PCR突變技術(shù)方法概覽

1、易錯(cuò)PCR構(gòu)建AKP突變體實(shí)驗(yàn)參考資料PCR突變技術(shù)方法概覽1基于PCR的體外誘變技術(shù)定點(diǎn)突變的方法很多，而基于PCR的定點(diǎn)突變技術(shù)由于其突變效率高，操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，成本低廉等優(yōu)點(diǎn)而倍受矚目。近十年來(lái)，基于 PCR的定點(diǎn)突變技術(shù)獲得了長(zhǎng)足的發(fā)展，目前運(yùn)用此技術(shù)已能實(shí)現(xiàn)各種類(lèi)型的基因突變。基因突變實(shí)驗(yàn)包括以下幾個(gè)步驟：1目的基因全序列變異文庫(kù)的構(gòu)建 ;2利用高通量表達(dá)篩選載體從變異文庫(kù)中篩選表達(dá)突變體；3表達(dá)突變體的鑒定和表達(dá)研究。1.1 重疊延伸 PCR( over-1 ap extension PCR OE-PCR )這種方法運(yùn)用非常廣泛、靈活，不受突變位置及突變類(lèi)型的限制，利用OE-PC

2、R不僅能實(shí)現(xiàn)基因點(diǎn)突變，還能便利地實(shí)現(xiàn)大片段的插入及刪除及插入。其基本原理如圖(1)所示。首先設(shè)計(jì)兩個(gè) PCR反應(yīng)以產(chǎn)生兩個(gè)含突變位點(diǎn)的DNA片段，隨后將上述兩個(gè) PCR產(chǎn)物混合，二者通過(guò)末端互補(bǔ)區(qū)結(jié)合并在適宜的溫度下互引物延伸得 到完整的含突變的基因，對(duì)第一次PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化處理可顯著提高突變效率。OE-PCR不足之處在于：01 一個(gè)突變需要兩對(duì)引物，3次PCR,并且需對(duì)中間產(chǎn)物進(jìn)行純 化。相對(duì)而言步驟較煩瑣，不經(jīng)濟(jì)；O2由于DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及互補(bǔ)鏈的競(jìng)爭(zhēng)等因素的影響，有時(shí)兩個(gè)中間產(chǎn)物難于有效地相互結(jié)合導(dǎo)致目的產(chǎn)物得率很低；O3當(dāng)利用Taq聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，經(jīng)常在 PCR產(chǎn)物末端加上腺

3、苷酸，這一多余的腺苷酸一方面導(dǎo)致兩 個(gè)中間產(chǎn)物難于有效地相互結(jié)合，另一方面可能會(huì)插入基因中導(dǎo)致產(chǎn)生非預(yù)期的移碼突變。針對(duì)這些不足，后來(lái)許多學(xué)者對(duì)OE-PCR進(jìn)行了改進(jìn)。1997年，Urben等提出一步重疊延伸PCR法(one-step overlap extension PCR)，使得三個(gè) PCR反應(yīng)得以在一個(gè)試管里進(jìn)行， 并且省略了煩瑣的中間產(chǎn)物純化過(guò)程。其原理是首先將待突變的DNA以相反的方向克隆到兩個(gè)載體中，這兩個(gè)載體除了多克隆位點(diǎn)相反外其余均相同(例如pUC18,19)。這樣便得到兩個(gè)模板。將這兩個(gè)模板，兩個(gè)突變引物及一個(gè)與載體互補(bǔ)的通用引物置于一個(gè)試管中進(jìn) 行一次PCR反應(yīng)即可得到含

4、突變的目的基因。 1997年，Warrens等利用不對(duì)稱(chēng) PCR反應(yīng) 產(chǎn)生單鏈中間產(chǎn)物，消除了互補(bǔ)鏈的競(jìng)爭(zhēng)性影響，顯著提高了目的產(chǎn)物的得率。1990年,Horton等用T4DNA聚合酶處理中間產(chǎn)物，降低了移碼突變的發(fā)生率。由于OE-PCR幾乎沒(méi)有任何特殊條件的限制，而且成功率很高，因此運(yùn)用非常廣泛。第1頁(yè)共8頁(yè)易錯(cuò)PCR構(gòu)建AKP突變體實(shí)驗(yàn)參考資料步報(bào)1：錯(cuò)配的插人第2頁(yè)共8頁(yè)易錯(cuò)PCR構(gòu)建AKP突變體實(shí)驗(yàn)參考資料步驟3：延伸步驟4： PCR擴(kuò)噌AACQ我示四個(gè)引物表示災(zāi)變位點(diǎn)圖1 aver-lap extension PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變1.2 大引物 PCR 法(megaprimer PC

5、R)OE-PCR雖然突變成功率很高，但一次突變需要兩對(duì)引物，進(jìn)行三個(gè)PCR反應(yīng)，還需對(duì)中間產(chǎn)物進(jìn)行純化。因此，相對(duì)而言成本偏高，操作較煩瑣。大引物PCR法是OE-PCR的改進(jìn)版，利用大引物 PCR法只需三個(gè)引物，兩個(gè)PCR反應(yīng)，而且無(wú)需中間產(chǎn)物純化等步驟。其方法是先設(shè)置一個(gè) PCR反應(yīng)產(chǎn)生一個(gè)含突變的DNA片段，然后再以此 DNA片段作為引物與原模板退火進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到含突變的完整的基因。因?yàn)樽鳛橐锸褂玫腄NA片段較通常的引物要大許多通常有上百堿基，所以命名為大引物PCR法。最初采用的大引物PCR法突變效率較低，只有約50%終產(chǎn)物符合預(yù)期的要求，因此后續(xù)的篩選鑒定工作量較大。后來(lái)許多學(xué)者通

6、過(guò)對(duì)引物進(jìn)行巧妙設(shè)計(jì)或?qū)δ０暹M(jìn)行巧妙處理，從而使得大引物PCR法達(dá)到類(lèi)似 OE-PCR的突變效率。例如，有學(xué)者等對(duì)模板進(jìn)行適當(dāng)?shù)拿盖刑幚?遏制了野生型模板的擴(kuò)增，提高了突變效率。Te等在設(shè)計(jì)引物時(shí)使第一輪PCR的引物和Tm值引物侗時(shí)相應(yīng)提高退 ，不僅排除低Tm值的引物的干 ，使整個(gè)反應(yīng)能在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)第二輪PCR的引物長(zhǎng)度相差較大， 相應(yīng)它們的解鏈溫度 Tm值也產(chǎn)生顯著差異這樣第一輪 PCR采用低的退火溫度，之后在無(wú)需純化的情況下直接加入高 火溫度，與大引物一起引發(fā)第二輪 PCR擴(kuò)增?；谶@一設(shè)計(jì) 擾,使野生型模板不致被擴(kuò)增 ，而且省略了大引物的純化步驟進(jìn)行。B 第一步：引物與模板退火：A B

7、表示 曲引物表示突變位點(diǎn)。A m-.1 mi FEW. wv B第二步：第一次延伸其中一條新生鏈含緩發(fā)位點(diǎn)及一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)jn B第：®il?輪退火、建伸申得到含憲變位點(diǎn) 及兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物圖2 PCR定點(diǎn)突變矗理1.3特殊位置堿基的定點(diǎn)突變?nèi)缟纤?，進(jìn)行一次突變一般需要經(jīng)歷1到3次PCR及中間產(chǎn)物的純化等步驟。但當(dāng)需突變的堿基位于某些特殊位置時(shí)，就可以簡(jiǎn)單地運(yùn)用一次PCR實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變，下面討論這樣兩種特殊情況。（1）需突變堿基位于基因的末端當(dāng)需突變堿基位于基因的末端時(shí)，定點(diǎn)突變便非常簡(jiǎn)單易行。只需設(shè)計(jì)一對(duì)引物，其中一個(gè)為突變引物， 含有欲突變的堿基，另一個(gè)引物則完

8、全與模板互補(bǔ)。此二引物在5'端均含有適宜的限制性酶切位點(diǎn)及“夾子”序列，以便將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入載體中，如圖2所示。（2）唯一限制性位點(diǎn)刪除法 （unique site elimination technique USE ）當(dāng)需突變的堿基附近含唯一的限制性酶切位點(diǎn)時(shí)，如圖3所示，可以設(shè)計(jì)一對(duì)引物，其中突變引物含有上述限制性酶切位點(diǎn)及欲突變的堿基。以野生型基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增。隨后用限制性?xún)?nèi)切酶將野生型基因的待突變區(qū)切除，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與野生型基因的殘留片段連接，從而得到完整的含突變基因。但利用該方法必須注意：突變堿基附近必須 含有一限制性酶切位點(diǎn)， 并且這一位點(diǎn)在整個(gè)基因的其他位置

9、不能有。實(shí)際運(yùn)用中符合這一條件的情況不多見(jiàn)，因此這一方法受到很大限制；然而，一旦條件具備，運(yùn)用這一方法，較 其他方法都要省時(shí)省力。PCR擴(kuò)增E Em1.4擴(kuò)增環(huán)狀質(zhì)粒全長(zhǎng)的突變方法前述幾種方法都既適用于線性DNA也適用于環(huán)狀 DNA，然而當(dāng)待突變的基因已經(jīng)克隆入環(huán)狀質(zhì)粒時(shí)，只能選擇另一類(lèi)方法進(jìn)行突變，既：利用一對(duì)含突變的引物擴(kuò)增整個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒，從而得到含突變的線性DNA，隨后將線性 DNA環(huán)化便得到完整的含突變的質(zhì)粒。由于引物設(shè)計(jì)策略的不同，這一方法又可以分為兩種：一種方法是一步PCR法(single stepPCR , S-PCR)，兩個(gè)引物反向、緊鄰但沒(méi)有重疊區(qū)，利用高保真聚合酶擴(kuò)增產(chǎn)物是平

10、末端的線性DNA，需用末端磷酸化和 T4連接酶環(huán)化處理，從而獲得具有定點(diǎn)突變的重組子。原 理如圖4所示。另一種方法，以 Stratagene公司開(kāi)發(fā)的定點(diǎn)突變?cè)噭┖袨榇?，兩個(gè)引物 也是反向的并且其 5'端有15個(gè)堿基以上的重疊區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物為帶黏性末端的線性DNA，可自行環(huán)化。其原理及步驟見(jiàn)圖5。上述兩種方法理論上說(shuō)既簡(jiǎn)單又經(jīng)濟(jì)，應(yīng)該成為首選。但事實(shí)上要擴(kuò)增出完整的質(zhì)粒并非易事，尤其是當(dāng)質(zhì)粒較大時(shí)，這對(duì)聚合酶的質(zhì)量提出較高的要求，另外循環(huán)參數(shù)也需精確調(diào)節(jié)，而且模板質(zhì)粒要求至少有80%以上是超螺旋的，帶切口的質(zhì)粒不能作為模板。第4頁(yè)共8頁(yè)易錯(cuò)PCR構(gòu)建AKP突變體實(shí)驗(yàn)參考資料第5頁(yè)共8頁(yè)

11、易錯(cuò)PCR構(gòu)建AKP突變體實(shí)驗(yàn)參考資料突變位點(diǎn)質(zhì)粒53/PCR擴(kuò)增JPCR產(chǎn)物亍端硯酸化P51 3'=：= FI H：K產(chǎn)物自身環(huán)化 *突變位點(diǎn)質(zhì)粒114 一步反向PCR ii緞點(diǎn)突變?cè)硎颈P(pán)1*1待突變位點(diǎn)(3)PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)化大腸肝莆*H：R產(chǎn)物自身環(huán)化 形戒帶切口的質(zhì)粒斥突變引物圖S Strutagrne公司的宦點(diǎn)突變方法1.5利用OE-PCR進(jìn)行插入及刪除突變小片段的插入與刪除完全可以按點(diǎn)突變的方法實(shí)現(xiàn)，而大片段的插入與刪除用其他方法很難實(shí)現(xiàn)，但 OE-PCR技術(shù)使之變得輕而易舉。圖6示意了利用OE-PCR進(jìn)行刪除突變的方法。PCR擴(kuò)增b Ld wv«iAC L cPC

12、R產(chǎn)物退火A CI 再次擴(kuò)冷d-二 4 3 亠一二一AC =«=圖6用OE-PCR法實(shí)現(xiàn)刪除突變1.6非連續(xù)多核苷酸定點(diǎn)突變的方法該方法建立了一種突變引物延伸單鏈與PCR技術(shù)相結(jié)合的方法，它能有效地對(duì)目的基因進(jìn)行大區(qū)域非連續(xù)多核苷酸的定點(diǎn)突變改造。經(jīng)堿變性后的質(zhì)粒DNA，先用突變引物延伸單鏈，然后通過(guò)PCR擴(kuò)增得到突變雙鏈 DNA。與經(jīng)典的含U單鏈寡核苷酸定點(diǎn)突變方法相 比，本方法突變效率高，并省去了對(duì)突變克隆雜交篩選的操作。該方法綜合了質(zhì)粒雙鏈DNA測(cè)序中的堿變性和寡核苷酸定點(diǎn)突變中的突變引物延伸 即突變引物與堿變性的單鏈模板先結(jié)合并延伸，產(chǎn)生含突變位點(diǎn)的單鏈，再通過(guò)PCR擴(kuò)增出雙

13、鏈。在突變引物中，由于突變位點(diǎn)是分散的，被突變位點(diǎn)間隔的核苷酸能否與模板結(jié)合起到 穩(wěn)定突變引物，模板雜交體的作用尚不清楚。 但從結(jié)果來(lái)看，當(dāng)突變引物3 '端一側(cè)有9個(gè)堿 基與模板完全配對(duì)，即能保證雜交體的足夠穩(wěn)定和延伸反應(yīng)的正確性。延伸反應(yīng)后，先高溫變性，再緩慢降溫，推測(cè)這有利于被堿變性解鏈的兩條完全互補(bǔ)的單鏈重新退火結(jié)合，使反應(yīng)體系中有較多的突變引物延伸的單鏈。在PCR第一個(gè)循環(huán)中，省去加熱變性步驟，通過(guò)3'端引物與反應(yīng)體系中游離的單鏈結(jié)合和延伸，為后續(xù)循環(huán)反應(yīng)的5'端（突變）引物提供單鏈模板然后在嚴(yán)謹(jǐn)退火條件下，使5'端和3 '端引物分別與各自完全配

14、對(duì)的模板結(jié)合，從而得到與突變?cè)O(shè)計(jì)一致的雙鏈片段。除了用環(huán)狀質(zhì)粒DNA作為模板，本方法也適用于線性雙鏈DNA模板。2 PCR介導(dǎo)的隨機(jī)突變一般來(lái)說(shuō)，只有當(dāng)對(duì)某段序列的功能有確切了解，已知改變某個(gè)或某幾個(gè)堿基可能會(huì)產(chǎn)生明顯的效果時(shí)才采用定點(diǎn)突變法。然而在很多情況下，研究者對(duì)目的序列的了解是很有限的，這時(shí)為了研究目的序列的功能往往需要引入大量的隨機(jī)突變，構(gòu)建突變庫(kù)，再逐個(gè)篩選和鑒定。隨機(jī)突變常采用化學(xué)或自然誘變法，PCR法并不常用，然而事實(shí)上PCR法介導(dǎo)隨機(jī)突變非常有效，特別是當(dāng)隨機(jī)突變需局限在一小段區(qū)域時(shí)。PCR介導(dǎo)隨機(jī)突變主要有兩種策略，一種是利用簡(jiǎn)并引物，簡(jiǎn)并引物的特點(diǎn)是其5'端有十幾

15、個(gè)堿基是隨機(jī)組合的。這一方法除引物特殊外，其余均與定點(diǎn)突變技術(shù)完全一樣。利用簡(jiǎn)并引物可以產(chǎn)生大量隨機(jī)突 變，并且這些突變都集中在很窄的一段區(qū)域內(nèi)。另一種方法即易錯(cuò)PCR技術(shù)(error-pronePCR),其原理在于，忠實(shí)性較低的聚合酶如 Taq在特定措施下很容易向擴(kuò)增產(chǎn)物中摻入隨 機(jī)突變，這些措施包括提高 Mg2+濃度，改變dNTP的比例，調(diào)節(jié)熱循環(huán)參數(shù)等。易錯(cuò)PCR 技術(shù)突變率較低，經(jīng)一次突變的基因很難獲得滿(mǎn)意的結(jié)果，由此發(fā)展出連續(xù)易錯(cuò)PCR(Sequential error-prone PCR)策略，即將一次 PCR擴(kuò)增得到的有用突變基因作為下一次 PCR擴(kuò)增的模板，連續(xù)反復(fù)地進(jìn)行隨機(jī)誘

16、變，使每一次獲得的小突變累積而產(chǎn)生重要的有益 突變。基于PCR技術(shù)的隨機(jī)誘變方法構(gòu)建的全基因序列變異文庫(kù)分別重組進(jìn)篩選載體pUC18-GFP中。外源基因從 GFP基因的5'端重組進(jìn)篩選載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，如果一個(gè)重組質(zhì)?？梢员磉_(dá)外源蛋白與 GFP的融合蛋白，含此重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌落在紫外光下將會(huì)發(fā)出綠色的熒 光。據(jù)此能夠篩選到可在篩選載體中表達(dá)的外源基因。3化學(xué)或物理方法誘發(fā)基因突變3.1輻射典型的物理誘變劑是不同種類(lèi)的射線，常見(jiàn)的有X射線，r射線和中子，此外還有紫外線和B射線。X射線是種波長(zhǎng)為1000 - 100埃的電離射線，是最早的誘變射線。r射線是一種波長(zhǎng)更短的電離射線，其波長(zhǎng)0.

17、1 1埃，60Co和137Cs是目前應(yīng)用最廣的r射線源。中子是不帶電粒子，在加速器或核反應(yīng)堆中得到能量范圍極廣的中子。252Cf自發(fā)裂變中子源可應(yīng)用誘發(fā)突變。B射線是電子或正電子的射線束，由32P和35S等放射性同位素直接發(fā)生的。透過(guò)植物組織能力弱，但電離密度大。當(dāng)同位素溶液進(jìn)入組織和細(xì)胞后作為內(nèi)照射而產(chǎn)生誘變 作用。X射線和r射線都是能量較高的電磁波，能引起物質(zhì)的電離。 當(dāng)物體的某些較易受輻射敏感的部位受到射線的撞擊時(shí)，而發(fā)生離子化，可以引起DNA鏈斷裂，當(dāng)修復(fù)時(shí)不能恢復(fù)到原狀就會(huì)出現(xiàn)突變。如果射線擊中染色體則可能導(dǎo)致斷裂，在修復(fù)時(shí)可能造成缺失、重復(fù)、倒位和易位等染色體畸變。中子不帶電，但當(dāng)

18、與生物體內(nèi)的原子核撞擊后，使原子核變換產(chǎn)生r射線等能量交換，從而影響DNA和染色體的改變。3.2化學(xué)誘變劑化學(xué)誘變劑種類(lèi)很多，如工業(yè)污染中的煤煙和汽車(chē)廢氣中的苯并芘，工業(yè)試劑及工業(yè)原料中的乙烯亞胺、甲醛，食品工業(yè)中的亞硝酸鹽，食品污染中的黃曲霉毒素等等，都可以引起突 變?；瘜W(xué)誘變劑誘變機(jī)理： 烷化劑：指具有烷化功能的化合物，帶有一個(gè)或多個(gè)活性烷基，該烷基轉(zhuǎn)移到一個(gè)電子密度較 高的分子上，可置換堿基中的氧原子，堿基被烷化后，DNA在復(fù)制時(shí)會(huì)導(dǎo)致配對(duì)錯(cuò)誤，產(chǎn)生突變。疊氮化鈉：一種動(dòng)植物的呼吸抑制劑，可使復(fù)制中的DNA的堿基發(fā)生替換，從而導(dǎo)致突變體的發(fā)生，是目前誘變率高而安全的一種誘變劑?；瘜W(xué)誘變劑

19、的處理方法： 利用化學(xué)誘變劑處理種子較為普遍，其方法是直接把種子浸泡在含有化學(xué)試劑的溶液中，可以誘發(fā)各類(lèi)體細(xì)胞突變。一般來(lái)說(shuō)，玉米種子的處理效果較差，因?yàn)槌墒斓挠衩鬃蚜Ｅ咧芯?有分開(kāi)的、已定型的雄花和雌穗原基細(xì)胞，并且在突變發(fā)生過(guò)程中容易產(chǎn)生細(xì)胞間的競(jìng)爭(zhēng)， 使突變細(xì)胞受到抑制或消亡，被排斥在生殖過(guò)程之外。用含有化學(xué)藥劑的石蠟油處理玉米花粉是目前已知的最有效的方法。以EMS為例，具體的處理方法步驟如下：用 EMS與輕質(zhì)石蠟油混合，制備成濃度為0.1-0.2%EMS處理液；在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，收集玉米新鮮花粉，在一個(gè)帶蓋的瓶中，把花粉與EMS處理液混合；最后用一把小號(hào)毛刷，把被處理花粉涂到選好的雌穗花絲上。其他誘變因素 除輻射和化學(xué)誘變劑外，過(guò)高或過(guò)低的溫度也可能引起突變。4 PCR誘變法與其他誘變法的比較基因誘變的方法很多，除了基于PCR各種誘變法外，常用的方法還有化學(xué)誘變、寡核苷酸介導(dǎo)的誘變和盒式誘變等。在此將各種誘變方法作一個(gè)簡(jiǎn)單的比較。4.1化學(xué)誘變化學(xué)誘變法常用來(lái)介導(dǎo)大范圍的隨機(jī)突變，其優(yōu)點(diǎn)在于突變范圍廣、效率高、成本低， 操作也相對(duì)較簡(jiǎn)單。 缺點(diǎn)在于突變范圍不可控制，重復(fù)性差。另外，其最大的缺點(diǎn)在于所用的誘變?cè)噭┩莿《净蛑掳﹦?/p>