2002年全國中學(xué)生生物奧賽教練員培訓(xùn)班分子生物學(xué)...

1、2002 年全國中學(xué)生生物奧賽教練員培訓(xùn)班一一分子生物學(xué)專題分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論DNA 復(fù)制基因轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)生物合成基因表達的調(diào)控基因工程專題內(nèi)容（一）復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯（二）基因表達調(diào)控（三）基因工程（一） 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯遺傳信息以遺傳密碼的形式編碼在DNA 分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸順序，并通過DNA 復(fù)制由親代傳遞給子代。在后代的生長發(fā)育中，遺傳信息通過DNA 轉(zhuǎn)錄成 RNA，然后由 RNA 翻譯成特定的蛋白質(zhì)，通過蛋白質(zhì)執(zhí)行各種生命功能，將生命的遺傳特征體現(xiàn)出 來。1 DNA 復(fù)制DNA 復(fù)制是指以親代 DNA 分子的兩條鏈為模板合成各自的互補鏈，形成兩個子代 DNA分子的過程。復(fù)制的過程

2、是半保留模式和不連續(xù)的。復(fù)制過程是由一系列酶和蛋白質(zhì)參與的。復(fù)制開始時，親代雙螺旋 DNA 鏈首先必須解開螺旋，成為兩條獨立的單鏈分子，以作 模板之用，催化完成這步反應(yīng)的主要是解螺旋酶，Rep 蛋白幫助解開雙螺旋。解開的兩條單鏈隨即被單鏈結(jié)合蛋白所覆蓋，作用是阻止單鏈本身折疊配對形成雙鏈DNA，并保護單鏈部分不被核酸酶降解。 DNA 復(fù)制過程中擔(dān)任 DNA 合成的酶是 DNA 聚合酶，只能從 5宀 3 的方向逐個連入核苷酸。因此只能利用35 方向的模板鏈合成子鏈，合成方向為5宀 3,稱為前導(dǎo)鏈。由于親代 DNA 雙鏈中只有一條鏈的方向為 3 T5 ,故另一條鏈 （5T3 ）的復(fù)制只能先合成多個

3、小片段DNA （稱為岡崎片段），然后連接成長的鏈，稱為滯后鏈。合成岡崎片段之前需由引物合成酶先合成一小段RNA 引物。在此引物 3 -OH端由 DNA 聚合酶 III 沿 5T3 的方向催化合成小的岡崎片段。之后由 DNA 聚合酶 I 切除RNA 引物，并填補修復(fù)缺口。最后由DNA 連接酶將多個小片段 DNA 連接成長鏈。而 3 T5方向的模板鏈可以在一個引物上連續(xù)進行5 T3 方向的鏈合成。而模板鏈可以在一個引物上連續(xù)進行 5T3方向的鏈合成。DNA 復(fù)制所需的酶和蛋白質(zhì)酶和蛋白質(zhì)作用拓撲異構(gòu)酶幫助解開復(fù)制叉前后的超螺旋結(jié)構(gòu)DNA 解螺旋酶解開超螺旋Rep 蛋白幫助解開雙螺旋引物合成酶合成

4、RNA 引物單鏈結(jié)合蛋白穩(wěn)定單連區(qū)DNA 聚事酶 III合成 DNADNA 聚合酶 1消除引物，填滿裂隙DNA 連接酶連接 DNA 末端2 基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄是以 DNA 為模板，在 RNA 聚合酶作用下合成 RNA 的過程，是遺傳信息從 DNA 向 RNA 傳遞的過程，是遺傳信息表達的第一步。轉(zhuǎn)錄單位是指RNA 聚合酶作用的起始點與終止點之間的 DNA 順序；啟動子是 DNA 分子上可與 RNA 聚合酶特異性結(jié)合， 而使轉(zhuǎn)錄 開始的一段DNA 序列；增強子是包括啟動子上游與啟動子重疊的一段DNA 序列，使啟動子發(fā)動轉(zhuǎn)錄的能力大大增強。轉(zhuǎn)錄終止信號使 mRNA 從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上釋放出來而終

5、止轉(zhuǎn)錄。DNA 指導(dǎo)的 RNA 聚合酶在 RNA 合成中起催化作用。可以識別DNA 分子中起始區(qū)的啟動子，使 DNA 部分雙螺旋解開，解開長度為17bp，從而產(chǎn)生單鏈 DNA 模板，并選擇正確的核糖核苷酸催化形成磷酸二酯健。能識別轉(zhuǎn)錄終止信號， 并可與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的活化蛋白或阻遏蛋白作用，從而對基因的表達起調(diào)控制作用。轉(zhuǎn)錄起始時，必須有一些蛋白質(zhì)因子參與，稱為轉(zhuǎn)錄因子，作用是幫助 RNA 聚合酶結(jié)合到啟動子上。 包括：TF2D、TF2A、TF2B、TF2H、 TF2E、TF2H 等。轉(zhuǎn)錄起始時，RNA 聚合酶識別結(jié)合啟動子，并解除啟動子區(qū)域雙螺旋結(jié)構(gòu)，解開的以 鏈相當于 17個堿基對，開始催化合成

6、 RNA。轉(zhuǎn)錄延長階段，RNA 聚合酶沿模板 3 宀 5 方向移動，并按模板的堿基序列，配對加入四種核苷酸，進行RNA 的聚合。RNA 的合成方向沿著 53方向進行。酶前面的 DNA 雙螺旋不斷解開，后面的 DNA 重新回復(fù)到雙螺旋結(jié)構(gòu)，同時 RNA 鏈也不斷地從 RNA-DNA 雜交體中分離出來。轉(zhuǎn)錄終止時，RNA 聚合酶停止作用，RNA 合成終止。新生的 RNA 鏈釋放，局部解開的 DNA 回復(fù)到雙螺旋結(jié)構(gòu)， 酶從模板上釋放出來。轉(zhuǎn)錄過程即告結(jié)束。轉(zhuǎn)錄后加工：按照 DNA 模板轉(zhuǎn)錄生成的 RNA 鏈經(jīng)過修飾、切除和拼接等反應(yīng)，去除 非編碼序列，形成成熟的、具有功能的RNA 分子，這一過程稱

7、為 RNA 轉(zhuǎn)錄后加工。原核生物的 mRNA 不需要修飾加工，在它的 3端尚未完成轉(zhuǎn)錄前，其 5端已與核糖體結(jié)合， 開始蛋白質(zhì)的合成，即轉(zhuǎn)錄與翻譯偶聯(lián)。真核生物的轉(zhuǎn)錄在細胞核內(nèi)進行，而翻譯過程在細胞質(zhì)中進行，轉(zhuǎn)錄和翻譯在時間和空間上是分開的。真核生物的 mRNA 在細胞核中合成后，還必須經(jīng)過一系列的加工處理，才能到達細胞質(zhì)中指導(dǎo)蛋白的合成。轉(zhuǎn)錄后加工包括：5端加帽，即新合成的 mRNA 的 5 端與第 7 位碳原子被甲基化了的鳥嘌呤核苷酸在酶的作 用下相連的過程，有提供核糖體的識別位點和使mRNA 避免受到磷酸酶和核酸酶的攻擊等作用。3端加多聚腺苷酸尾，即在多聚腺苷酸聚合酶的催化下，在mRNA

8、 的 3端連接多聚腺苷酸（polyA ），具有增加 mRNA 的穩(wěn)定性和增加翻譯效率的功能。mRNA 前體的剪接，大多數(shù)真核基因都是由蛋白編碼序列和非編碼序列組成，編碼序列稱為外顯子， 非編碼序列稱為內(nèi)含子。外顯子往往被內(nèi)含子隔開，形成相間排列方式。 在基因轉(zhuǎn)錄中，內(nèi)含子和外顯子同時被轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物為 RNA 前體。在形成成熟的 mRNA 時，內(nèi)含子被切除，外顯子被順序 連接，稱為剪接。因此，基因在轉(zhuǎn)錄為 RNA 前體后，還必須經(jīng)這樣一系列的加工處理，才能到達細胞質(zhì)中指導(dǎo)蛋白的合成。3蛋白質(zhì)的牛物合成蛋白質(zhì)的生物合成是存在于 mRNA 中且由堿基序列決定的遺傳信息被表達為蛋白質(zhì)的 過程。參與蛋白質(zhì)

9、合成的元件主要有mRNA、tRNA、核糖體。mRNA 攜帶遺傳信息，是蛋白質(zhì)合成的直接模板，tRNA 轉(zhuǎn)運特異性氨基酸進行蛋白質(zhì)的生物合成，核糖體是蛋白質(zhì)合 成的場所。一個核糖體有兩個 tRNA 位點：P 位點和 A 位點。攜帶新生肽的 tRNA （肽酰 tRNA ） 占據(jù) P 位點，新進入的攜帶氨基酸的 tRNA （氨酰 tRNA ）結(jié)合在 A 位點。新進入的氨酰 tRNA 的反密碼子與 mRNA上的密碼子配對，結(jié)合在 A 位點。核糖體的組分催化肽酰tRNA 攜帶的多肽被轉(zhuǎn)移至氨酰 tRNA 所攜帶的氨基酸，肽健形成。P 位點上的 tRNA 卸下肽鏈而成為無負載的脫酰 tRNA。一個新生的肽

10、酰 tRNA 在 A 位點形成。在前一個肽鏈的基礎(chǔ)上長一個氨基酸殘基。核糖體沿著 mRNA 移動一個密碼子的距離，即轉(zhuǎn)位。使脫酰 tRNA 移出 P 位 點，新的肽酰 tRNA 移入 P 位點。待轉(zhuǎn)譯的下一個密碼子正位于A 位點，準備讓下一個新的氨酰 tRNA 進入。脫酰 tRNA 離開核糖體，轉(zhuǎn)運新的氨基酸。此合成周期循環(huán)重復(fù)，至加 入最后一個氨基酸。核糖體識別終止密碼子，釋放已合成完畢的肽鏈，核糖體同mRNA 分離，蛋白質(zhì)合成結(jié)束。(二)基因表達調(diào)控現(xiàn)已揭示細菌基因組有 4000 個基因，人類基因組有 30 000 個基因，但其中只有一部分 基因在特定的時間內(nèi)表達。 在多細胞真核生物的發(fā)育

11、過程中， 某些影響細胞分化的蛋白僅在 某種細胞中存在很短一段時間。各種具有不同功能的細胞所表達的基因產(chǎn)物也有很大差別。一個典型的例子就是紅細胞中需要絕對高濃度的血紅蛋白，而其他體細胞中則不是這樣，成熟的紅細胞中血紅蛋白基因呈現(xiàn)高水平表達，產(chǎn)生的大量血紅蛋白滿足了紅細胞運輸氧和二氧化碳的功能。這里就有一個基因的調(diào)控問題。基因表達由一定的調(diào)控機制決定，呈現(xiàn)一定的時間順序和空間順序。在多細胞生物的生長發(fā)育過程中，相應(yīng)的基因按一定的時間順序開啟或關(guān)閉，決定細胞向特定的方向分化和發(fā)育。多細胞生物同一基因產(chǎn)物在不同的組織器官中的分布是不同的，某些基因在一種組織細胞中暫不表達或永不表達， 而另外一些基因則可

12、能是相反的情況。任何影響轉(zhuǎn)錄核翻譯過程的啟動、關(guān)閉和速率的較為直接的因素及其作用，叫做基因表達的調(diào)控。1.基因表達調(diào)節(jié)模式根據(jù)調(diào)控蛋白對 RNA 聚合酶活性調(diào)節(jié)可將基因表達調(diào)控分為正調(diào)控和負調(diào)控。正調(diào)控 是指激活物結(jié)合到啟動子附近從而增強RNA 聚合酶的結(jié)合與活性。激活物與信號分子的相互作用既可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的增強也可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的減弱。有時信號分子的作用使結(jié)合在 DNA 上的激活物脫落，轉(zhuǎn)錄停止；有時信號分子的作用使激活物結(jié)合在DNA 上，轉(zhuǎn)錄得以進行。負調(diào)控是指阻遏物結(jié)合到啟動子附近而阻遏RNA 聚合酶與啟動子的相互作用。阻遏物與信號分子的相互作用既可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的增強也可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的減弱，某些情況下，信

13、號分子與結(jié)合在DNA 上的阻遏物作用，構(gòu)象的變化使結(jié)合在DNA 上的阻遏物脫落，轉(zhuǎn)錄得以進行；有時，信號分子與非活性狀態(tài)的阻遏物相互作用使阻遏物結(jié)合到DNA 上，阻遏轉(zhuǎn)錄的進行。2 原核基因表達調(diào)控(1 )原核基因結(jié)構(gòu)和表達調(diào)控元件的特點原核生物是較為簡單的生物體系，它們的基因組成較真核生物簡單。原核生物的基因組僅包含一條染色體。 基因是連續(xù)的，沒有內(nèi)含子，而且絕大部分基因編碼蛋白，只有小部分 不翻譯。幾個功能相關(guān)的基因成簇地串聯(lián)排列于染色體上，共同組成一個轉(zhuǎn)錄單位，受同一個啟動基因控制，組成的基因表達調(diào)控單元，叫做操縱子，原核生物的一個轉(zhuǎn)錄單位編碼多條肽鏈。以操縱子為調(diào)控單位進行的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是

14、原核基因表達調(diào)控的基本方式。此外，原核基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的，幾乎在轉(zhuǎn)錄的同時翻譯過程也在核糖體中進行。(2 )原核基因表達調(diào)控方式一一乳糖操縱子模型通過代謝物調(diào)節(jié)基因活性是原核基因最普遍的一種調(diào)控方式，是指在一些代謝物的作用下，通過一些調(diào)節(jié)蛋白的作用，使基因活化或阻遏。 其中最突出也是研究最早的一個例子便是大腸桿菌的乳糖操縱子模型。在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中，細菌優(yōu)先利用葡萄糖作為能量來源。在只有乳糖的培養(yǎng)基中，細菌的生長在開始階段不好，但過一段時間后，在乳糖的誘導(dǎo)作用下，細菌就可以表達出分解和利用乳糖的酶：3-半乳糖苷酶一將乳糖轉(zhuǎn)變?yōu)楫悩?gòu)乳糖；3-半乳糖苷透過酶協(xié)助乳糖分子透過細胞膜進

15、入胞內(nèi)；3-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶?？刂七@三個基因表達的調(diào)控單元就是乳糖操縱子，包括：3 個結(jié)構(gòu)基因 z、y、a,分別編碼3-半乳糖苷酶、3-半乳糖苷透過酶、3-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶；操縱基因o,是阻遏蛋白的結(jié)合位點，當阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合時，lac mRNA 的轉(zhuǎn)錄受阻；調(diào)節(jié)基因 i，編碼阻遏蛋白，可與 O 基因 結(jié)合；啟動基因 p，位于 i 和 o 之間。在培養(yǎng)基中沒有乳糖存在時，i 基因編碼的阻遏物結(jié)合在 o 區(qū)，結(jié)合到啟動子 p 區(qū)的 RNA 聚合酶便不能越過 o 區(qū)到達結(jié)構(gòu)基因區(qū)進行轉(zhuǎn)錄，lac 操縱子處于阻遏狀態(tài)。但即便在阻遏狀態(tài)，lac 操縱子也存在本底表達，每個細胞中可能有幾個

16、3-半乳糖苷酶及透過酶生成。當有乳糖存在時，在單個透過酶分子作用下，少量乳糖 分子進入細胞，又在單個3-半乳糖苷酶分子作用下轉(zhuǎn)變?yōu)楫悩?gòu)乳糖，而異構(gòu)乳糖是 lac 操縱子的誘導(dǎo)物。異構(gòu)乳糖與阻遏物結(jié)合后，使阻遏物失活，這樣轉(zhuǎn)錄開始。這些mRNA 翻譯出大量的3-半乳糖苷酶和透過酶，使大量的乳糖進入細胞，從而使 lac 操縱子更大限度地去 阻遏，產(chǎn)生更多的可以分解代謝乳糖的酶。3.真核基因表達調(diào)控真核生物與原核生物在基因表達調(diào)控上最主要的區(qū)別在于原核生物只要通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控 來開啟或關(guān)閉某些基因的表達以適應(yīng)環(huán)境條件的變化，而對大多數(shù)真核生物來說，基因表達調(diào)控最明顯的特征是能在特定的細胞中激活特定的基因

17、，從而實現(xiàn)有序的、不可逆轉(zhuǎn)的分化發(fā)育過程，并使特定的組織和器官行使不同的功能。真核生物基因表達調(diào)控的復(fù)雜性和特殊性是由其自身的基因結(jié)構(gòu)的特殊性、基因組的特點以及真核細胞的復(fù)雜性決定的。(1 )真核基因結(jié)構(gòu)和表達調(diào)控元件的特點真核生物的基因組十分龐大， 而有編碼功能的基因只占全部基因組的一小部分。大部分基因組 DNA 不具有直接的遺傳學(xué)功能，很可能在基因復(fù)制或基因表達中起調(diào)節(jié)作用，真核 生物 DNA 中含有大量重復(fù)序列。真核生物的基因組有內(nèi)含子，體現(xiàn)了真核基因的不連續(xù)性。 內(nèi)含子和外顯子共同被錄，然后在形成成熟的mRNA 時，內(nèi)含子被切除，外顯子被順序連接，稱為剪接。對于同一個初級轉(zhuǎn)錄本，不同的

18、剪接方式產(chǎn)生不同的mRNA，可翻譯成不同的多肽，因此初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪接過程是真核基因表達調(diào)節(jié)的一個重要環(huán)節(jié)。真核生物的一個基因?qū)?yīng)于一條 mRNA，只編碼一條多肽鏈。此外，轉(zhuǎn)錄和翻譯在時間和空間上是分 離的，轉(zhuǎn)錄在細胞核內(nèi)進行，翻譯在細胞質(zhì)中進行。(2) 真核基因表達是多級調(diào)控從基因的活化到蛋白質(zhì)的合成與分解，有多個環(huán)節(jié)可以作為控制點，包括：轉(zhuǎn)錄前水平的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控、翻譯水平及蛋白質(zhì)加工水平的調(diào)控。其中， 基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是一個最主要的控制點。轉(zhuǎn)錄前水平的調(diào)控：通過改變 DNA 序列和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)從而影響基因表達的過程均屬于 轉(zhuǎn)錄前水平的調(diào)控。包括：染色質(zhì)的丟失、

19、基因擴增、染色質(zhì)DNA 序列的重排、染色質(zhì)DNA 的修飾和異染色質(zhì)化等方面。轉(zhuǎn)錄發(fā)生之前，染色質(zhì)會在特定的區(qū)域被解旋或松馳， 形成自由的DNA，這些變化將導(dǎo)致結(jié)構(gòu)基因的暴露，以使RNA 聚合酶有效地結(jié)合到 DNA模板上，并沿著模板 5宀 3方向進行轉(zhuǎn)錄。因此，被轉(zhuǎn)錄基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)要經(jīng)歷一個 構(gòu)象的變化，進入一個“活化”狀態(tài)。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控：真核生物基因的表達調(diào)控除涉及到啟動子、RNA 聚合酶活性的調(diào)節(jié)及調(diào)節(jié)蛋白外，還涉及增強子等DNA 元件以及更多的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。轉(zhuǎn)錄因子通過與啟動子或增強子結(jié)合，改變 DNA 的構(gòu)象，影響基因轉(zhuǎn)錄。沒有大量的轉(zhuǎn)錄因子，RNA 聚合酶不可能識別真核生物數(shù)量巨大

20、的啟動子。轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控是目前研究最為精細也是機體所采取的 最普遍的基因表達調(diào)控方式，是調(diào)控的基本控制點。轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控：真核生物的基因轉(zhuǎn)錄在細胞核內(nèi)進行，而翻譯則在細胞質(zhì)中進行， 這種轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的時空差別使得基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控成為真核基因區(qū)別于原核基因表達 調(diào)控的一個重要方面。真核基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄首先形成初級轉(zhuǎn)錄本，然后經(jīng)過5端加帽、3 端的加尾、剪接等加工后才成為有功能的RNA 分子，被認為是產(chǎn)生蛋白質(zhì)多樣性的分子機制之一。翻譯水平及蛋白質(zhì)加工水平的調(diào)控：翻譯水平的調(diào)控主要是控制mRNA 的穩(wěn)定性和有選擇地進行翻譯，是一種快速調(diào)控基因表達的方式。翻譯后加工指多肽鏈合成后通常需經(jīng)過加工和折疊后

21、才能成為有活性的蛋白質(zhì)。包括蛋白質(zhì)及多肽的切割加工、多肽的化學(xué)修飾(糖基化或磷酸化)以及多肽的剪接等過程，使蛋白成為有生物活性的分子。一種翻譯產(chǎn)物經(jīng)過 不同的加工過程可形成不同活性的產(chǎn)物，這種后加工過程在基因表達的調(diào)控上起重要作用。(三)基因工程基因工程作為分子生物學(xué)中的核心成分，已滲透到生命科學(xué)研究的每一學(xué)科。在農(nóng)業(yè)、 工業(yè)、環(huán)保業(yè)、醫(yī)藥業(yè)等領(lǐng)域取得了令人矚目的成就。在醫(yī)學(xué)方面，基因工程藥物、基因工 程疫苗、基因工程抗體、轉(zhuǎn)基因動物的問世，為人類疾病的診斷和治療作出了重大貢獻。自從 1953 年 Watson 和 Crick 闡明了 DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)以來，生物學(xué)的發(fā)展進入了一 個全新的階

22、段，即跨入了分子水平。在50、60 年代科學(xué)家們確立了 DNA 復(fù)制、重組修復(fù)、遺傳信息傳遞機制的中心法則及有關(guān)遺傳密碼等分子遺傳學(xué)理論；發(fā)現(xiàn)了諸如限制性核酸內(nèi)切酶、連接酶等一系列工具酶；在技術(shù)上又發(fā)展了DNA 純化與鑒定等，從而為基因工程學(xué)科的建立奠定了基礎(chǔ)。1973 年，Cohen 等人將帶有四環(huán)素抗性表型的質(zhì)粒pSC101 和帶有新霉素抗性的質(zhì)粒 R6-3 分別用 EcoR1 酶切后，在體外將二者連接起來，然后將產(chǎn)物導(dǎo)入大腸 桿菌，成功地進行了無性繁殖，并得到了既抗四環(huán)素又抗新霉素的大腸桿菌，從而完成了 DNA 體外重組和擴增的全過程，基因工程這門新興學(xué)科也就應(yīng)運而生?；蚬こ淌侵冈隗w外

23、條件下，人工將DNA 分子剪切并重新拼接，形成一個新的雜合的DNA 分子，然后將它導(dǎo)入微生物或真核細胞內(nèi)，使該分子得到無性繁殖，并可使該基因在 細胞內(nèi)表達，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物或改造、創(chuàng)造新的生物類型。 基因工程所采用的基本技術(shù)被稱為 DNA 體外重組技術(shù)，也稱為基因克隆或分子克隆技術(shù)。1 基因工程的基本程序(1) 目的基因的 DNA 片段的帶有獲得；(2) DNA 片段與載體 DNA 的連接，即體外重組；(3) 連接產(chǎn)物導(dǎo)入宿主細胞；(4) 重組體的擴增、篩選與鑒定；(5) 目的基因在細胞中的表達；(6 )表達產(chǎn)物的分離、鑒定等。2.基因工程工具酶基因工程工具酶是進行基因工程操作必不可

24、少的工具。包括：限制性核酸內(nèi)切酶和核酸修飾酶。限制性核酸內(nèi)切酶主要來源于原核生物，具有識別自身 DNA 和異源 DNA 的功能，通過切割破壞或限制異源 DNA 分子侵入宿主細胞來保護自身。分為I、II、III 型，常用的是 II 型。為獲得適用于不同目的的核到片段，如DNA 片段間的連接、粘性 DNA 片段的補平或削平、DNA 序列測定、聚合酶鏈反應(yīng)等，基因工程中還經(jīng)常用到核酸修飾酶。限制性核酸內(nèi)切酶識別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈DNA ,識別順序最常見的是 4-6 個核苷酸，多為回文對稱序列。有兩種切割方式：當它切割雙鏈 DNA 時，若切割部位在識別序列的中心軸，產(chǎn)生

25、平末端；不在中心軸，產(chǎn)生帶有單鏈突出 端的 DNA 片段，稱為粘末端。某種 DNA 分子的限制酶位點數(shù)目和排列順序圖譜稱為限制 性內(nèi)切酶圖譜，是基因操作的重要基礎(chǔ)。在基因工程操作中，必須首先了解限制性內(nèi)切酶在目的基因和載體 DNA 上的位置和數(shù)目，才能利用合適的酶切位點進行DNA 重組工作。核酸修飾酶的特性及應(yīng)用名稱特性應(yīng)用甲基化酶與限制性內(nèi)切酶組成限制-修飾系統(tǒng)，使 順序中某個堿基甲基化保護自身 DNA 不被切開連接酶催化雙鏈 DNA 中相鄰的 5磷酸基團 與 3 羥基之間形成磷酸二酯鍵連接具有粘性末端或平末端 的兩個 DNA 片段，成為一個 重組分子聚合酶以 DNA 或 RNA 為模板在體

26、外合成DAN 或 RNA合成一個基因或一個片段，制備 DNA 或 RNA 探針Taq 酶耐熱的 DNA 聚合酶，具有 5 -3 聚合 酶活性，缺乏 3 -5 外切酶活性PCR 反應(yīng)核酸酶是一類降解核酸的酶缺口平移法標記探針、制備DNA、RNA 等堿性磷酸酯酶催化水解 DNA、RNA 的 5磷酸基團防止載體自身連接環(huán)化等綜上所述，基因工程工具酶就象是外科醫(yī)生的手術(shù)刀一樣，是進行基因工程操作必不可少的工具。為便于目的基因與載體之間的連接，應(yīng)根據(jù)它們各自的特點和功能，選擇適當?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶切酶切割DNA，或利用核酸修飾酶再對這些酶切后的片段進行處理，從而為 DNA 體外重組打下基礎(chǔ)。3載體載體是供插入目的基因并將其導(dǎo)入宿主細胞內(nèi)表達和復(fù)制的運載工具， 常用的有質(zhì)粒、噬體和病毒。質(zhì)粒和噬菌體用于原核細胞為宿主的分子克?。粍游锊《居糜谡婧思毎麨樗拗鞯姆肿涌?/p>