基因測(cè)序技術(shù)在豬藍(lán)耳病防控中的應(yīng)用

1、基因測(cè)序技術(shù)在豬藍(lán)耳病防控中的應(yīng)用伍少欽 曹玉美 陸江 蒙春寧 肖有恩（廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)有限公司良圻原種豬場(chǎng) 南寧橫縣 530317）摘要： 2010 年對(duì)公司歷年保存的 PRRSV 陽性血清和部分問題豬經(jīng) RT-PCR 檢出陽性血清，先后送樣 8 次共 62 個(gè)樣品，成功測(cè)序 59 個(gè)，用 DNAStar 剪切出完整的 ORF5 序列，進(jìn)行基因比對(duì)和進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn) 核苷酸置換率為 58%，同源性從94.7%100%不等，整體分化成兩大類； PRRSV表現(xiàn)出明顯的區(qū)域性和 時(shí)間性，各個(gè)商品豬場(chǎng)間的序列均有所差異，不同時(shí)間段的樣品也有差異。 測(cè)序結(jié)果與目前市面上的疫苗株 ch-1a、ch-

2、1R、HuN4-F112、JXA1、Ingelvac ATP 和 RespPRRS MLV 比對(duì)，發(fā)現(xiàn)公司商品豬場(chǎng)近 4 年流 行的PRRS毒株與HUN4-F112、JXA1比較接近，表明目前流行的 PRRSV以變異株為主。關(guān)鍵詞：豬；藍(lán)耳??； ORF5;基因測(cè)序；進(jìn)化樹、, 、-前言在分子生物學(xué)研究中， DNA 的序列分析是進(jìn)一步研究和改造目的基因的基礎(chǔ)。目前用 于測(cè)序的技術(shù)主要有 Sanger 等（ 1977）發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法和 Maxam 和 Gilbert （1977 ）發(fā)明的化學(xué)降解法。 這兩種方法在原理上差異很大， 但都是根據(jù)核苷酸在某一固定 的點(diǎn)開始，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿

3、基處終止，產(chǎn)生A、T、C、G 四組不同長(zhǎng)度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的 PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得 DNA序列。DNA測(cè)序技術(shù)的目 的：測(cè)定未知序列；確定重組 DNA 的方向與結(jié)構(gòu)；對(duì)突變進(jìn)行定位和鑒定；比較研究。PCR檢測(cè)技術(shù)在上世紀(jì) 90年代已經(jīng)應(yīng)用在動(dòng)物疾病的檢測(cè)中，但由于成本較高，檢測(cè) 量相對(duì)較少。2005年后，PCR和 RT-PCF技術(shù)在養(yǎng)殖動(dòng)物的疫病檢測(cè)中開始普及應(yīng)用?；?測(cè)序技術(shù)， 由于早期成本高，僅限于少數(shù)科研院校，近年來隨著測(cè)序成本的大幅下降，近一兩年來國(guó)內(nèi)部分規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)開始應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)， 尤其以研究豬藍(lán)耳病病毒的演變進(jìn)化最為常 見，測(cè)序技術(shù)在 PRRS的控制與

4、凈化中顯示出其獨(dú)到之處。1 材料與方法1.1 儀器與試劑1.1.1 儀器： Takara TP 600、英國(guó) UVI 凝膠成像系統(tǒng)、 Hettich MIKRO 22R 冷凍離心機(jī)、北京 六一電流儀和水平電泳槽、凈化操作臺(tái)等。1.1.2 試劑：Taq酶、M-MLV、RNA 酶抑制劑、Trizol、DNA Maker 等。1.1.3 引物合成與測(cè)序公司：上海英駿生物技術(shù)有限公司廣州分公司。1.2 方法用常規(guī)RT-PCR方法檢測(cè)出PRRSV陽性的樣品。樣品經(jīng)克隆或經(jīng) PCR大量擴(kuò)增后送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。1.2.3 用 DNAStar Lasergene 7.1 進(jìn)行序列分析， 比對(duì)各個(gè)樣品的測(cè)序結(jié)

5、果， 并制作 PRRSV ORF5的演變進(jìn)化樹。2結(jié)果與分析2.1全部檢測(cè)結(jié)果與分析2010年公司各商品豬場(chǎng)測(cè)序的59個(gè)PRRSV陽性樣品，剪切出完整的0RF5基因片段(603bp)，進(jìn)行整體0RF5比對(duì)，發(fā)現(xiàn)核苷酸置換率為 58%,兩兩相互比對(duì)，同源性從94.7% 100%不等，整體分化成兩大類；PRRSV表現(xiàn)出比較明顯的區(qū)域性和時(shí)間性；各豬場(chǎng)的序列相對(duì)都有所不同，不同的時(shí)間段檢測(cè)相對(duì)也有所不同。與目前市面上存在的疫苗株ch-1a、ch-1R、HuN4-F112、JXA1、Ingelvac ATP和RespPRRS MLV進(jìn)行兩兩比對(duì)，發(fā)現(xiàn)公司商品場(chǎng)近 4年流行的PRRSV毒株與HuN4-F

6、112、JXA1比較接近，說明目前流行的以變異株為主(詳見 表1)。表1商品豬場(chǎng)59個(gè)樣品與市面疫苗 ORF5同源性比較疫苗毒株名最小相似(%)最大相似(%)疫苗毒株名最小相似(%)最大相似(%)RespPRRS MLV88.2089.00Ingelvac ATP89.2090.80ch-1a93.5095.00ch-1R92.7094.20JXA197.2098.70HuN4-F11296.5098.302.2商品豬場(chǎng)A檢測(cè)結(jié)果與分析為進(jìn)一步了解PRRSV測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，以A豬場(chǎng)為例進(jìn)行詳細(xì)分析，A豬場(chǎng)病料的來源見來源于產(chǎn)房弱仔、產(chǎn)房母豬、保育病豬和流產(chǎn)母豬(見表2),表明PRRSV寸各階段

7、豬只都有影響。表2廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)A商品豬場(chǎng)20102011年樣品送檢測(cè)序情況表編號(hào)豬只狀態(tài)耳號(hào)收樣時(shí)間測(cè)序時(shí)間說明(臨床癥狀)1不詳2008 年20100205發(fā)病豬8保育豬-2010020120100205發(fā)病豬9保育豬-2010020120100205發(fā)病豬18保育豬-2010060320100707發(fā)病保育豬22產(chǎn)房母豬4頭J222104、 J39601、J200802、 J396106201007082010070144頭混合樣品25后備豬24840620100712201007014發(fā)燒26產(chǎn)房弱仔-20100712201007014產(chǎn)房第4棟30保育豬-20100729201

8、00812第3棟發(fā)病31保育豬-2010072920100812第6棟發(fā)病32保育豬-2010072920100812第7棟發(fā)病337周齡保育豬-20100801201008128月季度檢測(cè)(發(fā)病)34保育豬-2010072920100812第8棟發(fā)病359周齡保育豬-20100801201008128月季度檢測(cè)(發(fā)病)41斷奶弱仔-2010100620101010產(chǎn)房5斷奶弱仔:43流產(chǎn)母豬424903J2010101120101014流產(chǎn)母豬51流產(chǎn)母豬J164902、 K2487082010122120110117流產(chǎn)母豬52保育病豬-2010121120110117保育病豬54產(chǎn)房弱仔

9、-2011010520110117產(chǎn)房仔豬保育-2010122120110117發(fā)病保育豬對(duì)A豬場(chǎng)20個(gè)PRRSV測(cè)序結(jié)果剪切出的 ORF5片段（603bp）進(jìn)行比對(duì)分析，兩兩比較 同源性從95.5%100%不等，PRRS病毒的進(jìn)化樹如圖1，整體核苷酸置換率為 53%, A豬場(chǎng) 的PRRSV寅變成兩大類。測(cè)序結(jié)果表明 A豬場(chǎng)內(nèi)至少存在2種不同的PRRSV對(duì)2010年8月12日送測(cè)序的結(jié)果比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)同源性從96.2%100%,表明當(dāng)時(shí)7月份采血的發(fā)病豬的 PRRSV相互間存在差異，可能存在3個(gè)毒株，編號(hào)30、32和34同源性為100%,為同一毒株；編號(hào) 31和33同源性為100%,為同一毒株

10、，編號(hào) 35號(hào)與其他的 不同，為另一毒株（詳見圖2 ）。.-.7 -I：:h ' ' I代訂.：' - ： |：'圖1 A豬場(chǎng)PRRS ORF5基因進(jìn)化樹Percent Identity1234561962100.097.5100097.5123 995.296296296.22 3003.997.5100.097.53 -42.53.925975100.04 :50 03.9002.597.55 ；G2.53.925002.56 :1234563 0-GXYX-YP- byz-3D-20100729seq35-GXYX-YP-byz-9W'2010OS

11、Oxseq34-GXYX-YP-byz-SD-20100729 seq33-GXYX-YP-byz-7W-2010OSOxseq3 2-GXYX-YP- byz-7D-2) 100729seq31-GXYX-YP-byz-6D-20100729seq圖2 20100812送檢PRRSV測(cè)序結(jié)果 ORF5上匕對(duì)結(jié)果對(duì)2011年1月17日送測(cè)序的結(jié)果比對(duì)分析， 發(fā)現(xiàn)ORF5的同源性在99.5%100%, PRRSV 在ORF5片段上的變異很小（詳見圖3）。表明去年12月份和2011年1月采集的發(fā)病豬很可 能是由一個(gè)新的毒株引起。Percent Identity123451100.0997100.0

12、99.5151-GXYX-YPJvlZLC(H2)-2) 101221 seq200997100099.5259-GXYX-YP-BYZ-20101221ZBseq3030.399.799.5354-GXYX-YP-CFRZ0110105seq400000.399.5456SXYX-YP-CFRZ-20101208 seq505050.505552SXYX-YP-BYBZ-20101211.seq12345圖3 20110117送檢PRRSV測(cè)序結(jié)果 ORF5比對(duì)結(jié)果3討論3.1藍(lán)耳病病毒和流感病毒類似，變異很快，甚至比PRRSV的變異更快。如何發(fā)現(xiàn) PRRSV的變異，這就需要定期對(duì) RT-P

13、CF陽性的產(chǎn)物或克隆產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，分析其序列是否發(fā)生變 異。長(zhǎng)期跟蹤測(cè)序，可以發(fā)現(xiàn)病毒在豬場(chǎng)內(nèi)部的來源與演變，各個(gè)豬場(chǎng)之間是否存在交叉感染，病毒是引種帶來還是內(nèi)部的演變，可以大概推測(cè)出新病毒是應(yīng)用新活苗引入還是通過人員引入等。3.2藍(lán)耳病序列的變異大小與致病程度沒有絕對(duì)的必然聯(lián)系，雖然有時(shí)甚至發(fā)生1%差異，都會(huì)帶來PRRS的爆發(fā)；但總體上看，一般來說序列分析同源性越高，即變異越小，對(duì)豬場(chǎng) 的危害也相對(duì)較小。假如豬場(chǎng)發(fā)生PRRS需要使用疫苗，如何挑選最合適的疫苗，應(yīng)該對(duì)發(fā)病豬采集病料進(jìn)行測(cè)序分析，篩選同源性最高的疫苗用于防制。比如A豬場(chǎng)發(fā)生問題，根據(jù)20110117的測(cè)序結(jié)果，與疫苗進(jìn)行比對(duì)，可

14、以選擇以HUN4-F112和JXA1毒株制成的疫苗 進(jìn)行試用，因?yàn)檫@兩個(gè)毒株與當(dāng)時(shí)A豬場(chǎng)PRRSV勺同源性均在98%以上。3.3后備豬的馴化，盡可能用本場(chǎng)完全相似的PRRSV®株。目前國(guó)內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)通用的方法是用本場(chǎng)血清（含 PRRSV或者用序列相似的活苗馴化后備豬。馴化三個(gè)月后，才引入母豬場(chǎng) 內(nèi)，防止馴化期間排毒，引發(fā)母豬場(chǎng)出現(xiàn)疾病問題。3.4小區(qū)域PRRS的控制與凈化方法已經(jīng)非常明確，也非常有效，但PRRSV勺很多機(jī)理至今沒有搞清楚，因此 PRRS還將是養(yǎng)豬業(yè)最重要的一個(gè)疾病。在機(jī)理沒有明確的前提下，要想 長(zhǎng)期控制與凈化PRRS測(cè)序與分析工作對(duì)豬場(chǎng)的穩(wěn)定顯得十分必要。3.5藍(lán)耳病的測(cè)序工作不單是某個(gè)豬場(chǎng)的問題，應(yīng)該普及到整個(gè)省及國(guó)家層面上，建議交流與共享各個(gè)省市的測(cè)序結(jié)果，這樣分析起來將更有意義。通過同源分析和進(jìn)化樹分析，甚至 可以分析某一新病毒的傳播流行狀況，到底是內(nèi)部變異通過豬群、空氣傳播，還是疫苗本身或其他因素造成。在政府國(guó)家層面上進(jìn)行豬PRRS勺控制與凈化，收效將會(huì)更快。4結(jié)果59個(gè)樣品經(jīng)測(cè)序后剪切出 ORF5進(jìn)行比對(duì)和進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)核苷酸置換率為