啟動子克隆方法研究進(jìn)展

1、啟動子克隆方法研究進(jìn)展隨著基因工程的發(fā)展，常常需要構(gòu)建一種能高水平表達(dá)異源蛋白質(zhì)的表達(dá)載體。啟動子對外源基因的表達(dá)水平影響很大，是基因工程表達(dá)載體的重要元件。因此研究啟動子的克隆方法，對研究基因表達(dá)調(diào)控和構(gòu)建表達(dá)載體至關(guān)重要。迄今為止，國外尚未見到有關(guān)啟動子克隆方法的綜述性報道，國內(nèi)僅孫曉紅等曾就啟動子的結(jié)構(gòu)、分類、 克隆方法和食用菌中已經(jīng)分離到的啟動子作過綜述。而近年來又有許多改進(jìn)的克隆啟動子的方法獲得了多方面的成功，本文就近年來改進(jìn)的啟動子克隆方法作一綜述，以期促進(jìn)對啟動子分離技術(shù)的應(yīng)用。1 啟動子克隆的幾種方法1.1 利用啟動子探針載體篩選啟動子啟動子探針型載體是一種有效、經(jīng)濟(jì)、 快速分

2、離基因啟動子的工具型載體，包含 2 個基本部分：轉(zhuǎn)化單元和檢測單元。其中，轉(zhuǎn)化單元含復(fù)制起點(diǎn)和抗生素抗性基因，用于選擇被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；檢測單元則包括1 個已失去轉(zhuǎn)錄功能且易于檢測的遺傳標(biāo)記基因以及克隆位點(diǎn)。利用啟動子探針載體篩選啟動子的過程為，先選用 1 種適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶消化切割染色體DNA，然后將切割產(chǎn)生的DNA限制片段群體與無啟動子的探針質(zhì)粒載體重組，并按照設(shè)計的要求使克隆的片段恰好插在緊鄰報告基因的上游位置；隨后再把重組混合物轉(zhuǎn)化給寄主細(xì)胞，構(gòu)建質(zhì)粒載體基因文庫，并檢測報告基因的表達(dá)活性。當(dāng)插入段同時滿足(1) 具有基因啟動子序列；(2) 具有翻譯啟始區(qū)；(3) 具有啟始密碼子；(

3、4) 插入方向正確；(5) 插入片段3' 端編碼區(qū)序列抗性基因編碼區(qū)讀碼框一致，則有可能形成有功能的抗性融合基因，從而啟動抗性基因的表達(dá)。最早由 Rachael 等在大腸桿菌中以四環(huán)素抗性基因作為報告基因構(gòu)建了啟動子探針質(zhì)粒 pBRH3B，并克隆了一些原核和真核啟動子片段。其后Donna等以氯霉素抗性基因作為報告基因，F(xiàn)odor 等以大腸桿菌LacZ 為報告基因，構(gòu)建了酵母啟動子探針質(zhì)粒并克隆了一些啟動子片段。構(gòu)建啟動子探針型載體，較為常見的檢測標(biāo)記基因有 - 半乳糖苷酶基因(lacZ) 、 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat) 、 四環(huán)素抗性基因(Tet') 和卡那霉素抗性基因(K

4、an') 。近年來，人們漸漸較多地使用潮霉素B 磷酸轉(zhuǎn)移酶(hph) 基因作為檢測標(biāo)記基因。李維等曾構(gòu)建了含有hph 抗性基因的啟動子探針型載體pSUPV8，直接在大腸桿菌中分離黃孢原毛平革菌基因的啟動子。先用Sau3AI 酶切黃孢原毛平革菌基因總DNA，再與用BamHI酶切后的pSUPV8相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用間接篩選法從氨芐青霉素和潮霉素抗性平板上篩選重組子，得到 6 個雙抗重組子(pCH1 pCH6)，電泳檢測插入片段分別命名為CHl CH6；再用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將重組子分別轉(zhuǎn)化黃孢原毛平革菌，對獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行復(fù)篩，僅pCH6的轉(zhuǎn)化平板上有穩(wěn)定生長的菌落，說明了CH6片段在黃孢原

5、毛平革菌中具有啟動基因表達(dá)的功能。該方法不需要知道具體基因的序列，可隨機(jī)篩選啟動子，避免了引物設(shè)計，能獲得大量的啟動子片段。1.2 利用PCR技術(shù)克隆啟動子即根據(jù)發(fā)表的基因序列，設(shè)計引物，克隆基因的啟動子，由于PCR法簡便快捷，近年來人們較多采用此方法克隆基因啟動子。蘇寧等根據(jù)已報道的水稻葉綠體16SrRNA啟動子基因序列設(shè)計5' 啟動子序列的引物，以水稻葉綠體DNA為模板，PCR擴(kuò)增出16SrRNA基因5' 啟動子區(qū)的片段，酶切克隆到pSK的 SacI 和 SphI 位點(diǎn)，構(gòu)建測序載體質(zhì)粒pZ16S，進(jìn)行序列測定，結(jié)果表明所克隆的片段長為 144bp，含有SD序列。同源比較結(jié)

6、果表明，所克隆的片段與水稻葉綠體16SrRNA啟動子序列具有100的同源性。上述的PCR方法簡便、快捷、操作簡單，是人們較為廣泛使用的技術(shù)。1.3 環(huán)狀 PCR環(huán)狀PCR包括I-PCR(Inverse-PCR) 和 P-PCR(Panhandle-PCR) 。這 2種 PCR都是根據(jù)一端已知序列設(shè)計的嵌套式引物進(jìn)行PCR。1.3.1 I-PCR I-PCR是 1988年由 Triglia 最早提出的一種基于PCR的改進(jìn)的染色體步行方法。I-PCR 的實(shí)驗(yàn)程序包括，基因組DNA經(jīng)酶切后用T4DNA連接酶進(jìn)行自連接，產(chǎn)生環(huán)狀DNA片段；以環(huán)化產(chǎn)物為底物，用根據(jù)已知片段設(shè)計的反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，

7、從而得到含有未知片段的擴(kuò)增產(chǎn)物 ( 流程如圖1 所示 ) 。韓志勇等以I-PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)克隆了轉(zhuǎn)基因水稻的外源基因旁側(cè)序列。先用小量法提取轉(zhuǎn)基因水稻的總DNA，總DNA用 10 倍過量的限制內(nèi)切酶進(jìn)行過夜酶切，酶切片段進(jìn)行自連接， 然后根據(jù)工程質(zhì)粒的T-DNA區(qū)設(shè)計2 對反向引物，進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增旁側(cè)序列。 建立了適合于處理大量材料的克隆轉(zhuǎn)基因水稻中外源基因旁側(cè)序列的技術(shù)體系。在 1 周內(nèi)克隆了35 個轉(zhuǎn)基因水稻株系中外源基因的旁側(cè)序列，長度在300 750bp 之間。 I-PCR 法快速、高效、穩(wěn)定，操作相對簡單，花費(fèi)少，PCR引物設(shè)計比較方便。1.3.2 P-PCRP-PCR 是由

8、Jones 等提出的利用末端反向重復(fù)序列與已知序列互補(bǔ)配對形成環(huán)狀單鏈模板，有效增強(qiáng)了引物與模板結(jié)合的特異性。反應(yīng)需要3 個根據(jù)已知序列設(shè)計的引物，3 個引物在已知序列內(nèi)呈線性排列，其中第 3 個引物可作為接頭使用，可與已知序列互補(bǔ)配對形成鍋柄狀單鏈模板。其過程為，首先酶切基因組DNA，產(chǎn)生5' 或 3' 粘末端，然后連接上合適的接頭(primer 3) ，連接好后最好用核酸外切酶I 除去多余的接頭，由于連接上的接頭與已知序列是反向重復(fù)序列，變性后的DNA單鏈可退火形成鍋柄狀單鏈模板，之后分別用3個單引物進(jìn)行3 次 PCR擴(kuò)增，能有效地擴(kuò)增2 9kbp 的大片段未知序列( 流程

9、如圖2 所示 ) 。黃君健等成功地應(yīng)用P-PCR技術(shù)從正常的人外周血單核細(xì)胞基因組DNA中擴(kuò)增端粒催化亞基hTERT基因5' 端上游旁側(cè)序列，獲得了hTERT基因翻譯啟始位點(diǎn)上游2090bp 的基因組DNA序列。首先用酶切消化基因組DNA，得到帶有GATC的 5' 突出端的DNA片段。然后利用已知的hTERTcDNA序列設(shè)計PCR引物，用常規(guī)的PCR方法擴(kuò)增出1 條大約 900bp 的基因組特異片段，序列分析為hTERT的基因組DNA片段。根據(jù)得到的基因組DNA序列的信息，確定P-PCR的引物退火區(qū)，并合成了5' 磷酸化的連接寡核苷酸和4 條基因特異性引物，其中連接寡核

10、苷酸5' 端的 4 個堿基CTAG與上述核酸內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的5' 突出端GATC互補(bǔ)，然后將連接寡核苷酸與基因組酶切產(chǎn)物連接，以連接產(chǎn)物為反應(yīng)模板，進(jìn)行PCR，使模板自身進(jìn)行退 火 - 延伸反應(yīng)，以形成Panhandle 結(jié)構(gòu)。最后以單鏈Panhandle 為模板，4 條基因特異序列為引物進(jìn)行嵌套式PCR， 最終獲得了1 條約 2kb 的含hTERT基因啟動子的DNA片段。Jones等利用改進(jìn)的P-PCR，在形成panhandle 結(jié)構(gòu)之前3' 末端連上ddCTP，使引物錯配的機(jī)率減少，特異性增加。他們從人類基因組DNA已知位點(diǎn)側(cè)翼擴(kuò)增了4 9kb 的大片段未知序列。P

11、-PCR是目前能夠擴(kuò)增距已知序列最遠(yuǎn)的未知DNA序列的方法，有很高的特異性。1.4 利用載體或接頭的染色體步行技術(shù)克隆基因啟動子這類方法的第一步都是酶切基因組DNA，連接載體或接頭，既可以用pUCl8 等質(zhì)粒載體， 也可以使用 DNA等噬菌體載體，只要選用的載體帶有合適的酶切位點(diǎn)；同樣根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要， 接頭既可以是雙鏈也可以是單鏈，然后根據(jù)基因組DNA序列設(shè)計的特異引物和載體的通用引物或接頭序列進(jìn)行擴(kuò)增。1.4.1 利用載體的PCRShyamala 等利用的單特異性引物PCR（SSP-PCR對以小鼠傷寒桿菌組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子為）起點(diǎn)進(jìn)行連續(xù)步行。以M13mpl8RF DNA為載體。用PstI 和

12、AraI 酶切基因組DNA， PstI 和XmaI 酶切載體DNA， 然后連接基因組片段和載體片段，用根據(jù)基因組DNA序列設(shè)計的特異引物和載體的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，由于非特異片段沒有單特異引物結(jié)合的位點(diǎn)，即使有載體連到非特異片段，也無法得到大量擴(kuò)增，而使特異片段得到有效擴(kuò)增。1.4.2 利用接頭的PCR王新國等利用銜接頭的方法，設(shè)計了位于單鏈DNA兩端互補(bǔ)的顛倒末端重復(fù)序列，增加了反應(yīng)的特異性，在胡蘿卜II 型轉(zhuǎn)化酶基因啟動子的克隆方面取得了新的進(jìn)展。首先將胡蘿卜基因組DNA分別用PvuI 、 SmaI、 DraI 、 EcoRV酶切，并設(shè)計了1 個銜接頭長鏈序列和1個銜接頭短鏈序列，并在銜接頭

13、短鏈的3' 末端帶有1 個氨基的銜接頭，能夠阻止聚合酶催化的銜接頭短鏈的延伸，同時銜接頭的長鏈和短鏈之間是反向重復(fù)序列。將酶切片段與此銜接頭連接，取連接產(chǎn)物做模板，以銜接頭引物和基因特異引物做PCR，在首輪PCR中只有限定的遠(yuǎn)端基因特異引物有結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)基因特異引物延伸產(chǎn)生的DNA鏈通過銜接頭時，才能產(chǎn)生銜接頭引物的結(jié)合位點(diǎn)，PCR才能以銜接頭引物和基因特異引物進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。而另一方面， 如果非特異合成產(chǎn)生了DNA兩端都有雙鏈銜接頭序列的PCR產(chǎn)物時，這種PCR產(chǎn)物在每次變性后，單鏈DNA末端的銜接頭反向重復(fù)序列將形成鍋柄結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)比引物-模板雜交更穩(wěn)定，能抑制非特異序列的指數(shù)增長。

14、最后得到主要的PCR產(chǎn)物為3.4kb 、 1.3kb 、 0.6kb和 0.4kb 。將 EcoR V-銜接頭體系的PCR產(chǎn)物克隆、測序、同源性比較，得到1 個新的胡蘿卜 II 型轉(zhuǎn)化酶基因啟動子序列，它含有類似于TATA box和 CAAT box的元件，在啟動子的遠(yuǎn)上游區(qū)域含多個AT富含區(qū)，該啟動子的發(fā)現(xiàn)對于研究植物中的糖代謝具有重要的意義。接頭引物的相對位置如圖3 所示。這種方法具有便于操作、實(shí)驗(yàn)線路簡單的優(yōu)點(diǎn)，但是特異性較差，產(chǎn)物需進(jìn)一步雜交驗(yàn)證。1.5 YADE法Prashar 等在擴(kuò)增cDNA3'端時采用“Y”形接頭，以減少接頭引物的單引物擴(kuò)增。其原理是接頭引物處于“Y”接

15、頭的2 個分叉單鏈上，序列與接頭一樣，只有與特異引物引導(dǎo)合成了接頭的互補(bǔ)序列后，接頭引物才能退火參與擴(kuò)增，流程如圖4。方衛(wèi)國等嘗試將YADE法引入到昆蟲病原真菌的分子生物學(xué)研究，并取得了成功，建立了適合于球孢白僵菌和金龜子綠僵菌YADE體系。在已克隆的類球孢白僵菌類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1的基礎(chǔ)上，利用YADE法，克隆到該基因的啟動子CDEPP。先酶切球孢白僵菌基因組DNA，然后與“Y”形接頭相連，取連接產(chǎn)物做模板，先以基因特異引物1 做線性擴(kuò)增，再以線性擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以接頭引物和基因特異引物2 做指數(shù)擴(kuò)增， 只有當(dāng)線性擴(kuò)增時合成了含有接頭引物的互補(bǔ)單鏈，接頭引物才能與其發(fā)生退火，參與

16、指數(shù)擴(kuò)增，從而有效防止了接頭引物的單引物擴(kuò)增。最后得PCR產(chǎn)物，進(jìn)行序列分析確定為 CDEP-1的上游啟動子序列。在應(yīng)用YADE法時，內(nèi)切酶的選擇至關(guān)重要。好的內(nèi)切酶產(chǎn)生適合PCR擴(kuò)增的片段，太大太小都不行。為了得到合適的內(nèi)切酶，需要從眾多的內(nèi)切酶中篩選。研究表明，不同的物種有自己合適的內(nèi)切酶。YADE法延伸的起始片段可以是基因組DNA片段，也可以是cDNA片段，在延伸cDNA片段時，設(shè)計的引物需要避開內(nèi)含子和外顯子的邊界，在內(nèi)含子的位置未知的情況下，可考慮多合成1 2 條特異引物，以提高擴(kuò)增未知片段的機(jī)率。該方法假陽性低、效率高，理論上能擴(kuò)出所有目的片段。很早就有用隨機(jī)引物的PCR， 但由于

17、無法有效地控制由隨機(jī)引物引發(fā)的非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，所以一直未能廣泛應(yīng)用。近年來由IJiu 等設(shè)計的TAIL-PCR(Termal AsymmetricInterlaced PCR) 又叫熱不對稱交錯PCR，則解決了這個問題，后來有研究表明，經(jīng)改良過的 TAIL-PCR成功地從突變體中克隆到外源插入基因的旁側(cè)序列，從而為啟動子的克隆提供了有效的新方法。在利用特異引物和隨機(jī)引物進(jìn)行PCR中一般有3 種產(chǎn)物生成：(1) 由特異性引物和簡并引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物；(2) 由同一特異性弓l 物擴(kuò)增出的產(chǎn)物；(3) 由同一簡并引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物。在 TAIL-PCR反應(yīng)中，其中后2 種目標(biāo)產(chǎn)物可以通過以嵌套的特異性

18、引物進(jìn)行的后續(xù)反應(yīng)來消除。TAIL-PCR的基本原理是利用目標(biāo)序列旁的已知序列設(shè)計3 個嵌套的特異性引物(specialprimer ，簡稱 sp1 ， sp2， sp3，約20bp) ，用它們分別和1 個具有低Tm值的短的隨機(jī)簡并引物(Arbitrarydegenerate prime ， AD，約14bp)相組合，以基因組DNA為模板根據(jù)引物的長短和特異性的差異設(shè)計不對稱的溫度循環(huán)，通過分級反應(yīng)來擴(kuò)增特異引物 ( 流程如圖5 所示 ) 。17TAIL-PCR共分 3 次反應(yīng)。第一次反應(yīng)包括5 次高特異性、1 次低特異、10 次較低特異性反應(yīng)和12 個熱不對稱的超級循環(huán)。5 次高特異性反應(yīng)，

19、使sp1 與已知的序列退火并延伸，增加了目標(biāo)序列的濃度；1 次低特異性的反應(yīng)使簡并引物結(jié)合到較多的目標(biāo)序列上；10次較低特異性反應(yīng)使2 種引物均與模板退火，隨后進(jìn)行12 次超級循環(huán)。經(jīng)上述反應(yīng)得到了不同濃度的3 種類型產(chǎn)物：特異性產(chǎn)物(I) 型和非特異性產(chǎn)物(型和型)。第二次反應(yīng)則將第一級反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋1000 倍作為模板，通過10 次熱不對稱使特異性產(chǎn)物被選擇地擴(kuò)增，而非特異產(chǎn)物含量極低。第三次反應(yīng)又將第二次反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋作模板，再設(shè)置普通的PCR反應(yīng)或熱不對稱超級循環(huán)，通過上述3 次 PCR反應(yīng)可獲得與已知序列鄰近的目標(biāo)序列。Gento 等曾用構(gòu)建的含有潮霉素抗性基因(hph) 的雙元表達(dá)

20、載體pBIG2RHPH2轉(zhuǎn)化真菌，然后利用TAIL-PCR法克隆得到的真菌轉(zhuǎn)化子基因組DNA的 T-DNA插入?yún)^(qū)的旁側(cè)序列并取得了成功。根據(jù)T-DNA區(qū)的HPH基因設(shè)計了擴(kuò)增右邊界的3 個引物HS1 HS3，以及擴(kuò)增左邊界的引物HAS2 HAS4， 另外又根據(jù)不同的轉(zhuǎn)化子分別設(shè)計了簡并引物ADl AD3(引物位置如圖 6 所示) 。在首輪PCR中，以 AD/HS1為引物擴(kuò)增右邊界(以 AD/HAS2擴(kuò)增左邊界)， 然后取首輪PCR產(chǎn)物為模板，以 AD/HS2(AD/HAS3)進(jìn)行二次PCR， 再以二次PCR產(chǎn)物為模板，AD/HS3(AD/HAS4)為模板進(jìn)行第三輪PCR，將3 輪的PCR產(chǎn)物進(jìn)

21、行電泳分析結(jié)果表明，采用TAIL-PCR的方法成功地從突變體中獲得了帶有T-DNA左右邊界的旁側(cè)序列，從而證明了TAIL-PCR法是有效地擴(kuò)增基因旁側(cè)序列的方法，為啟動子的克隆又增添了1 種可行的方法。TAIL-PCR不需要PCR前的任何DNA操作，避免了環(huán)化和連接，速度快，特異性強(qiáng)，效率高，靈敏，在分子生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。以上介紹的幾種方法基本代表了現(xiàn)有的啟動子克隆方法，它們分別具有不同的特點(diǎn)和適用范圍。利用啟動子探針載體篩選啟動子時，不需要知道具體的基因序列，避免了引物設(shè)計，并能獲得大量的啟動子片段；其缺點(diǎn)是需要構(gòu)建1 個穿梭質(zhì)粒，建庫、 轉(zhuǎn)化、 篩選， 工作量大，費(fèi)時費(fèi)力

22、，而且克隆、亞克隆的過程繁瑣。因此在基因的遺傳背景不是很清楚時，往往通過探針載體隨機(jī)篩選啟動子。而 PCR法的主要優(yōu)點(diǎn)是簡便、快捷、操作簡單；其缺點(diǎn)是只能擴(kuò)增兩端已知序列間的DNA區(qū)，且擴(kuò)增的特異性較低。其適用條件是建立在對基因序列十分清楚的基礎(chǔ)上，只有知道基因的全序列，才可根據(jù)已知序列設(shè)計引物, 擴(kuò)增出該基因的啟動子。因此，在基因序列清楚的情況下我們首先想到的就是PCR法。I-PCR 法操作簡單，克服了文庫篩選、克隆、 亞克隆的繁瑣步驟，對實(shí)驗(yàn)條件要求不高，花費(fèi)少，在PCR法的基礎(chǔ)上，增加了DNA的環(huán)化過程，從而可以擴(kuò)增只有一端序列已知的DNA，由于不需要設(shè)計和合成大量昂貴的核苷酸接頭，因此

23、避免了引物設(shè)計和有接頭而產(chǎn)生的非特異性產(chǎn)物的麻煩；然而由于直接克隆已知序列外的未知DNA區(qū)域依賴于DNA的環(huán)化性，而環(huán)化連接過程中常常產(chǎn)生多聯(lián)體，成為副產(chǎn)物甚至是主要產(chǎn)物，導(dǎo)致非特異擴(kuò)增，造成了閉環(huán)雙鏈的DNA的 PCR擴(kuò)增效率差，經(jīng)常得不到滿意的結(jié)果，同時酶切片段太長也會使擴(kuò)增效率下降。其適用于尋找只有一端序列已知的DNA,對未知DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。相對于 I-PCR， P-PCR經(jīng)過設(shè)計形成的是鍋柄狀單鏈DNA模板，從而有效增加了引物與模板結(jié)合的特異性，p-PCR能夠完成全部嵌套式擴(kuò)增，因而產(chǎn)物有非常高的特異性；其缺點(diǎn)是也存在DNA環(huán)化、連接的弊端，但與 I-PCR 相比， 其 PCR產(chǎn)物

24、的特異性已大大增加。目前，P-PCR可以擴(kuò)增位于已知位點(diǎn)側(cè)翼的大于3.0kb 的人基因組DNA的啟動子，是目前為止能擴(kuò)增距離已知序列最遠(yuǎn)的DNA序列的方法因而常用于擴(kuò)增大片段的未知序列。利用載體的PCR克隆啟動子有實(shí)驗(yàn)設(shè)計簡便的優(yōu)點(diǎn)，在基因組DNA中加入含合適酶切位點(diǎn)的載體，是基于PCR法的又一創(chuàng)新之處；然而其實(shí)驗(yàn)操作較為繁瑣，特異性差，即使用套式 PCR，仍然有幾條電泳條帶，因而特異性產(chǎn)物需雜交進(jìn)一步確定。利用接頭的PCR克隆啟動子的優(yōu)點(diǎn)是避免了DNA環(huán)化，改進(jìn)的接頭可以通過形成鍋柄結(jié)構(gòu)有效抑制非特異性序列的擴(kuò)增，但設(shè)計和合成大量的核苷酸接頭，價格昂貴；此外用常規(guī)的加接頭的方法來克隆啟動子時

25、往往有接頭非特異產(chǎn)物產(chǎn)生，特異性較低，特異產(chǎn)物需雜交確定。由于利用接頭的PCR法不需要DNA環(huán)化，通常適用于尋找已知cDNA周圍未知啟動子或其它調(diào)控區(qū)域。YADE法在利用接頭PCR時，巧妙地設(shè)計了“Y”型接頭，從而有效地防止接頭引物的單引物擴(kuò)增，延伸時起始片段可以是基因組DNA也可以是cDNA可用于復(fù)雜的基因組的PCR步行，能廣泛應(yīng)用于真核生物；其缺點(diǎn)是成本較高，在應(yīng)用YADE法時，為了得到合適的內(nèi)切酶， 需要從眾多的內(nèi)切酶中篩選，另外，特殊的接頭往往也增加了實(shí)驗(yàn)的成本。通常對于較復(fù)雜的真核生物基因組可以采用YADE法。目前理想的啟動子克隆方法需要更為廣泛的，不需要PCR前的酶切、環(huán)化等操作，且特異性較高的PCR技術(shù)，TAIL-PCR基本符合這一條件。TAIL-PCR法的有以下優(yōu)點(diǎn)：(1) 方法簡單，只要設(shè)計好引物，即可用基因組DNA為模板直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2) 特異性高，用簡并引物和特異性嵌套引物相組合，通過不對稱的溫度循環(huán)和分級反應(yīng)，使最終的目的片段占絕對優(yōu)勢；(3) 高效靈敏，使用任何一個AD引物，在6080的