實驗三酵母核糖核酸的提取及測定(預習報告)

1、生物化學實驗預習報告實驗三 酵母核糖核酸的提取及測定一、研究背景RNA（核糖核酸）普遍存在于動物、植物、微生物及某些病毒和噬菌體內(nèi)，是遺傳信息的載體，由數(shù)量不等的核糖核苷酸通過磷酸二酯鍵連接而成。由于RNA在細胞內(nèi)能夠行使各種各樣的生物功能，屬酸性高分子化合物，參與蛋白質(zhì)生物合成，調(diào)控基因表達，作為核酶催化生化反應活性，對維持生物體的正常發(fā)育有著重要作用。此外，由于RNA還具有較強的保濕性、抗氧化性、強烈的紫外光吸收性、天然助長性以及抗皺防衰、防病治癌等特殊功能，1人們在研究基礎(chǔ)理論的同時逐漸開始對RNA制劑的開發(fā)及應用進行探索。RNA制劑是以RNA及其衍生物為材料，經(jīng)加工制成的產(chǎn)品，主要包括

2、從富含RNA的生物體中的提取物、自溶物或者降解產(chǎn)物加工制成的各種商品。目前，人們已經(jīng)開始逐漸接受含RNA制劑的各種產(chǎn)品，需求量日益攀升，RNA制劑已廣泛應用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、日化、環(huán)境保護等方面，具有廣闊的商業(yè)前景，形成了一大新興產(chǎn)業(yè)。但不管是理論研究還是實際應用，都面臨一個問題：RNA往往與細胞內(nèi)的其他化合物混在一起，離體之后穩(wěn)定性差、含量低，采用廉價、合適的手段分離純化得到RNA顯得至關(guān)重要。當然，人們已經(jīng)摸索出來了多種多樣的方法，這些方法各有特點，但其基本的思路和程序大致相似，基本戰(zhàn)略也是有規(guī)律可循的。另外，近年來RNA試劑盒的出現(xiàn)使方便、快速提取純度高、完整性好的RNA分子也實現(xiàn)了可

3、能。二、研究目標1.了解RNA制劑開發(fā)應用的前景和基本思路；2.掌握RNA分離純化的設計思想及主要的操作細節(jié)；3.學習酵母RNA提取和測定的操作方法。三、研究策略1.選材即選取富含RNA的生物材料，微生物由于其原料易獲得性被廣泛應用于工業(yè)上大量生產(chǎn)RNA的原料。2.提取提取RNA的方法有很多種，如濃鹽法、稀堿法、混合鹽法、苯酚法、表面活性劑法等2，但在工業(yè)生產(chǎn)上應用最多的還是稀堿法和濃鹽法。兩種方法的原理不同，濃鹽法是原理是在加熱條件下，高濃度NaCl改變細胞膜的通透性，使RNA釋放出來；稀堿法是利用堿使微生物的細胞壁溶解，釋放RNA。兩種方法各有特點，濃鹽法的破壁率低，但提取的RNA純度比稀

4、堿法要高；稀堿法的破壁效果好，消耗時間短，能耗低，但提取RNA純度較低，適于工業(yè)化生產(chǎn)。在實際中應根據(jù)具體情況及要求選擇合適的方法。3.提純提純過程中常需要去除的雜質(zhì)是蛋白質(zhì)。通常采用等電沉淀法使RNA沉淀出來，使其與雜質(zhì)分離，但有資料顯示該法不能有效分離RNA和蛋白質(zhì)，且RNA損失率較高。另外，也可使用鹽析法、等電沉淀法析出蛋白質(zhì)或蛋白酶降解法除去蛋白質(zhì)。4.含量測定測定RNA的含量可通過測定核糖核苷酸的糖、堿基或者磷酸來實現(xiàn)。目前有三種方法，定磷法、戊糖測定法和紫外吸收法。定磷比色法準確、微量、快速，是測定RNA含量的最好方法；戊糖測定法通過糖的顏色反應測定RNA，簡單、快速，當樣品中有粘

5、多糖和蛋白質(zhì)存在時會有干擾；紫外吸收法簡單、快速、微量，但易受到蛋白質(zhì)及含有共軛雙鍵物質(zhì)的干擾。四、研究方案及可行性分析本實驗以食品用干酵母粉為材料，采用濃鹽法提取核糖核酸并用紫外分光光度法測定制品中RNA的含量。方案合理，實驗材料及器具實驗室均可提供，時間上也允許，故本方案具有可行性。五、具體實驗設計1.實驗儀器及試劑儀器：UV9600紫外分光光度計、JP-100架盤藥物天平、恒溫水浴鍋、TDL-40B低速離心機；器具：微量可調(diào)手動移液器、普通大試管、25ml容量瓶、50ml容量瓶、研缽；試劑：10%NaCl溶液、6M HCl、95%乙醇、2%的氨水、RNA沉淀劑、蒸餾水；材料：食品用干酵母

6、粉。2.實驗步驟（1）酵母核糖核酸的提?。?h）提取稱取7 g酵母粉研磨至面粉狀轉(zhuǎn)移至三角瓶，加50ml10%NaCl溶液徹底懸浮浸潤沸水浴浸提40min提取液。分離提取液冰浴冷卻至少10min3500r/min離心30min上清液沉淀RNA上清液小燒杯中冰浴冷卻至10以下攪拌下6M HCl調(diào)節(jié)pH至2.02.5冰浴4h。洗滌純化冰浴后懸浮液3500r/min離心15minRNA沉淀約15ml95%乙醇徹底懸浮攪拌洗滌3000r/min離心10minRNA沉淀（重復洗滌、離心三次）。干燥硫酸紙于80烘箱干燥稱重邊緣折疊成框轉(zhuǎn)移RNA沉淀涂布于硫酸紙上80烘箱干燥5min稱重轉(zhuǎn)移大部分RNA制品

7、于玻璃勻漿器內(nèi)稱重剩余樣品及硫酸紙記錄數(shù)據(jù)，計算純度及產(chǎn)率。（2）核糖核酸含量的測定（紫外分光光度法）（1h）勻漿液制備（15min）玻璃勻漿器內(nèi)加入5ml蒸餾水勻漿至均一的膠體溶液轉(zhuǎn)入小燒杯（10ml左右蒸餾水分次清洗并入）混勻，2%氨水調(diào)pH7.0轉(zhuǎn)入25ml容量瓶，定容，混勻含量測定（40min）取兩支試管，按下表操作管號RNA液H2O沉淀劑A5ml5mlB5ml5mlA、B管混勻冰浴20min3500r/min離心10min取上清液于兩支試管各0.5ml至兩個50ml容量瓶，定容，混勻測定樣品OD260值。（3）原始數(shù)據(jù)記錄處硫酸紙的重量（g）RNA和硫酸紙的總重量（g）剩余RNA樣品

8、及硫酸紙的總重量（g）A管的OD260值B管的OD260值（4）結(jié)果計算公式制品純度（%）=樣品OD260比消光系數(shù)×定量樣品稀釋倍數(shù)×1定量樣品重×100%產(chǎn)率：RNA提取率（%）=制品純度×總制品重7g×100%3.實驗所需時間預計本實驗共需時間約8h。4.某些試劑與操作的作用（1）10%NaCl溶液 破除酵母菌細胞壁，釋放RNA。查閱資料顯示NaCl濃度為8%10%時RNA溶液的純度及提取率較高。（2）沸水浴浸提 對破除酵母菌細胞壁起促進作用。破壁時的溫度對RNA提取率有很大的影響，溫度越高，越有利于細胞壁的破壞，胞內(nèi)物質(zhì)（包括蛋白質(zhì)和核

9、酸）釋放的也越多?？紤]到生產(chǎn)應用的方便性及可操作性，溫度不超過100 。（3）6M HCl調(diào)節(jié)pH至2.02.5 在核酸的等電點下使其盡可能多的沉淀，達到與雜質(zhì)分離的目的。（4）2%氨水調(diào)pH7.0 中性pH條件下使RNA盡可能多的溶解，從而使RNA含量測定更準確。（5）測定OD260值之前將上清液稀釋100倍 高濃度有可能超出朗伯-比爾范圍，使測定結(jié)果偏差較大，稀釋后測定反而更準確。5.誤差分析（1）整個實驗中攪拌過程一定要緩慢，否則會使RNA機械破碎，影響含量測定。（2）調(diào)節(jié)等電點時應嚴格控制pH。因為pH過低會使核酸發(fā)生酸性水解，過高則核酸沉淀不完全，且會使雜質(zhì)（DNA或蛋白質(zhì)等）沉淀較

10、多。（3）紫外法測定RNA含量時，第一次定容要格外小心，切勿超過總體積（容量瓶量程小，只有25ml）。六、質(zhì)疑及相關(guān)思考1.查閱資料了解到酵母的濃度以及水浴浸提時間都會對RNA的提取率有一定的影響，大部分人得出的最適酵母濃度為10%左右（與本實驗相差不大），而浸提時間則從25h不等（與本實驗40min差距較大），3本實驗浸提時間的設置是出于什么考慮？2.等電沉淀法析出RNA時蛋白質(zhì)及DNA等雜質(zhì)有多少沒有被除去（一起留在了沉淀里）？我們知道，RNA的等電點為2.02.5，DNA等電點為44.5，蛋白質(zhì)等電點就變化很大了，我們在保證RNA析出量最多的前提下，肯定會有部分的DNA及蛋白質(zhì)雜質(zhì)析出，

11、從而對RNA含量測定造成干擾。既然如此，這些雜質(zhì)對RNA含量測定的影響有多大？是否可以忽略？3.本實驗測定的是變性之后的RNA含量。我們知道，核酸變性后氫鍵和堿基堆積力受到破壞，使紫外吸收值升高，該現(xiàn)象稱為增色效應。既然如此，我們在260nm波長下測定的就不是酵母菌細胞RNA分子的含量。4.經(jīng)酸性乙醇沉淀的RNA，離心之后，沉積在離心杯的底部。由于沉淀較多，用95%乙醇洗滌時肯定會不充分，很多雜蛋白不易除去，形成很多粘團，使得下面的干燥也不易操作。如果充分洗滌雜蛋白必須攪拌，這樣會使RNA 被機械破碎，影響含量測定。有實驗顯示用苯酚-氯仿抽提法具有較好的效果，4由于酚-氯仿在水溶液中抽提蛋白，

12、作用充分，又不用劇烈振蕩，避免了RNA被機械切割，蛋白質(zhì)又能充分去除，分離得到的RNA樣品純度較高。5.關(guān)于紫外法測定RNA含量時的空白組設置。測定RNA含量時設置了A、B兩個管，分別加入蒸餾水及等量的沉淀劑，B管的作用是沉淀RNA，作為對照。應該以蒸餾水作為空白組，分別測定A、B兩個管的OD260值，B管測定值表示除RNA以外物質(zhì)的吸光度值，A管測定值表示RNA及其他物質(zhì)的總吸光度值，以二者之差作為RNA的吸光度值。七、思考題1.作為商品開發(fā)，我們更多的是應該考慮市場需求的共性還是個性？為什么？相應的，如何完成相關(guān)欲開發(fā)產(chǎn)品的定位？更多考慮的是市場需求的共性。共性商品面向大眾，存在廣闊的市場

13、需求，具有商業(yè)前景，一旦該產(chǎn)品成功投入市場就可以從中挖掘出巨大的經(jīng)濟效益；相反，個性產(chǎn)品只適用于小部分人群，需求量少。若要完成相關(guān)與開發(fā)產(chǎn)品的定位，就需要進行市場調(diào)查，分以下幾個方面：（1）調(diào)查該產(chǎn)品的市場需求量和供應量，分析確定該產(chǎn)品目前有沒有空余市場，以合理設計該產(chǎn)品的產(chǎn)量；（2）調(diào)查該產(chǎn)品的具體應用領(lǐng)域甚至該領(lǐng)域的哪一個部分，定位該產(chǎn)品的科技含量；（3）調(diào)查目前市場上類似的產(chǎn)品及其生產(chǎn)流程、成本、市場價格，要么降低成本，要么研究類似產(chǎn)品中所不具備的特性，分析開發(fā)新產(chǎn)品。2.基于生物制品的產(chǎn)業(yè)開發(fā)，探討實驗室的科學研究和大工業(yè)生產(chǎn)之間的關(guān)系和異同處？實驗室研究往往是工業(yè)化生產(chǎn)的前體或者說基礎(chǔ)。生物制品的產(chǎn)業(yè)開發(fā)，首先是在實驗室對某種的物質(zhì)或代謝途徑等進行大量的研究之后，對其理化性質(zhì)、生物學功能等有了非常清楚的認識，然后試著去尋求該物質(zhì)的應用價值，在實驗室進行小規(guī)模生產(chǎn)，最后再考慮大工業(yè)生產(chǎn)。相同點：都需要從原料開始去探索相關(guān)的生產(chǎn)流程，以得到最終的產(chǎn)品。不同點：實驗室研究設備的容量很小，很難對大型工業(yè)設備中必然出現(xiàn)的許多工程因素（如傳熱、傳質(zhì)、流動與混合等）作充分考察；此外，在連續(xù)運轉(zhuǎn)的工業(yè)化生產(chǎn)上，還要保證設備的穩(wěn)定和工藝的重現(xiàn)性；最后，工業(yè)化生產(chǎn)還要考慮成本、市場需求等客觀存在的實際問題，因為工業(yè)化生產(chǎn)追求的還是經(jīng)濟效益