粗多糖含量測定方法學(xué)驗(yàn)證

1、粗多糖含量測定方法學(xué)研究資料一、儀器與試藥 1二、方法得研究 11、檢測波長得測定 22、樣品及對照制備方法 2三、方法學(xué)驗(yàn)證 21、線性 22、精密度實(shí)驗(yàn) 33、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 44、重復(fù)性試驗(yàn) 45、重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 46、準(zhǔn)確度試驗(yàn) 5芪參顆粒粗多糖含量測定方法起草說明 標(biāo)志性成分粗多糖含量測定得方法來源于保健食品功效成分檢測方法白鴻主編( 中國中醫(yī)藥出版社 )得第二法 ,該方法得原理就是 :多糖經(jīng)乙醇沉淀分離后 , 去除其她可溶性糖 及雜質(zhì)得干擾 , 糖與硫酸在沸水浴中加熱脫水生成羥甲基呋喃甲醛 ( 羥甲基呋喃糠醛 ), 再與 蒽酮縮合成藍(lán)綠色化合物 ,其顯色強(qiáng)度與溶液中糖得濃度成正比 ,在 6

2、25nm波長下比色測定。主要研究資料如下 :一、儀器與試藥1、儀器(1) 離心機(jī) (湘南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司 ,型號 TD25-WS);(2) 離心管 :50ml;(3) 水浴鍋 (上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 ,型號 DK-S26);(4) 旋渦混合器 (DioCote,SA8);(5) SHIMADZU UV-1800 紫外可見光分光光度計(jì) ;(6) JB760-68 石英比色皿 (宜興市偉鑫儀器有限公司 );(7) TU-1901 雙光束紫外可見光分光光度計(jì) (北京普析通用儀器有限責(zé)任公司 );2、試藥(1) 葡萄糖 :廣州化學(xué)試劑廠 ,分析純 , 批號為 20110602-1;(2)

3、 無水乙醇 : 西隴化學(xué)股份有限公司 , 分析純 , 批號為 160802 1;(3) 蒽酮 :國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 ,分析純 , 批號為 ;(4) 硫酸 :廣州化學(xué)試劑廠 ,分析純 ,批號為 20150404-1;(5) 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 :標(biāo)準(zhǔn)稱取干燥恒重得分析純級葡萄糖0、 5000g,加水溶解 ,并定容至50ml,此溶液 1ml 含 10mg 葡萄糖 ,用前稀釋 100 倍為使用液 (0、 1mg/ml)。(6) 0、1%蒽酮硫酸溶液 (W/V): 準(zhǔn)確稱取 0、1g 蒽酮置于燒杯中 ,緩緩加入 100ml 80% 硫 酸溶解 ,溶解后呈黃色透明溶液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。3、試樣(1) 樣品顆粒

4、 :XXXXX 有限公司提供。二、方法得研究粗多糖含量測定得方法來源于保健食品功效成分檢測方法白鴻主編 ( 中國中醫(yī)藥出 版社)得第二法 ,本研究針對葡萄糖對照以及樣品得得吸光度進(jìn)行檢測波長測定 ,如下所示 :1、檢測波長得測定取葡萄糖對照品溶液、樣品溶液進(jìn)行紫外光譜掃描,結(jié)果顯示對照品與樣品均在625nm波長附近有最大吸收。序號12波長760、 00624、 50吸光度0、 0550、154葡萄糖對照品紫外波長吸收圖2、樣品及對照制備方法(1) 樣品提取 : 稱取混合均勻得固體樣品2、, 加水 80ml 左右 , 于沸0g, 置于 100ml去初濾液 , 收集余下濾液序號波長吸光度1625、

5、000、3602509、500、2713 芪參顆粒樣品4溶2液2、紫5外0 波長吸0收、圖26水浴中加熱 1小時, 冷卻至室溫后補(bǔ)加水至刻度 (V1), 混勻后過濾 , 棄供沉淀粗多糖。(2) 沉淀粗多糖 :準(zhǔn)確吸取上濾液 (或液體樣品 )5 、0ml(V2), 置于 50ml離心管中 (或2、0ml于15ml具塞離心管中 ), 加入無水乙醇 20ml( 或8ml), 混勻 ,于4冰箱靜置 4小時以上 , 以4000r/min 離心5min,棄去上清液 ,殘?jiān)?0%(V/V)乙醇溶液數(shù)毫升洗滌 ,離心后棄去上清液 ,反復(fù)操作 3次。殘?jiān)盟芙獠⒍ㄈ葜?10ml(V3) 。(3) 標(biāo)準(zhǔn)曲線得

6、繪制 : 準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液 0ml、0、20ml、0、40ml、0、60ml、 0、80ml 、1、0ml 、1、2ml( 相當(dāng)于葡萄糖 0mg、0、02mg、0、04mg、0、06mg、0、08mg、0、10mg、0、 12mg)置于10ml比色管中 ,補(bǔ)加水2、0ml,加入0、1%蒽酮硫酸溶液 6ml, 在旋渦混合器上混 勻, 置沸水浴中加熱 10min, 取出,在流水中冷卻 20min后, 用分光光度計(jì)在 625nm波長處以試劑空白為參比 ,1cm比色皿測定吸光度值。 以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo) , 吸光度值為縱坐標(biāo) , 繪制標(biāo)準(zhǔn) 曲線。(4) 樣品測定 :準(zhǔn)確吸取樣品待測液 2、 0

7、ml(含糖量 20 100g), 按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制步驟于 625nm波長下測定吸光度值并求出樣品含量。三、方法學(xué)驗(yàn)證1、線性取適量葡萄糖對照品 ,精密稱定 ,加水制成 0、 1094mg/ml 得葡萄糖對照品儲備溶液 ,分別 精密吸取葡萄糖對照品儲備溶液 0ml、0、20ml 、0、40ml、0、60ml、0、80ml、1、0ml、1、 2ml,置于 10ml 比色管中 ,補(bǔ)加水 2、 0ml ,依法測定。得標(biāo)準(zhǔn)曲線儲備液。依法測定,分別制成含葡萄糖為 0、21、 88g、43、76g、65、44g、 87、52g、109、40g、131、 28g得溶液,以吸光度 (Y) 為縱坐標(biāo) ,葡糖糖對照

8、品得含量 (X) 為橫坐標(biāo) ,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 ,見下圖 ,其回歸方 程為 : y=0 、00507x+0、0048(r=0、99989),試驗(yàn)表明葡萄糖對照品在 0 131、 28 g范圍內(nèi)呈 良好線性關(guān)系。見表 1。表1 線性考察結(jié)果含量0 21、 8843、7665、4487、 52109、40131、28( g)吸光度 ( Y)-0 、 0 、0、22090、33720、 44310、55610、6635回歸方程0007 1111y=0、 00507x+0 、 0048r=0 、 9999粗多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如下 :粗多糖對照在 0 131、 28g 內(nèi)成良好得線性關(guān)系。2、精密度實(shí)驗(yàn)取一供試品

9、溶液 ,連續(xù)測定 6 次,記錄吸光度 ,結(jié)果見表 2。試驗(yàn)結(jié)果 RSD< 2、0(RSD 0、44 ,n 6),說明儀器精密度良好。表2 儀器精密度試驗(yàn)測定結(jié)果序號吸光度平均吸光度RSD10、339820、341430、34070、34180、 4440、343550、343660、34193、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一樣品 ,按以下時間測定 ,記錄吸光度 ,結(jié)果見表 3。表 3 粗多糖穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果時間0min 30min1h2h3h4h吸光度0、34370、34090、33970、33700、 3342033131hRSD(%)0、602hRSD(%)0、824hRSD(%)1、35結(jié)果表明供

10、試品溶液在顯色反應(yīng)完成后4 小時內(nèi)穩(wěn)定。4、重復(fù)性試驗(yàn)取同一供試品 ,按供試品制備方法制備 6 份供試品溶液 ,并按樣品及對照制備方法 測定粗 多糖含量 ,結(jié)果見表 4。表 4 粗多糖重復(fù)性試驗(yàn)測定結(jié)果 （單位:mg/100g）樣品編號123456含量 (mg/100ml)348343335330335338平均含量338RSD(%)1、91結(jié)果表明 6 份供試品溶液按照粗多糖得檢測方法測定重復(fù)性好。5、中間精密度實(shí)驗(yàn)取同一供試品 （批號 :150401）,由另一操作者于不同時間、不同儀器操作,按供試品制備方法制備 6 份供試品溶液 ,并按樣品及對照制備方法 測定粗多糖含量 ,結(jié)果見表 5。表

11、 5 粗多糖中間精密度試驗(yàn)測定結(jié)果 （單位:mg/100g）標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果含量( g)020、 3240、6460、9681、28101、6121、92吸光度 （ Y）00、0980、 1960、2960、3940、5060、575回歸方程y=0、0048x+0 、0015r=0 、9992樣品測定結(jié)果 :樣品編號123456含量 (mg/100ml)294285297273297287289平均含量RSD(%)3、20結(jié)果表明 6 份供試品溶液按照粗多糖得檢測方法測定進(jìn)行得中間精密度實(shí)驗(yàn)精密度良 好。6、準(zhǔn)確度試驗(yàn)采用加樣回收法 ,精密稱取本品 (批號 :150401,平均含量 :338mg/

12、100g, 平均吸光度 :0、 3449)2、0g各 6 份,按照樣品及對照制備方法 中制備得樣品待測液 6 份,分別從 6份待測液中 吸取 1ml 置于 10ml 比色皿中 ,再分別精密加入 1ml 100% 濃度得對照品溶液 (濃度 :0、 03402mg/ml), 依法進(jìn)行測定 ,記錄吸光度 ,以吸光度計(jì)算回收率 ,結(jié)果見表 6。6 份樣品回收率均 在 95%105%之間 ,平均回收率為 103%,RSD=0 、 78%,該方法準(zhǔn)確度符合要求。表 6 粗多糖回收率試驗(yàn)結(jié)果編號取樣量 (g) 樣品吸光度對照品加入量(mg)對照 測得吸光度加入對照后 總吸光度回收率(%)平均值(%)RSD (%)12、00270、17240、034020、1688