沉淀法分離生物產(chǎn)品 應(yīng)用實(shí)例內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)

1、沉淀法分離生物產(chǎn)品沉淀法分離生物產(chǎn)品 應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用實(shí)例報(bào)告人：胡報(bào)告人：胡 娜娜制作：楊卓英制作：楊卓英 李李 敏敏果膠原洗面鹽乳果膠原洗面鹽乳食品添加劑食品添加劑果膠果膠一一.沉淀概述沉淀概述1.概念及分類概念及分類2.原理簡要說明原理簡要說明二二.沉淀應(yīng)用實(shí)例沉淀應(yīng)用實(shí)例1.沉淀技術(shù)應(yīng)用沉淀技術(shù)應(yīng)用-多糖多糖2.沉淀技術(shù)應(yīng)用沉淀技術(shù)應(yīng)用蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)一一沉淀概述沉淀概述 1沉淀的概念及種類沉淀的概念及種類（1）沉淀的概念）沉淀的概念：沉淀沉淀是通過改變條件或加入某種是通過改變條件或加入某種試劑，使溶液中的溶質(zhì)由試劑，使溶液中的溶質(zhì)由液相液相轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)變?yōu)楣滔喙滔辔龀龅奈龀龅倪^程。過程。 （2）

2、沉淀的種類沉淀的種類鹽析鹽析等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)沉淀有機(jī)溶劑沉淀有機(jī)溶劑沉淀非離子型聚合物沉淀法非離子型聚合物沉淀法聚電解質(zhì)沉淀法聚電解質(zhì)沉淀法高價(jià)金屬離子沉淀法高價(jià)金屬離子沉淀法熱沉淀法熱沉淀法（一）鹽析（一）鹽析 蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度的溶液中溶解度降低、發(fā)生蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度的溶液中溶解度降低、發(fā)生沉淀的現(xiàn)象稱為鹽析。沉淀的現(xiàn)象稱為鹽析。原理原理1.高濃度鹽離子使蛋白質(zhì)表面雙電層厚度降低，高濃度鹽離子使蛋白質(zhì)表面雙電層厚度降低，靜電排斥作用減弱靜電排斥作用減弱. .2.2.中性鹽比蛋白質(zhì)具更強(qiáng)的親水性，因此將與蛋中性鹽比蛋白質(zhì)具更強(qiáng)的親水性，因此將與蛋白質(zhì)爭奪水分子白質(zhì)爭奪水分子. .鹽析的主要

3、應(yīng)用鹽析的主要應(yīng)用 鹽析是最早使用的生化分離技術(shù)之一，由于易產(chǎn)鹽析是最早使用的生化分離技術(shù)之一，由于易產(chǎn)生共沉作用，故其分辨率不是很高，但配其他手生共沉作用，故其分辨率不是很高，但配其他手段完全能達(dá)到很好的分離效果。由于成本低，操段完全能達(dá)到很好的分離效果。由于成本低，操作安全簡單，對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有很好的穩(wěn)作安全簡單，對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有很好的穩(wěn)定作用，常用于蛋白質(zhì)、酶、多肽、多糖、核酸定作用，常用于蛋白質(zhì)、酶、多肽、多糖、核酸等物質(zhì)的分離純化。等物質(zhì)的分離純化。 （二）等電點(diǎn)沉淀（二）等電點(diǎn)沉淀 利用蛋白質(zhì)在利用蛋白質(zhì)在pHpH等于其等電點(diǎn)的溶液中溶解度下等于其等電點(diǎn)的溶液中溶解度下

4、降的原理進(jìn)行沉淀分級(jí)的方法稱為等電點(diǎn)沉淀法。降的原理進(jìn)行沉淀分級(jí)的方法稱為等電點(diǎn)沉淀法。原理原理 當(dāng)溶液當(dāng)溶液pHpH值為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，分子表面的值為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，分子表面的凈電荷為零，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面雙電層和水化膜的凈電荷為零，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面雙電層和水化膜的削弱或破壞，分子間引力增加，溶解度降低。削弱或破壞，分子間引力增加，溶解度降低。等電點(diǎn)沉析的應(yīng)用等電點(diǎn)沉析的應(yīng)用（一）在生化產(chǎn)品的分離純化過程中，常利用兩性（一）在生化產(chǎn)品的分離純化過程中，常利用兩性物質(zhì)如氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽、酶、核酸等具有物質(zhì)如氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽、酶、核酸等具有不同的等電點(diǎn)的特性來進(jìn)行產(chǎn)品的分離純化。不同的等電

5、點(diǎn)的特性來進(jìn)行產(chǎn)品的分離純化。（二）等電點(diǎn)沉析只適用于水化程度不大，在等電（二）等電點(diǎn)沉析只適用于水化程度不大，在等電點(diǎn)時(shí)溶解度很低的物質(zhì)，如四環(huán)素等在等電點(diǎn)點(diǎn)時(shí)溶解度很低的物質(zhì)，如四環(huán)素等在等電點(diǎn)(pH=5.4)附近附近,難溶于水，能產(chǎn)生沉析。難溶于水，能產(chǎn)生沉析。（三）有機(jī)溶劑沉淀（三）有機(jī)溶劑沉淀 向水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶劑，降低向水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法，溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法，稱為有機(jī)溶劑沉淀法。稱為有機(jī)溶劑沉淀法。原理原理親水性有機(jī)溶劑加入溶液后降低了介質(zhì)的介電常親水性有機(jī)溶劑加入溶液后降低了介質(zhì)的

6、介電常數(shù)，使溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加。數(shù)，使溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加。水溶性有機(jī)溶劑本身的水合作用降低了自由水的水溶性有機(jī)溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了溶質(zhì)分子表面原有水化層的厚度，濃度，壓縮了溶質(zhì)分子表面原有水化層的厚度，導(dǎo)致溶質(zhì)分子脫水凝聚。導(dǎo)致溶質(zhì)分子脫水凝聚。有機(jī)溶劑沉析的應(yīng)用有機(jī)溶劑沉析的應(yīng)用 非離子型聚合物最早在非離子型聚合物最早在20世紀(jì)世紀(jì)60年代時(shí)被用來沉年代時(shí)被用來沉析分離血纖維蛋白原、免疫球蛋白，和沉析一些析分離血纖維蛋白原、免疫球蛋白，和沉析一些細(xì)菌與病毒，近年來廣泛用于核酸和酶的分離純細(xì)菌與病毒，近年來廣泛用于核酸和酶的分離純化?；３恋響?yīng)用實(shí)例沉淀

7、應(yīng)用實(shí)例1、沉淀技術(shù)應(yīng)用、沉淀技術(shù)應(yīng)用-多糖多糖 沉淀技術(shù)在多糖的提取過程中應(yīng)用較多，沉淀技術(shù)在多糖的提取過程中應(yīng)用較多，如多糖提取的初級(jí)階段大多會(huì)用到乙醇沉如多糖提取的初級(jí)階段大多會(huì)用到乙醇沉淀或乙醇分級(jí)沉淀，也有一些植物膠體性淀或乙醇分級(jí)沉淀，也有一些植物膠體性多糖采用鹽析法沉淀有較好的效果。此外，多糖采用鹽析法沉淀有較好的效果。此外，也常采用選擇性沉淀的方法如三氯乙酸去也常采用選擇性沉淀的方法如三氯乙酸去除多糖中蛋白質(zhì)雜質(zhì)。除多糖中蛋白質(zhì)雜質(zhì)。 (1)(1)果膠的提取果膠的提取 果膠是一種廣泛分布于植物體內(nèi)的膠體性多果膠是一種廣泛分布于植物體內(nèi)的膠體性多糖類物質(zhì)，包括原果膠、水溶性果膠和

8、果膠酸三糖類物質(zhì)，包括原果膠、水溶性果膠和果膠酸三大類。它是植物體內(nèi)特有的細(xì)胞壁組分，存在于大類。它是植物體內(nèi)特有的細(xì)胞壁組分，存在于橘子、蘋果、馬鈴薯等植物的葉、皮、莖及果實(shí)橘子、蘋果、馬鈴薯等植物的葉、皮、莖及果實(shí)中，主要用于中，主要用于果醬、果凍、食品添加劑、食品包果醬、果凍、食品添加劑、食品包裝膜以及生物培養(yǎng)基裝膜以及生物培養(yǎng)基的制造。的制造。 鹽析法提取果膠實(shí)驗(yàn)方法：鹽析法提取果膠實(shí)驗(yàn)方法： 15g新鮮仙人掌，小刀切成小顆粒新鮮仙人掌，小刀切成小顆粒80ml小小燒杯，加水燒杯，加水10%鹽酸調(diào)鹽酸調(diào)pH值至值至2.1左右左右超聲波超聲波處理，趁熱抽濾處理，趁熱抽濾 濾液加入一定量鋁鹽

9、飽和溶液濾液加入一定量鋁鹽飽和溶液 攪拌，加攪拌，加NaoH，調(diào)至一定，調(diào)至一定pH 沉析沉析1.51.5小時(shí)后過濾，洗滌沉淀小時(shí)后過濾，洗滌沉淀所得的果所得的果膠鋁沉淀用預(yù)先配制好的膠鋁沉淀用預(yù)先配制好的60%60%的乙醇與的乙醇與10%10%的鹽酸混合液（體積比的鹽酸混合液（體積比7 7：1 1）洗滌，以置）洗滌，以置換出鋁離子換出鋁離子用用60%60%乙醇反復(fù)洗滌沉淀乙醇反復(fù)洗滌沉淀烘烘干就得產(chǎn)品干就得產(chǎn)品 也可以用也可以用乙醇沉淀法乙醇沉淀法提取，但將乙醇沉提取，但將乙醇沉淀法與鹽析法進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇沉淀法與鹽析法進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇沉淀法所得的果膠量較少，產(chǎn)品性狀和色澤淀法所

10、得的果膠量較少，產(chǎn)品性狀和色澤都不好，且乙醇消耗大、濾液收集時(shí)損失都不好，且乙醇消耗大、濾液收集時(shí)損失大；而用鹽析法產(chǎn)品多，質(zhì)量好，節(jié)約能大；而用鹽析法產(chǎn)品多，質(zhì)量好，節(jié)約能源，大大降低成本。所以，用源，大大降低成本。所以，用鹽析法鹽析法提取提取仙人掌中的果膠較傳統(tǒng)的乙醇沉淀法仙人掌中的果膠較傳統(tǒng)的乙醇沉淀法優(yōu)越優(yōu)越。果醬果醬 果凍果凍 妙戀果膠原緊致祛皺眼霜 .美肌一族臉部去角質(zhì)保濕果膠果膠 （2 2）莢膜多糖的提取）莢膜多糖的提取 可采用乙醇、甲醇、丙酮、甲縮醛幾種可采用乙醇、甲醇、丙酮、甲縮醛幾種有機(jī)溶劑單獨(dú)或組合使用對(duì)莢膜多糖沉淀有機(jī)溶劑單獨(dú)或組合使用對(duì)莢膜多糖沉淀提取。實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)甲

11、醇提取。實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)甲醇+ +甲縮醛沉淀的粗甲縮醛沉淀的粗提物，無論是得率還是有效成分都是最好提物，無論是得率還是有效成分都是最好的，而的，而80%80%丙酮與丙酮與86%86%乙醇沉淀效果相當(dāng)，乙醇沉淀效果相當(dāng)，由于甲醇由于甲醇+ +甲縮醛成本很高，同時(shí)考慮到操甲縮醛成本很高，同時(shí)考慮到操作和產(chǎn)品安全問題，所以，一般采用作和產(chǎn)品安全問題，所以，一般采用86%86%乙乙醇沉淀。醇沉淀。.-多糖,天然 草莓保鮮劑口腔生物多糖膜多糖膜 2.2.沉淀技術(shù)應(yīng)用沉淀技術(shù)應(yīng)用蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)（酶）的提取在粗分離階段大多要用蛋白質(zhì)（酶）的提取在粗分離階段大多要用到沉淀分離的方法，其中到沉淀分離的方法，其

12、中鹽析、有機(jī)溶劑沉鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、多聚物沉淀、選擇性變性沉淀去除雜質(zhì)淀、多聚物沉淀、選擇性變性沉淀去除雜質(zhì)的方法，應(yīng)用較為廣泛。的方法，應(yīng)用較為廣泛。 （1)1)等電點(diǎn)法提取鰱魚魚肉蛋白質(zhì)等電點(diǎn)法提取鰱魚魚肉蛋白質(zhì) 1.1.原料的前處理原料的前處理 新鮮鰱魚去頭、尾和內(nèi)臟，漂洗，采肉，新鮮鰱魚去頭、尾和內(nèi)臟，漂洗，采肉，用用TFTF一一1212型攪拌機(jī)將魚肉攪成肉糜。型攪拌機(jī)將魚肉攪成肉糜。2.2.魚肉蛋白質(zhì)酸溶解條件的確定魚肉蛋白質(zhì)酸溶解條件的確定 （1 1）pH pH 條件的確定條件的確定 （2 2）溶解時(shí)間的確定）溶解時(shí)間的確定 （3 3）固液比的確定）固液比的確定 （4 4）溶解溫

13、度的確定）溶解溫度的確定 （5 5）溶解效果的測定）溶解效果的測定3.3.蛋白質(zhì)沉淀?xiàng)l件的確定蛋白質(zhì)沉淀?xiàng)l件的確定 利用等電點(diǎn)沉淀技術(shù)，小心調(diào)節(jié)魚肉蛋白溶利用等電點(diǎn)沉淀技術(shù)，小心調(diào)節(jié)魚肉蛋白溶解液的解液的pHpH值，當(dāng)值，當(dāng)pHpH值達(dá)到等電點(diǎn)時(shí)，魚肉蛋白質(zhì)值達(dá)到等電點(diǎn)時(shí)，魚肉蛋白質(zhì)便沉淀出來。由于魚肉中含有多種蛋白質(zhì)，其等便沉淀出來。由于魚肉中含有多種蛋白質(zhì)，其等電點(diǎn)各不相同，因此，當(dāng)沉淀物中蛋白質(zhì)含量最電點(diǎn)各不相同，因此，當(dāng)沉淀物中蛋白質(zhì)含量最高或上清液中蛋白質(zhì)含量最低時(shí)，此時(shí)的高或上清液中蛋白質(zhì)含量最低時(shí)，此時(shí)的pHpH值便值便為蛋白質(zhì)等電點(diǎn)沉淀的最適為蛋白質(zhì)等電點(diǎn)沉淀的最適pHpH值。

14、值。 取在最適酸溶解條件下的魚肉蛋白溶解液各取在最適酸溶解條件下的魚肉蛋白溶解液各250 ml250 ml，分別加入氫氧化鈉溶液使之調(diào)節(jié)在不同，分別加入氫氧化鈉溶液使之調(diào)節(jié)在不同的的pHpH值值( (變化范圍：變化范圍：pHpH一一3 39)9)，在，在44條件下保持條件下保持30 min30 min，保證蛋白質(zhì)能充分沉淀出來，然后用低，保證蛋白質(zhì)能充分沉淀出來，然后用低速大容量多管離心機(jī)以速大容量多管離心機(jī)以4 500 r4 500 rminmin離心離心15 min15 min，取上清液及魚肉用微量凱氏定氮法測定粗蛋白含取上清液及魚肉用微量凱氏定氮法測定粗蛋白含量，按下式計(jì)算蛋白溶解率量，

15、按下式計(jì)算蛋白溶解率 蛋白質(zhì)溶解率蛋白質(zhì)溶解率(% )=(% )=魚肉蛋白溶解液的粗蛋魚肉蛋白溶解液的粗蛋白含量魚肉的粗蛋白含量白含量魚肉的粗蛋白含量100100 用等電點(diǎn)沉淀法提取的魚肉蛋白質(zhì)無腥用等電點(diǎn)沉淀法提取的魚肉蛋白質(zhì)無腥味，色澤潔白，蛋白質(zhì)產(chǎn)率高，可達(dá)味，色澤潔白，蛋白質(zhì)產(chǎn)率高，可達(dá)90%90%左左右，而且生產(chǎn)工藝簡單易操作?？稍谏a(chǎn)右，而且生產(chǎn)工藝簡單易操作?？稍谏a(chǎn)實(shí)際中推廣。實(shí)際中推廣。低速大容量多管離心機(jī)低速大容量多管離心機(jī)最佳蛋白質(zhì)來源最佳蛋白質(zhì)來源魚肉魚肉（2 2）棉鈴蟲谷胱甘肽）棉鈴蟲谷胱甘肽S-S-轉(zhuǎn)移酶的純化轉(zhuǎn)移酶的純化 采用聚乙二醇（采用聚乙二醇（PEG)PEG

16、)沉淀法，硫酸銨鹽沉淀法，硫酸銨鹽析法進(jìn)行純化析法進(jìn)行純化 棉鈴蟲棉鈴蟲 .小鼠谷胱甘肽谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移酶ELISA試劑盒BBB (3(3）-甘露聚糖酶的純化甘露聚糖酶的純化 采用硫酸銨鹽析法，丙酮沉淀法，聚乙采用硫酸銨鹽析法，丙酮沉淀法，聚乙二醇沉淀法對(duì)枯草芽孢桿菌二醇沉淀法對(duì)枯草芽孢桿菌K3-14K3-14菌株發(fā)酵菌株發(fā)酵產(chǎn)生的產(chǎn)生的-甘露聚糖酶進(jìn)行提純甘露聚糖酶進(jìn)行提純 聚乙二醇的純化效果最好，易于酶的聚乙二醇的純化效果最好，易于酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)研究，但使用的濃度較大，純化及酶學(xué)性質(zhì)研究，但使用的濃度較大，黏度較大，而且該法酶收率不高，不宜用黏度較大，而且該法酶收率不高，不宜用于生

17、產(chǎn)。丙酮易于回收，成本低，因此，于生產(chǎn)。丙酮易于回收，成本低，因此，工業(yè)上最好采用丙酮沉淀法。工業(yè)上最好采用丙酮沉淀法。博特美博特美TM -甘露聚糖酶甘露聚糖酶 博特美博特美 - -甘露聚糖酶甘露聚糖酶 是由基因工程菌經(jīng)深層液體發(fā)酵而成，是由基因工程菌經(jīng)深層液體發(fā)酵而成，活性強(qiáng)、效價(jià)高，達(dá)到國際領(lǐng)先水平，活性強(qiáng)、效價(jià)高，達(dá)到國際領(lǐng)先水平，能有效提高豆粕類原能有效提高豆粕類原料的代謝能，促進(jìn)生長和健康，是新一代的飼用酶制劑料的代謝能，促進(jìn)生長和健康，是新一代的飼用酶制劑。 -甘露聚糖酶（甘露聚糖酶（endo-1,4-mannanaseendo-1,4-mannanase）是一種新型的酶）是一種新型的酶制劑，屬于一種半纖維素酶類，它除具有一般非淀粉多糖制劑，屬于一種半纖維素酶類，它除具有一般非淀粉多糖（NSPNSP）酶類的作用）酶類的作用降解降解NSPNSP，降低腸道粘度，促進(jìn)營養(yǎng)，降低腸道粘度，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收外；近來很多研究表明，物質(zhì)的消化和吸收外；近來很多研究表明，-甘露聚糖酶甘露聚糖酶還是一種多功能的促生長劑，因?yàn)樗梢源龠M(jìn)類胰島素生長還是一種多功能的促生長劑，因?yàn)樗梢源龠M(jìn)類胰島素生長因子因子IGF-IIGF-