生物化學之蛋白質化學

1、第二章 蛋白質化學Protein Chemistry 第一節(jié) 蛋白質概述 一、蛋白質的概念蛋白質是一切生物體中普遍存在的四類生物大分子之一，是生物功能的主要載體。生物遺傳形狀（存在于信息大分子DNA中）是通過蛋白質來表現(xiàn)的。蛋白質是由天然氨基酸(amino acid)通過肽鍵(peptide bond)連接而成的生物大分子，分子量一般在一萬到一百萬，甚至高達數百萬。 蛋白質種類繁多、各具一定的相對分子量、復雜的分子結構和特定的生物功能。成千上萬種蛋白質，在結構和功能上的驚人的多樣性歸根結底是由20種常見氨基酸的內在性質造成的。這些性質包括：聚合能力；特有的酸堿性質；側鏈的結構及其化學功能的多樣

2、性；手性。本節(jié)主要講述這些性質，它們是討論蛋白質和酶的結構、功能以及許多其他有關問題的基礎。二、蛋白質的化學組成1、元素組成C、H、O、N、P、S蛋白質元素組成的一個特征是無論樣品來源如何，其含N量一般均在15-17%，平均16%，即1克的N相當于6.25克的蛋白質。粗蛋白% = N% ´ 6.25這是凱氏定氮法測定蛋白質含量的基本原理。這里要注意兩點：（1）所測蛋白為粗蛋白（2）對于某些蛋白質已知含氮量則不用6.25。如小麥為5.83,大豆為5.71等。 2、蛋白質的分子組成蛋白質=多肽鏈 +非蛋白質物質(輔基) polypeptide nonprotein （cofactor）

3、蛋白質在酸、堿、酶的作用下由大分子逐漸水解為分子量較小的胨、肽，最終水解成氨基酸?？梢姲被崾且磺械鞍踪|分子組成的基本單位。有些結合蛋白質含有其它一些小分子物質。三、蛋白質的分類（至少四類）(1)根據蛋白質的分子形狀分類球狀蛋白質（Globular protein）：易溶解、能成結晶。 纖維狀蛋白質（ Fibrous protein- ）：分子形狀不對稱，類似棒狀或纖維狀。難溶，結構物質。(2)根據蛋白質的化學組成分類簡單蛋白質（Simple protein） -只含有氨基酸。如溶菌酶復合蛋白質（Conjugated protein ）-由簡單的蛋白質和非蛋白質物質結合而成。如血紅蛋白(血紅素

4、)復合蛋白質又可分為色蛋白（血紅蛋白）、糖蛋白、磷蛋白（AA-OH結合，卵黃蛋白）、核蛋白（核糖體-RNA）、脂蛋白（血漿脂蛋白） (3)根據蛋白質的溶解度分類清蛋白Albumin 溶于水（血清白蛋白）。球蛋白Globulin 微溶于水，而溶于稀鹽溶液（大豆球蛋白）。谷蛋白Glutelin 不溶于水、醇及鹽溶液，而溶于稀酸或堿（米蛋白）。 醇溶蛋白Gliadin 不溶于水，但溶于70-80%的乙醇（玉米醇溶蛋白）。精蛋白Protamine 溶于水及酸性溶液，呈堿性。組蛋白Histone 溶于水及稀酸性溶液，含較多的精氨酸和賴氨酸。 硬蛋白Scleroprotein 不溶于水、鹽、稀堿、稀酸溶液

5、。(4)根據蛋白質的功能分類活性蛋白質（Active protein） 如酶(Enzyme ）and 、激素（Hormone）、抗體（antibody)等。非活性蛋白質（Passive protein） 是一類結構蛋白質，多起保護和支撐作用。如膠原蛋白和角蛋白(Collagen and keratin) 。 四、蛋白質的分布和生物學意義形態(tài)學功能（Morphological function）毛發(fā)、皮膚-角蛋白，骨骼、牙齒-鈣+膠原蛋白 生理學功能（Physiology function）：催化、調節(jié)、運輸、生物膜等營養(yǎng)學功能（Nutritional function）：外源蛋白的營養(yǎng)功能第二

6、節(jié) 蛋白質的基本結構-氨基酸一、蛋白質的水解蛋白質可以被酸、堿和蛋白酶水解，在水解過程中逐漸降解成分子量越來越小的肽段，直到最后成為氨基酸的混合物。蛋白質多肽 寡肽二肽氨基酸 根據蛋白質的水解程度可分為完全水解、部分水解三種蛋白質水解方法的優(yōu)缺點1、酸水解6mol/L鹽酸或 4mol/L硫酸水解，20小時左右，完全水解。優(yōu)點不引起消旋作用，得到的是L-氨基酸。 缺點色氨酸完全被沸酸破壞，羥基氨基酸和酰胺被部分水解。2、堿水解5mol/LNaOH共煮10-20小時，即可完全水解。在水解過程中，多數氨基酸有不同程度的破壞，產生消旋作用。特別是引起精氨酸脫氨。3、酶水解不產生消旋作用，也不破壞氨基酸

7、。但一種酶往往水解不徹底南需要幾種酶的協(xié)同作用才能使蛋白質完全水解，并且酶水解所需時間較長。常用的蛋白酶有動物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶二、氨基酸（Amino acid）的結構與分類1、氨基酸的結構通式（1）都是-AA，有酸性的-COOH基和堿性的NH2，為兩性電解質。（2）如果RH，-C為不對稱C原子，因而是光學活性物質。第一特點使不同氨基酸具有某些共同的化學性質；第二特點使各種氨基酸具有某些共同的物理性質。 除Gly無不對稱C原子因而無D-及L-型之分外，一切-氨基酸的-C原子都為不對稱C原子，都具有光學活性，能使偏振光平面向左或向右旋轉，向右旋轉的叫右旋體，以（+）表示，向左旋轉的

8、叫左旋體，以（-）表示。氨基酸的D-及L-型（即氨基酸的光學異構體的表示方法及命名）是以甘油醛或乳酸為原始參考標準的。由于在天然蛋白質中發(fā)現(xiàn)的氨基酸都屬L型，因此L型氨基酸稱為天然氨基酸。（目前還不能肯定高等動植物是否含有D-型氨基酸，但在細菌中也有發(fā)現(xiàn)，且是與氨基糖結合，其生物學功能尚難確定） 命名：氨基酸的化學名稱根據有機化學標準命名法命名，如： ，-二氨基己酸（賴氨酸）通常多用俗名，即根據天然氨基酸的來源和性質命名。如-氨基乙酸由于具有甜味而稱甘氨酸等。2、常見氨基酸的分類及結構 氨基酸通常根據R基團的結構和性質，有三種主要分類方法(1)、根據R基團的化學性質分為：脂肪族氨基酸、芳香族氨

9、基酸、雜環(huán)族氨基酸 (2)、根據R基團的酸堿性分為：酸性氨基酸、堿性氨基酸、中性氨基酸 (3)、根據R基團的電性質分為R基團帶電荷AA（酸、堿）、R基團不帶電荷極性氨基酸（羥基、酰胺、巰基）、非極性氨基酸（烴鏈、芳香環(huán)、硫甲基）3、蛋白質分子中的非標準氨基酸稀有氨基酸非蛋白氨基酸自然界中還有150多種不參與構成蛋白質的氨基酸。另外還有從營養(yǎng)學角度分的根據氨基酸對人體生理的重要性和體內能否合成，將氨基酸分為必需氨基酸和非必需氨基酸兩大類。必需氨基酸（essential amino acids） ：對成人有八種必需氨基酸：蘇氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，賴氨酸，色氨酸，苯丙氨酸和蛋氨酸。而精氨酸

10、，組氨酸是幼兒所必需的，故稱為半必需氨基酸。三、氨基酸的理化性質（一）物理性質1.晶形和熔點：-氨基酸均為無色晶體，不同氨基酸晶形不同，氨基酸熔點較高2.全部能溶酸堿性溶液中，少數能溶于有機溶劑，溶水能力與基團的極性有關（二）氨基酸的旋光性（ rotation）從-氨基酸的結構通式可以看出，除R基為氫原子外，即除甘氨酸外，均含有不對稱碳原子，其上四個取代基在空間的排列可以有兩種不同的方式，即L型和D型，它們彼此是一種不能疊合的物體與鏡象關系或左右手關系，分子的這兩種形式稱為光學異構體（optical isomers）、對映體(enantiomers)或立體異構體（stereoisomers）。

11、一個旋光化合物的旋光性可以用旋光率 Dt（或稱比旋光度）來表示，它是-氨某酸的物理常數之一，是鑒別各種氨基酸的一種根據。 DtDt×100/(L×C) Dt為旋光率L為旋光管的長度，單位為分米；C為溶液濃度，即100ml溶液中所含溶質的克數Dt是在鈉燈（D線，589.6或589.0nm）為光源，溫度為t，管長為L，濃度為C時所測得的旋光度。注意旋光率（比旋光度）不等于旋光度。 如何用它鑒別和測定AA含量？氨基酸的旋光符號和大小取決于它的R基性質，并且與測定的溶液pH有關。 當溶劑、溫度、一定， Dt值是定值。pH對L-亮氨酸（）和L-組氨酸（II）的25D值的影響通過影響基

12、團的解離而影響旋光度（三）吸光性所有的氨基酸在可見光范圍內均無吸收，只有下列氨基酸在近紫外有吸收。Tyr : lmax=275nmTrp : lmax=280nmPhe : lmax=259nm2、氨基酸的兩性解離及等電點氨基酸晶體具有很高的熔點，一般在200以上。例如甘氨酸在233熔解并分解，酪氨酸的熔點更高（340），但是普通的有機化合物如二苯胺熔點為53。此外，還發(fā)現(xiàn)氨基酸能使水的介電常數增高，而一般的有機化合物如乙醇、丙酮等卻使水的介電常數降低。推測：氨基酸在晶體或水中主要是以兼性離子(zwittterion)亦稱偶極離子(dipolarion)的形式存在，不帶電荷的中性分子為數極少。

13、氨基酸的滴定曲線(1)反映在不同的pH條件下，AA的帶電狀態(tài)、兩性解離及等電點。(2) 計算出氨基和羧基的解離常數 pH=pK + lg質子受體/質子供體氨基酸的等電點Isoelectric point of Amino Acids 氨基酸（AA）溶液在某一pH時，AA的氨基和羧基的解離度完全相同，此時，AA分子所帶的正、負電荷相等，即AA分子的凈電荷為零，它在電場中既不向陽極移動，也不向陰極移動，此時，AA溶液所處的pH就稱為該AA的等電點(Isoelectric point，用pI表示)。 AA在溶液中的帶電狀態(tài)與溶液pH的關系當pH=pI時，凈電荷為0；當pH<pI時，AA帶正電；

14、當pH>pI時，AA帶負電。當溶液pH偏離pI越遠，AA所帶的凈電荷數目越多。等電點的計算：取決于氨基酸的解離常數對于一氨基一羧基的AA: pI=(pK1 + pK2)/2對于一氨基二羧基的AA: pI=(pK1 + pKR)/2 對于二氨基一羧基的AA: pI=( pKR+ pK2)/23、氨基酸的重要化學反應（1）氨基的反應A、與亞硝酸的反應注：1、此反應氮來自AA和亞硝酸，各占50%， 反應是定量的。 2、-氨基的反應比其它氨基要快得多（3-4分，可控制時間來控制其它氨基的干擾），且亞氨基及雜環(huán)中的結合氮（如Arg，His，Try）無此反應。3、可用于氨基酸定量及蛋白質水解程度的測

15、定。、Pro是一個亞氨基酸，沒有此反應B、與甲醛反應（甲醛滴定法） AA是一個兩性電解質，但不能用酸、堿直接來滴定，因為等當點的pH或過高（1213）或過低（12）沒有適當的指示劑可以被選用。甲醛與NH2結合后降低了氨基的堿性，是滴定終點移到了9附近。注意：1、甲醛的加入使氨基的酸性大大增強，氨基的PKa下降到6.5（原為9.7）溶液的PH降到6.7，此時可用酚酞作指示劑，以NaOH進行滴定，每釋放一個氫相當于一個氨基酸。2、此反應可用來測定蛋白質的水解程度C、與?；噭┓磻涸摲磻诙嚯?、蛋白質的人工合成中被用作氨基的保護試劑如：與丹磺酰氯、芐氧（苯甲氧）甲酰氯反應D、烴基化反應：該反應用于

16、鑒定多肽和蛋白質的氨基末端。如：2，4二硝基氟苯（DNFB）. -羧基的反應HOOC-CH2-CH2-CHCOOHHOOC-CH2-CH2-CH2+CO2 脫羧 NH2 NH2 成鹽.氨基和羧基共同參與的反應A、成肽反應B、與茚三酮的反應 注意：與Pro反應產物是黃色4、氨基酸的分離制備和分析鑒定 目前分離分析常用方法層析法層析技術三個條件：.水不溶性惰性支持物（載體）.流動相（溶劑系統(tǒng)）.固定相（附著在支持物上的水、離子、活性基團）根據作用原理不同，具體技術有：吸附層析離子交換層析 分配層析（紙層析）分子過濾層析等 一、肽的概念1、結構：肽是氨基酸鏈氨基酸通過肽鍵連接形成的鏈狀化合物稱為肽(

17、peptide） 肽是氨基酸的線性聚合物，因此常稱為肽鏈(peptide chain）。2、肽與氨基酸的區(qū)別相同點：均含有-COOH，-NH2；不同點：（1）肽中-COOH，-NH2的距離比氨基酸大，可離子化程度較低。一般肽鏈越大，可離子化程度越低。（2）肽中N端的-NH2的PK比游離氨基酸小，而C端的-COOH的PK比游離氨基酸大，R基的PK在兩者之間。二、生物活性肽生物體內一些具有特殊功能的肽，稱為生物活性肽（天然肽）一般多為寡肽和分子較小的多肽生物活性肽一般與機體的免疫防御、代謝調節(jié)等功能有關。如：谷胱甘肽（GSH）、神經肽、抗菌肽1、谷胱甘肽-參與氧化還原反應 谷胱甘肽（GSH）是活細

18、胞的重要組成成分，活性的SH極易被氧化（變成GSSG），在生物氧化，-SH保護，酶活性和氨基酸運輸中具有重要作用。2、其它肽 第三節(jié)蛋白質的結構一、蛋白質分子的基本化學結構（共價結構）- 一級結構根據國際純化學與應用化學聯(lián)合會(IUPAC)1969年的規(guī)定，一級結構專指氨基酸序列，而蛋白質的化學結構則包括肽鏈數目、端基組成、氨基酸序列和二硫鍵的位置，又稱共價結構。氨基酸如何連接成肽鏈及氨基酸在肽鏈中的連接次序。肽鍵是主要連接鍵（-CO-NH-），多肽鏈（多個氨基酸以肽鍵結合形成的鏈）是一級結構的主體。1.一 級 結 構（ 線 性 結 構） 蛋白質的一級結構 (primary structure

19、)指它的氨基酸序列 。 二 硫 鍵：價 鍵 牢 固， 穩(wěn) 定 蛋 白 質 結 構SH+SHSS巰基二硫鍵維持蛋白質一級結構的作用力是： 肽鍵、二硫鍵。 蛋白質一級結構的測定氨基酸序列分析氨基酸序列分析的一般步驟(1)測定蛋白質分子中多肽鏈的數目；(2)拆分蛋白質分子的多肽鏈；(3)斷開多肽鏈內的二硫橋； (4)分析每一多肽鏈的氨基酸組成；(5)鑒定多肽鏈的N一末端和C一末端殘基；(6)裂解多肽鏈成較小的片段；(7)測定各肽段的氨基酸序列；(8)重建完整多肽鏈的一級結構；(9)確定半胱氨酸殘基間形成的S-S交聯(lián)橋的位置 二、蛋白質的空間結構1、構型與構象構型：是由于化合物中某一不對稱碳原子四種不

20、同的取代基團的空間排列所形成的一種光學活性立體結構。構型的轉變必須發(fā)生化學鍵的斷裂構象：是分子內所有原子和原子團的空間排布所形成的一種立體結構。只要分子中發(fā)生CC鍵的轉動，就會發(fā)生構象的變化。影響蛋白質構象的作用力有哪些？內力（內因）：蛋白質分子內各原子間作用力外力（外因）：與溶劑及其他溶質作用力內因為主，外因通過改變內因起作用按不同種類內力以及產生的構象變化把構象劃分為二、三、四級層次。 3、蛋白質的二級結構（Protein Secondary Structure） 蛋白質的二級結構是指蛋白質分子中多肽鏈本身（主鏈或骨架）的折疊方式，它借助于氫鍵排列成自己特有的-螺旋和-折疊等片段，它是一種

21、有規(guī)則的重復構象象彈簧的螺圈延一維方向伸展。蛋白質的二級結構限于主鏈原子的空間排列。多肽鏈的二級結構主要有以下幾種方式(1) -螺旋結構（ Helix ）(2) -折疊結構（ pleated sheet ）(3) -轉角（ bend or turn ）(4) 無規(guī)卷曲(random coil) 由于蛋白質主鏈的基本構象都是以酰胺平面為基本結構單位，有規(guī)則的盤曲而成，因此，在討論主鏈構象之前先認識酰胺平面。(1) 酰胺平面與二面角(、)酰胺平面（ amide plane ）或稱肽平面 （ peptide plane）：每個肽單位的六個原子（CCONHC）都被酰胺鍵固定在同一個平面上，該平面稱為酰

22、胺平面（或肽平面）。二面角(、)：繞CC鍵旋轉的角度稱 角；繞 NC鍵旋轉的角稱角。 蛋白質的 二 級 結 構 蛋白質多肽鏈本身的盤繞與折疊方式。包括螺旋、折疊片、轉角、自由回轉四種方式。A. 螺旋（蛋白質最常見的二級結構形式） 螺旋是肽鏈的盤繞形式有左右手之分-螺旋結構特點 1) 主鏈繞中心軸按右手螺旋方向盤旋，每3.6 個氨基酸殘基前進一圈，每圈前進距離是0.54nm，每個氨基酸殘基占0.15nm。2) 每個氨基酸殘基的亞氨基與它前面第四個基酸殘基的羰基氧原子形成氫鍵，氫鍵與螺旋軸近似平行。3)側鏈R在螺旋的外側。 -螺旋的穩(wěn)定性是靠氫鍵來維持的。-螺旋有左手螺旋和右手螺旋兩種，但天然的蛋

23、白質大多是右手螺旋。影響-螺旋形成和穩(wěn)定的因素：氨基酸的組成和排列順序（如肽中Pro無法形成氫鍵，不能-螺旋）；氨基酸所帶電荷性質（如不帶電多聚丙氨酸在PH7水中能自發(fā)形成-螺旋，但多聚Lys在同樣條件下由于R基帶正電荷，相排斥，不能形成-螺旋）；R側鏈大?。ㄔ?C邊大R基由于空間位阻不能形成-螺旋）。B、-折疊結構(-片層結構) -折疊結構是兩條或兩條以上充分伸展成鋸齒狀折疊構象的多肽鏈，側向聚集，按肽鍵的長軸方向平行并列，形成折扇狀的結構。 -折疊構象靠相鄰肽鏈主鏈亞氨基和羰基氧原子之間形成有規(guī)則的氫鍵來維系。C、-轉角又稱U形回折、-轉彎或發(fā)夾結構。蛋白質分子的主鏈在盤曲折疊運行中，往往

24、發(fā)生180度的急轉彎，這種回折部位的構象，即所謂的-轉角。-轉角是由4個連續(xù)的氨基酸殘基組成的，第一個氨基酸殘基的羰基氧原子與第四個氨基酸殘基的亞氨基連接來穩(wěn)定構象。Gly 、Asp、Asn和Trp常常出現(xiàn)在-轉角中。作用力同樣是肽鍵衍生來的氫鍵但由于只有這一個氫鍵，只形成轉角結構。 O （ 氫 鍵 ）H C（NHCHCO）2N D、無規(guī)卷曲它是多肽主鏈不規(guī)則、多向性地隨機盤曲所形成的構象。球蛋白分子中常見的一種主鏈構象。 以上是蛋白質的二級結構的主要構象，它們在不同的蛋白質分子中的分布差別很大。 (3) 蛋白質的超二級結構 (super-secondary structure)是指二級結構的

25、基本結構單位(-螺旋、-折疊等)相互聚集，形成有規(guī)則的二級結構的聚集體。已知的超二級結構有3種基本組合形式 -螺旋的聚集體() -螺旋與-折疊的聚集體() -折疊的聚集體(和)由二級結構組成的三級結構組件，主要存在于球狀蛋白質。(4) 蛋白質的結構域在較大的球狀蛋白質的分子中，多肽鏈往往形成幾個緊密的球狀構象，彼此分開，以松散的肽鏈相連，此球狀構象就是結構域(structural domain)。結構域是指花式或二級結構組合而成的局部折疊區(qū)域球狀蛋白質的獨立折疊單位，通常也是蛋白質的功能單位（功能域）小的單體蛋白質只有一個結構域結構域三級結構大的單體蛋白質有多個結構域、蛋白質的三級結構A、球狀

26、蛋白質分子的三級結構球狀蛋白質分子的二級結構不是活性分子的結構形式，需要在二級結構的基礎上再盤曲折疊形成三級結構。蛋白質分子的三級結構是指蛋白質分子在一、二級結構的基礎上，借助于各種非共價鍵在三維空間盤曲、折疊成具有特定走向的緊密、近似球狀的構象。球狀構象給出最低的表面積和體積比，因而使蛋白質與環(huán)境的相互作用降到最小，最穩(wěn)定。 蛋白質分子的三級結構包括全部主鏈、側鏈在內的所有原子的空間排部，但不包括肽鏈間的相互關系球狀蛋白質分子三級結構的構象特征(1)三級結構的構象近似球形。(2)分子中的親水基團大多相對集中在球形分子的表面，疏水基團相對集中在分子內部。(3)三級結構構象的穩(wěn)定性主要靠疏水的相

27、互作用來維系。(4)三級結構形成后，蛋白質分子的生物活性中心就形成了。在球形分子的表面往往有一個很深的裂隙，活性部位就在其中。三級結構的典型例子是肌紅蛋白維系三級結構穩(wěn)定的作用力有氫鍵，離子鍵，疏水鍵和范德華力，以疏水鍵起主要作用。B、纖維蛋白分子的三級結構 在纖維蛋白分子中螺旋肽鏈一般為平行排列，例如角蛋白、絲心蛋白、膠原蛋白的三級結構都是如此。維系蛋白質空間結構的化學鍵：(1) 氫鍵(hydrogen bond)(2) 離子鍵(鹽鍵)(Electrostatic interactions)(3) 二硫鍵(disulfide bond) (4) 配位鍵(金屬鍵)(metal bond)(5)

28、疏水相互作用(hydrophobic interaction)(6) 范德華力(van der waals force)鍵能：肽鍵、二硫鍵離子鍵 氫鍵、疏水鍵 范德華力 離子鍵 、氫鍵、疏水鍵 、范德華力這四種鍵能遠小于共價鍵，稱次級鍵 次級鍵微弱但卻是維持蛋白質三級結構中主要的作用力,原因何在? 數量巨大5、球狀蛋白質分子的四級結構 有些球狀蛋白質分子是由兩個或兩個以上的、具有獨立三級結構的肽鏈單位締合而成的，這種蛋白質通常稱為寡聚蛋白或多體蛋白（multimeric protein）。寡聚蛋白分子中的每一個三級結構單位稱為一個亞基(或亞單位subunit、單體monomer)。所謂蛋白質分

29、子的四級結構是指寡聚蛋白分子中亞基與亞基之間的立體排布及相互作用關系。亞基的數目和類型也是四級結構研究的內容。四級結構的穩(wěn)定主要靠亞基之間的疏水相互作用來維系。三、多肽、蛋白質結構與功能的關系（一）多肽的結構與功能生物體中存在多種活性肽，如：生長激素、加壓素、催產素等。（二）蛋白質的一級結構決定高級結構 1、核糖核酸酶的可逆變性2、蛋白質前體的激活、分子病鐮刀狀貧血病血液中大量出現(xiàn)鐮刀紅細胞，患者因此缺氧窒息正常型 -Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys -鐮刀型 -Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys -谷A（極性）纈A（非極性）由于纈氨酸上的非極性基團與

30、相鄰非極性基團間在疏水力作用下相互靠攏，并引發(fā)所在鏈扭曲為束狀，整個蛋白質由球狀變?yōu)殓牭缎?，與氧結合功能喪失， 導致病人窒息甚至死亡。（三）蛋白質空間結構與功能的關系1、血紅蛋白的變構效應與運輸氧的功能調節(jié)結構改變功能 變構現(xiàn)象：外因通過改變蛋白質構象引起蛋白質功能變化的現(xiàn)象。血紅蛋白 （四）同功能(同源）蛋白質結構的種屬差異與保守性同源蛋白質的氨基酸序列具有明顯的相似性1、胰島素一級結構的種屬差異與保守性比較各種哺乳類、鳥類和魚類等動物的胰島素(insulin)一級結構，發(fā)現(xiàn)組成胰島素分于的51個氨基酸殘基中，只有24個氨基酸殘基始終保持不變，為不同生物所共有。這些始終不變的氨基酸殘基，稱為

31、守恒氨基酸殘基(守恒殘基)其他絕大多數守恒殘基是帶有疏水側鏈的氨基。X-光晶體結構分析結果證明這些非極性的氨基酸對維持胰島素分子的高級結構起著穩(wěn)定作用，因而推測不同動物來源的胰島素，其空間結構可能大致相同。一般認為激素的活性中心以及維持活性中心構象的氨基酸殘基不能變，否則激素將失去活性。2、細胞色素c的種屬差異與保守性細胞色素c廣泛存在于一切需氧生物細胞的線粒體之中，是一種包含一個血紅素的單鏈蛋白質。它在呼吸鏈中起著傳遞電子的作用。脊椎動物的細胞色素c的多肽鏈一般是由104個氨基酸殘基所組成的。對50多種不同生物來源的細胞色素c的一級結構作了比較研究，發(fā)現(xiàn)35個氨基酸在各種生物中是保守的其中都

32、含有Cys 14、Cysl7、His 18，Met 80、Tyr 48和Trp59。血紅素是細胞色素c呈現(xiàn)電子傳遞功能的活性中心。根據各種研究得知，這幾個保守殘基是保證細胞色素c發(fā)揮電子傳遞功能的關鍵部位。同功能蛋白質在種屬之間的氨基酸差異大小，通常與這些種屬在進化位置的差距大體上相平行。比較50多種生物的細胞色素c一級結構的種間差異，發(fā)現(xiàn)：凡與人類親緣關系越遠的生物其氨基酸順序與人的差異越大，這些種屬差異可以為生物進化提供重要的依據。這說明生物進化過程中所發(fā)生的種屬差異，不僅表現(xiàn)在生物的形態(tài)結構上，同時也反映在蛋白質分子的一級結構上這也揭示了某些蛋白質在進化上可能來自同一祖先蛋白質，而在長期

33、進化過程中不斷分化出結構與功能相適應的蛋白質。第五節(jié) 蛋白質的重要性質一、蛋白質的膠體性質真溶液的溶質分子的顆粒大小<1nm； 膠體溶液中溶質分子的顆粒大小在1-100nm； 蛋白質分子的相對分子量在1-100萬，其顆粒大小(2-20nm)屬于膠體粒子的范圍。另外，蛋白質分子表面有許多極性基團，親水性極強，易溶與水形成穩(wěn)定的親水膠體溶液。1、穩(wěn)定蛋白質膠體溶液的兩個因素 (1) 表面電荷(在非等電點時)與雙電層；(2) 水化膜蛋白質膠體溶液具有一般膠體溶液的性質丁道爾現(xiàn)象、布朗運動、半透膜不透性、吸附性、膠凝性、粘性。 2、蛋白質的膜分離技術（Membrane Separation Te

34、chnique ） 利用蛋白質的半透膜不透性，將蛋白質中所含的、可以通過半透膜將低分子物質(如鹽等小分子)分離的技術稱為膜分離技術(或膜過濾技術)。膜分離技術可分為透析（dialysis ） 、超濾（ultrafiltration ）二、蛋白質的兩性解離與等電點蛋白質中可解離的酸性基團Glu的-COOHAsp的-COOHTyr的酚羥基Cys的-SH堿性基團 Lys的-NH2His的咪唑基Arg的-胍基蛋白質分子的總解離可用下式表示NH+3-P-COOH(P+)NH+3-P-COO-(P+-)NH2-P-COO-(P-)蛋白質的等電點蛋白質溶液在特定的pH下，其分子所帶的正、負電荷相等，凈電荷為

35、零，這一pH稱為 (用pI表示)。蛋白質的等電點不是一個恒定值，它受溶液的離子種類和離子強度的影響。蛋白質在純水中的帶電狀態(tài)不受其它離子的干擾，完全由H+的解離和結合來決定，這種條件下的等電點稱為蛋白質的等離子點(isoionic point) 。蛋白質的等離子點是特性常數。蛋白質等電點的大小與其氨基酸組成有關。 對于變性的蛋白質，可由其酸性氨基酸與堿性氨基酸的比例來判斷。 對于天然蛋白質，由于其R基團不能完全暴露在外，故不易判斷。在等電狀態(tài)下，蛋白質分子物理性質有所改變，最顯著的是溶解度最小。 根據蛋白質兩性解離和等電點的性質發(fā)展起來的蛋白質純化方法有蛋白質電泳離子交換法等電點沉淀法三、蛋白

36、質的變性作用（ protein denaturation ） 1、概念天然的蛋白質在受到某些物理或化學因素的作用，有序的空間結構被破壞，致使生物活性喪失，并伴隨發(fā)生一些理化性質的異常變化，但一級結構并未破壞，這種現(xiàn)象稱為蛋白質的變性作用。2、蛋白質變性的可逆性可逆變性是指使蛋白質變性的條件解除后，能恢復其原有性質。不可逆變性是指使蛋白質變性的條件解除后，仍不能恢復其原有性質。蛋白質復性（renaturation）：去除變性因素后，可逆變性的蛋白恢復原來的空間結構，恢復生物活性的現(xiàn)象為復性 3、蛋白質的變性因素及其作用機理物理因素熱、UV、超聲波、X-射線、高壓、表面張力、攪拌、劇烈振蕩、研磨。

37、例如 皮膚粗糙、白內障、殺菌化學因素酸、堿、有機溶劑、重金屬鹽、脲、胍、表面活性劑、生物堿 。作用機理 重金屬與-SH生成不溶性的硫化物濃乙醇、去污劑破壞疏水作用力4、變性蛋白質的性質變性蛋白質與天然蛋白質性質的差別主要表現(xiàn)(1)理化性質的變化 如：旋光性改變、粘度增加、光吸收性質增加、失去結晶能力、溶解度下降、易發(fā)生凝聚和沉淀。(2) 生化性質的變化 變性后的蛋白質易被酶水解。(3) 生物活性喪失 這是蛋白質變性的重要標志。四、蛋白質的變構作用（protein allosteric effect ) 對于具有四級結構、含有亞基的蛋白質來講，當一個亞基的構象發(fā)生變化，而引起其余亞基和整個蛋白質

38、分子構象、性質和功能發(fā)生改變的作用稱為蛋白質的變構作用(或稱別構作用）。如血紅蛋白的變構作用五、蛋白質的沉淀作用（precipitation） 1、概念 蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性是有條件的、相對的，若改變環(huán)境條件，破壞其水化膜和表面電荷，蛋白質親水膠體便失去穩(wěn)定性，發(fā)生絮凝沉淀的現(xiàn)象，就稱為蛋白質的沉淀作用。蛋白質的沉淀可分為不變性沉淀用于分離活性的天然蛋白質產品。如： 酶、抗體等。變性沉淀用于生物制品中除去蛋白質。2、沉淀的方法(1) 等電點沉淀蛋白質分子在其等電點時，容易相互吸引，聚合成沉淀(2) 中性鹽沉淀鹽析（salting out) 在蛋白質溶液中加入高濃度的中性鹽后，它與蛋白質膠體粒

39、子競爭水份，使蛋白質膠體粒子表面的水化層破壞而失去穩(wěn)定性，同時降低了蛋白質與水的親和力而使蛋白質沉淀的現(xiàn)象。 鹽濃度高時，中和了蛋白質分子表面的電荷、破壞了水化層，使疏水區(qū)域暴露，疏水基團發(fā)生相互作用而沉淀。鹽溶（salting in)在鹽濃度很低時，大多數蛋白質的溶解度隨著鹽濃度的增加而增加，這種現(xiàn)象稱為蛋白質的鹽溶。低濃度的鹽可增加蛋白質表面的電荷數量和與水分子的相互作用。分級鹽析不同的蛋白質的帶電性質、分子量不同，水膜厚度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不同。一般來講，分子量越大的蛋白質分子，越容易鹽析，所需鹽濃度也越低。因此，對于不同分子大小的蛋白質，可采用不同的鹽濃度進分級沉淀。常用的鹽是

40、(NH4)2SO4(3) 有機溶劑沉淀 一些極性的有機溶劑(如乙醇、丙酮等)能破壞蛋白質膠粒的水化層，使疏水基團暴露使蛋白質沉淀。(4) 重金屬鹽沉淀蛋白質在堿性溶液中帶負電，可與重金屬離子如Zn+2、Cu+2、Hg+2、Pb+2、Fe+3等作用，產生重金屬蛋白鹽沉淀。(5) 熱變性沉淀 (6) 生物堿試劑沉淀生物堿試劑（如單寧酸、鉬酸、鎢酸、三氯醋酸等）具有酸性，而蛋白質在酸性溶液中帶正電荷，故能與帶負電的酸根相結合，成為溶解度很小的鹽類。六、蛋白質的沉降作用（sedimentation)1、概念蛋白質由于其比重大于水，而水中下沉，這就是蛋白質的沉降作用。蛋白質膠體粒子在靜止溶液中，因重力F=mg 很小，沉降1cm需幾年的時間。為了便于觀察和利用這一現(xiàn)象，通常外加一定的力（如離心力）