45×的稱為高倍鏡；將90×或100×的稱為油鏡（這種鏡頭在使用時需浸在

9、鏡油中）。在每個物鏡上通常都刻有能反映其主要性能的參數(shù)，主要有放大倍數(shù)和數(shù)值孔徑（如10025、400.65和1001.25），該物鏡所要求的鏡筒長度和標本上的蓋玻片厚度（1600.17，單位 mm）等，另外，在油鏡上還常標有“油”或“Oil”的字樣。油鏡在使用時需要用香柏油或石蠟油作為介質，這是因為油鏡的透鏡和鏡孔較小，而光線要通過載玻片和空氣才能進入物鏡中，玻璃與空氣的折光率不同，使部分光線產(chǎn)生折射而損失掉，導致進入物鏡的光線減少，而使視野暗淡，物像不清。在玻片標本和油鏡之間填充折射率與玻璃近似的香柏油或石蠟油時（玻璃、香柏油和石蠟油的折射率分別為1.52、1.51、1.46，空氣為1），

10、可減少光線的折射，增加視野亮度，提高分辨率。物鏡分辨力的大小取決于物鏡的數(shù)值孔徑（numerial aperture,N.A.），N.A.又稱為鏡口率，其數(shù)值越大，則表示分辨力越高。圖1-3 物鏡的性能參數(shù)及工作距離C 線為蓋玻片的的上表面，10´物鏡的工作距離為；40´物鏡的工作距離為；10/0.25、40/0.65、100/1.25表示鏡頭的放大倍數(shù)和數(shù)字孔徑。160/0.17表示顯微鏡的機械鏡筒長度（標本至目鏡的距離）和蓋玻片的厚度。即鏡筒長度為160mm，蓋玻片厚度為。不同的物鏡有不同的工作距離。所謂工作距離是指顯微鏡處于工作狀態(tài)（焦距調好、物像清晰）時，物鏡最下端

11、與蓋玻片上表面之間的距離。物鏡的放大倍數(shù)與其工作距離成反比。當?shù)捅剁R被調節(jié)到工作距離后，可直接轉換高倍鏡或油鏡，只需要用細調螺旋稍加調節(jié)焦距便可見到清晰的物像，這種情況稱為同高調焦。不同放大倍數(shù)的物鏡也可從外形上加以區(qū)別，一般來說，物鏡的長度與放大倍數(shù)成正比，低倍鏡最短，油鏡最長，而高倍鏡的長度介于兩者之間。3、聚光器：位于載物臺的通光孔的下方，由聚光鏡和光圈構成，其主要功能是光線集中到所要觀察的標本上。聚光鏡由23個透鏡組合而成，其作用相當于一個凸透鏡，可將光線匯集成束。在聚光器的左下方有一調節(jié)螺旋可使其上升或下降，從而調節(jié)光線的強弱，升高聚光器可使光線增強，反之則光線變弱。光圈也稱為彩虹闌

12、或孔徑光闌，位于聚光器的下端，是一種能控制進入聚光器的光束大小的可變光闌。它由十幾張金屬薄片組合排列而成，其外側有一小柄，可使光圈的孔徑開大或縮小，以調節(jié)光線的強弱。在光圈的下方常裝有濾光片框，可放置不同顏色的濾光片。4、反光鏡：位于聚光鏡的下方，可向各方向轉動，能將來自不同方向的光線反射到聚光器中。反光鏡有兩個面，一面為平面鏡，另一面為凹面鏡，凹面鏡有聚光作用，適于較弱光和散射光下使用，光線較強時則選用平面鏡（現(xiàn)在有些新型的光學顯微鏡都有自帶光源，而沒有反光鏡；有的二者都配置）。二、光學顯微鏡的使用方法（）準備將顯微鏡小心地從鏡箱中取出（移動顯微鏡時應以右手握住鏡壁，左手托住鏡座），放置在實

13、驗臺的偏左側，以鏡座的后端離實驗臺邊緣約610cm為宜。首先檢查顯微鏡的各個部件是否完整和正常。如果是鏡筒直立式光鏡，可使鏡筒傾斜一定角度（一般不應超過45度）以方便觀察（觀察臨時裝片時禁止傾斜鏡臂）。（二）低倍鏡的使用方法1、對光：打開實驗臺上的工作燈（如果是自帶光源顯微鏡，這時應該打開顯微鏡上的電源開關），轉動粗調螺旋，使鏡筒略升高（或使載物臺下降），調節(jié)物鏡轉換器，使低倍鏡轉到工作狀態(tài)（即對準通光孔），當鏡頭完全到位時，可聽到輕微的扣碰聲。打開光圈并使聚光器上升到適當位置（以聚光鏡上端透鏡平面稍低于載物臺平面的高度為宜）。然后用左眼向著目鏡內觀察（注意兩眼應同時睜開），同時調節(jié)反光鏡的方

14、向（自帶光源顯微鏡，調節(jié)亮度旋鈕），使視野內的光線均勻、亮度適中。2、放置玻片標本：將玻片標本放置到載物臺上用標本移動器上的彈簧夾固定好（注意：使有蓋玻片或有標本的一面朝上），然后轉動標本移動器的螺旋，使需要觀察的標本部位對準通光孔的中央。3、調節(jié)焦距：用眼睛從側面注視低倍鏡，同時用粗調螺旋使鏡頭下降（或載物臺上升），直至低倍鏡頭距玻片標本的距離小于（注意操作時必須從側面注視鏡頭與玻片的距離，以避免鏡頭碰破玻片）。然后用左眼在目鏡上觀察，同時用左手慢慢轉動粗調螺旋使鏡筒上升（或使載物臺下降）直至視野中出現(xiàn)物像為止，再轉動細調螺旋，使視野中的物像最清晰。如果需要觀察的物像不在視野中央，甚至不在視

15、野內，可用標本移動器前后、左右移動標本的位置，使物像進入視野并移至中央。在調焦時如果鏡頭與玻片標本的距離已超過了1cm還未見到物像時，應嚴格按上述步驟重新操作。（三）高倍鏡的使用方法1、在使用高倍鏡觀察標本前，應先用低倍鏡尋找到需觀察的物像，并將其移至視野中央，同時調準焦距，使被觀察的物像最清晰。2、轉動物鏡轉換器，直接使高倍鏡轉到工作狀態(tài)（對準通光孔），此時，視野中一般可見到不太清晰的物像，只需調節(jié)細調焦螺旋,一般都可使物像清晰。請注意：（1）在從低倍鏡準焦的狀態(tài)下直接轉換到高倍鏡時，有時會發(fā)生高倍物鏡碰擦玻片而不能轉換到位的情況（這種情況，主要是高倍鏡、低倍鏡不配套，即不是同一型號的顯微鏡

16、上的鏡頭），此時不能硬轉，應檢查玻片是否放反、低倍鏡的焦距是否調好以及物鏡是否松動等情況后重新操作。如果調整后仍不能轉換，則應將鏡筒升高（或使載物臺下降）后再轉換，然后在眼睛的注視下使高倍鏡貼近蓋玻片，再一邊觀察目鏡視野，一邊用粗調螺旋使鏡頭極其緩慢地上升（或載物臺下降），看到物像后再用細調螺旋準焦。（2）由于制造工藝上的原因，許多顯微鏡的低倍鏡視野中心與高倍鏡的視野中心往往存在一定的偏差（即：低倍鏡與高倍鏡的光軸不在一條直線上），因此，在從低倍鏡轉換高倍鏡觀察標本時常會給觀察者迅速尋找標本造成一定困難。為了避免這種情況的出現(xiàn)，幫助觀察者在高倍鏡下能較快找到所需放大部分的物像，可事先利用羊毛交

17、叉裝片標本來測定所用光鏡的偏心情況，并繪圖記錄制成偏心圖。具體操作步驟如下： 用在高倍鏡下找到羊毛交叉點并將其移至視野中心； 換低倍鏡觀察羊毛交叉點是否還位于視野中央，如果偏離視野中央，其所在的位置就是偏心位置； 將前面兩個步驟反復操作幾次，以找出準確的偏心位置，并繪出偏心圖。當光鏡的偏心點找出之后，在使用該顯微鏡的高倍鏡觀察標本時，事先可在低倍鏡下將需進一步放大的部位移至偏心位置處，再轉換高倍鏡觀察時，所需的觀察目標就正好在視野中央。（四）油鏡的使用方法1、用高倍鏡找到所需觀察的標本物像，并將需要進一步放大的部分移至視野中央。2、將聚光器升至最高位置并將光圈開至最大（因油鏡所需光線較強）。3

18、、轉動物鏡轉換盤，移開高倍鏡，往玻片標本上需觀察的部位（載玻片的正面，相當于通光孔的位置）滴一滴香柏油（折光率1.51）或石蠟油（折光率1.47）作為介質，然后在眼睛的注視下，使油鏡轉至工作狀態(tài)。此時油鏡的下端鏡面一般應正好浸在油滴中。4、左眼注視目鏡中，同時小心而緩慢地轉動細調螺旋（注意：這時只能使用微調節(jié)螺旋，千萬不要使用粗調節(jié)螺旋）使鏡頭微微上升（或使載物臺下降），直至視野中出現(xiàn)清晰的物像。操作時不要反方向轉動細調節(jié)螺旋，以免鏡頭下降壓碎標本或損壞鏡頭。5、油鏡使用完后，必須及時將鏡頭上的油擦拭干凈。操作時先將油鏡升高1cm，并將其轉離通光孔，先用干擦鏡紙揩擦一次，把大部分的油去掉，再用沾有少許清潔劑或二甲苯的擦鏡紙擦一次，最后再用干擦鏡紙揩擦一次。至于玻片標本上的