微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告微生物形態(tài)觀察分布滅菌消毒

1、微生物實(shí)驗(yàn)微生物實(shí)驗(yàn)細(xì)菌形態(tài)觀察細(xì)菌分布消毒滅菌 細(xì)菌形態(tài)觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握光學(xué)顯微鏡（油鏡）的使用及日常維護(hù) 2. 掌握細(xì)菌的三種形態(tài)3. 掌握臨床常見(jiàn)細(xì)菌的形態(tài)及染色4. 掌握細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)5. 了解支原體、衣原體、立克次氏體、螺旋體及真菌的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 二、實(shí)驗(yàn)原理1. 普通光學(xué)顯微鏡（油鏡）的使用1. 在標(biāo)本欲檢部位滴一滴香柏油，然后轉(zhuǎn)換油鏡頭2. 從側(cè)面觀察并慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器，使油鏡頭浸沒(méi)在油滴內(nèi)，當(dāng)油鏡頭幾乎接觸玻片時(shí)停止轉(zhuǎn)動(dòng)，以免碰撞玻片，用雙眼觀察目鏡，同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)調(diào)節(jié)器，直至細(xì)菌清晰3. 根據(jù)需要調(diào)節(jié)顯微鏡亮度2. 普通光學(xué)顯微鏡的維護(hù)1. 移動(dòng)顯微鏡時(shí)，用右手持鏡壁，左手

2、托鏡座，平端于胸前2. 油鏡用畢后， 要立即用擦鏡紙擦去香柏油；再用滴有二甲苯的擦鏡紙擦油鏡頭；最后，用干凈擦鏡紙將鏡頭上的二甲苯擦去，以免損傷油鏡頭3. 鏡頭擦凈后，降低接物鏡并將其轉(zhuǎn)成八字形，罩好鏡罩放入柜內(nèi) 4. 做好使用記錄 3 微生物知識(shí)1 細(xì)菌按形態(tài)分類(lèi)：球菌：球形（包括雙球菌、四聯(lián)球菌、八疊球菌、葡萄球菌、鏈球菌等）桿菌：桿狀（包括單桿菌、雙桿菌、鏈桿菌、分枝桿菌、雙歧桿菌等）螺旋菌：螺旋狀（包括螺旋菌、弧菌等）2 細(xì)菌的基本結(jié)構(gòu) 細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)、核蛋白體3 細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu) 莢膜：如肺炎雙球菌 鞭毛：又分單毛菌、雙毛菌、叢毛菌、周毛菌。如：變形桿菌為周毛菌 菌毛 芽

3、胞：如破傷風(fēng)梭菌、炭疽芽胞桿菌、肉毒梭菌4 微生物是一切肉眼看不見(jiàn)或看不清的微小生物的總稱，包括原核類(lèi)、真核類(lèi)和非細(xì)胞類(lèi)。 原核類(lèi)：細(xì)菌、放線菌、藍(lán)藻、衣原體、支原體、立克次氏體 真核類(lèi)：真菌、原生動(dòng)物、顯微藻類(lèi) 非細(xì)胞類(lèi)：病毒、亞病毒5 真菌 單細(xì)胞：圓形、芽生孢子。如：酵母菌 多細(xì)胞：菌絲及孢子、孢子出芽。如：霉菌6 白假私酵母菌（白念） 生物學(xué)性狀：G+單細(xì)胞真菌、芽生孢子、類(lèi)酵母型菌落厚膜孢子、假菌絲有助于鑒定致病性：皮膚粘膜鵝口瘡、 內(nèi)臟感染、CNS感染微生物學(xué)檢查：直接涂片、染色后鏡檢菌體、芽生孢子、假菌絲7 新型隱球菌 生物學(xué)性狀 ：圓形酵母型菌、外周有厚莢膜（比菌體大1-3倍）

4、致病性：吸入后侵犯皮膚、粘膜等慢性炎癥和膿腫；侵襲CNS亞急性或慢性腦膜炎微生物學(xué)檢查：腦脊液離心后取沉淀、痰和膿標(biāo)本直接檢查；墨汁負(fù)染見(jiàn)出芽菌體外圍有寬厚莢膜為陽(yáng)性三、實(shí)驗(yàn)材料記號(hào)筆：1支；大鑷子：1支；火柴： 1盒；蠟筆：1支；試管架： 1個(gè)；酒精燈：1個(gè)；接種環(huán)： 1支；Olympus顯微鏡：1臺(tái)；顯微鏡使用記錄本：1個(gè)四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 觀察細(xì)菌三種形態(tài)1）球菌鏈球菌、葡萄球菌、肺炎雙球菌（子彈形）、腦膜炎雙球菌（蠶豆形）、四聯(lián)菌 2）桿菌破傷風(fēng)桿菌、白喉?xiàng)U菌（異染顆粒）、綠膿桿菌、傷寒桿菌、變形桿菌 3）螺形菌弧菌霍亂弧菌；螺菌；螺桿菌幽門(mén)螺桿菌；彎曲菌 2. 觀察細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)芽胞、

5、鞭毛、莢膜、異染顆粒、鉤端螺旋體、幽門(mén)螺桿菌3. 繪圖葡萄球菌(staphyloccocus)；肺炎雙球菌(pneumo coccus)；腦膜炎球菌(meningococcus)；破傷風(fēng)桿菌（Clostridium Tantenus）；霍亂弧菌（vibrio cholera)；芽胞(spore)；鞭毛（flagellum)；莢膜(capsule)；鉤端螺旋體(leptospira)五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪8幅細(xì)菌鏡下圖，已交。六、思考與討論1 顯微鏡高倍鏡使用時(shí)看不清楚的常見(jiàn)原因（1） 未滴加鏡油（2） 鏡頭不干凈（3） 標(biāo)本放置反了，所以達(dá)不到對(duì)焦平面（4） 制片問(wèn)題：標(biāo)本太厚、染色誤差等 細(xì)菌分布一

6、、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握固體培養(yǎng)基的制備2. 掌握機(jī)體常見(jiàn)部位及環(huán)境中的細(xì)菌采樣、培養(yǎng)、及初步鑒定 3. 掌握革蘭氏染色方法及結(jié)果判定 二、實(shí)驗(yàn)原理1. 培養(yǎng)基：1 細(xì)菌生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：水、碳源、氮源、無(wú)機(jī)物和生長(zhǎng)因子2 培養(yǎng)基分類(lèi)：（1）根據(jù)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基（2）根據(jù)物理性質(zhì)：液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基3 細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況：表面生長(zhǎng)、均勻渾濁生長(zhǎng)、沉淀生長(zhǎng)2. 革蘭氏染色：革蘭陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖(peptidoglycan)層較厚，經(jīng)乙醇處理后使之發(fā)生脫水作用而使孔徑縮小，通道彎曲，結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物保留在細(xì)胞內(nèi)而不被脫色；而革蘭陰性細(xì)菌的肽聚

7、糖層很薄，脂肪含量高，經(jīng)乙醇處理后孔徑仍可使結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物通過(guò)，因而將染料洗去而被脫色。三、實(shí)驗(yàn)材料咽拭子、羊血培養(yǎng)皿：1套/人；大號(hào)普通培養(yǎng)皿：1塊/2人；載玻片：1片/人； A、B菌：6套/桌；NS：1份/人；濾紙：1張/人；消毒液：4套/桌；三角瓶、電天平、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、稱藥紙、稱藥勺、量筒：1套/桌四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 培養(yǎng)基制備1）按產(chǎn)品要求稱取營(yíng)養(yǎng)瓊脂2）每實(shí)驗(yàn)桌制備200ml3）高壓蒸汽滅菌后，在潔凈工作臺(tái)內(nèi)倒平皿4）所制備的普通平皿用于空氣培養(yǎng)2. 機(jī)體不同部位的細(xì)菌采樣、培養(yǎng)1）咽部正常菌群的采樣、培養(yǎng)咽拭子擦拭咽部，平行劃線法接種于羊血平皿。2）手指消毒前后細(xì)菌的采樣培養(yǎng)未消毒

8、手指平行劃線法接種于普通平皿；同一手指碘酒、酒精消毒后平行劃線法接種于普通平皿。3. 環(huán)境中細(xì)菌采樣培養(yǎng)1）空氣培養(yǎng)將培養(yǎng)皿打開(kāi)暴露于空氣中，20分鐘后蓋好平皿蓋兒2）流通紙幣（或硬幣）的細(xì)菌采樣培養(yǎng)將硬幣正反面分別在培養(yǎng)基上充分接觸 3）采樣結(jié)束后，將培養(yǎng)皿底部朝上放入鐵絲筐，統(tǒng)一置培養(yǎng)箱：37 18-24小時(shí) 4. A、B、C菌鑒定（革蘭氏染色法）1）. 細(xì)菌涂片制備程序：（1）取一干凈玻片，火焰上方緩緩?fù)ㄟ^(guò)三次去油（2）蠟筆畫(huà)線將玻片分割為A、B、C三區(qū)域（3）接種環(huán)取生理鹽水分別滴入A、B兩區(qū)域各一滴（4）分別取少許A、B 、C菌 ，與生理鹽水充分混勻成菌液，風(fēng)干后形成菌膜（5）固定（

9、火焰上方緩緩?fù)ㄟ^(guò)三次）（6）革蘭氏染色（7）濾紙吸干水分，油鏡觀察 2）. 革蘭氏染色：（1）細(xì)菌涂片、火焰固定（2）結(jié)晶紫初染 1min（3）盧戈氏碘液媒染 1min（4）95%乙醇脫色 30-40s （5）沙黃復(fù)染 1min五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果A：G+，球菌，推測(cè)為金黃色葡萄球菌；B：G-，短桿菌，推測(cè)為大腸桿菌；六、思考與討論1 影響革蘭氏染色的因素：（1）細(xì)菌本身因素： 菌齡：如果菌齡太大，可能出現(xiàn)假陰性（2）操作因素 涂片：取菌應(yīng)適量，涂片要均勻，如果某個(gè)部分菌層太厚，可能在脫色時(shí)達(dá)不到，會(huì)導(dǎo)致局部假陽(yáng)性 固定：固定溫度太高或時(shí)間太長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌結(jié)構(gòu)破壞而出現(xiàn)假陰性；但是固定不夠，細(xì)菌會(huì)在水

10、洗時(shí)被沖掉 初染：初染時(shí)間雖然說(shuō)是1分鐘，但是可以適當(dāng)延長(zhǎng)，時(shí)間太短會(huì)出現(xiàn)假陰性；染色滴加不均勻可能出現(xiàn)半陰半陽(yáng) 媒染：和初染一樣 脫色：脫色時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，基本上用酒精滴過(guò)之后馬上水沖就可以了，否則容易出現(xiàn)假陰性 復(fù)染：復(fù)染時(shí)間需足夠長(zhǎng)，否則可能會(huì)染不上 消毒滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解實(shí)驗(yàn)室常用消毒滅菌方法及其原理2. 掌握實(shí)驗(yàn)中所用儀器的使用方法 3. 掌握機(jī)體常見(jiàn)部位及環(huán)境中的細(xì)菌培養(yǎng)物的初步鑒定 4. 強(qiáng)化革蘭氏染色技能 二、實(shí)驗(yàn)原理1 口咽部及皮膚正常菌群鼻咽部及扁桃體：葡萄球菌、類(lèi)白喉?xiàng)U菌、肺鏈、溶血及非溶血性鏈球菌、奈瑟菌等口腔：鏈球菌多見(jiàn)、放線菌、螺旋體、G-桿菌等皮膚：表皮葡萄

11、球菌、丙酸桿菌、類(lèi)白喉?xiàng)U菌、銅綠假單胞菌2溶血類(lèi)型溶血：現(xiàn)象：草綠色溶血環(huán)常見(jiàn)菌種：機(jī)會(huì)致病菌（甲鏈、肺鏈 ）原理：細(xì)菌產(chǎn)生過(guò)氧化氫將血紅蛋白氧化成深綠色的高鐵血紅蛋白溶血：現(xiàn)象：透明溶血環(huán)常見(jiàn)菌種：致病菌（乙鏈 )原理：細(xì)菌釋放溶血素使紅細(xì)胞破裂，血紅蛋白釋放三、實(shí)驗(yàn)材料咽拭子培養(yǎng)物：1套/人；空氣、紙幣、手指消毒前后培養(yǎng)物：1套/2；載玻片： 1片/人；NS：1支/人；濾紙：1張/人四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 常用消毒滅菌方法：（示教講解）1）熱力滅菌： （1）干熱滅菌法：焚化、燒灼、干烤（160 ，2小時(shí)）（2）濕熱滅菌法：煮沸（2%Na2CO3，105 ）；高壓蒸汽滅菌（103.4kPa，20分

12、鐘，121，臨床運(yùn)用最廣的滅菌方法）2）. 紫外線（Ultraviolet radiation)：波長(zhǎng)265nm-266nm(DNA吸收光譜）殺菌能力最強(qiáng)。紫外光穿透力差，一般只用于不耐熱物品表面的消毒。3）. 過(guò)濾(filtration)用物理阻流的方法除去液體或空氣中的細(xì)菌，用于不耐熱物質(zhì)的滅菌（血清、毒素、抗生素等）濾菌器：薄膜濾菌器、玻璃濾菌器、石棉濾菌器、素陶瓷濾菌器4）. 低溫保存菌種（冷凍真空干燥法）5）常用的化學(xué)消毒劑類(lèi)別作用機(jī)制常用種類(lèi)酚類(lèi)蛋白變性，細(xì)胞膜損傷洗必泰醇類(lèi)去除脂類(lèi)，蛋白變性乙醇鹵素蛋白變性氯氣、碘酊 、碘伏重金屬鹽蛋白變性紅汞、硫柳汞、硝酸銀醛類(lèi)蛋白變性福爾馬林

13、、戊二醛表面活性劑蛋白變性，細(xì)胞膜損傷新潔而滅酸堿類(lèi)破壞細(xì)胞膜、細(xì)胞壁，蛋白變性十一烯酸染料干擾氧化、抑制繁殖龍膽紫6）實(shí)驗(yàn)室常用化學(xué)消毒劑：70-75%乙醇潔凈臺(tái)消毒：來(lái)蘇水擦拭 防腐劑：三氯甲烷、硫柳汞、疊氮鈉2 細(xì)菌分布結(jié)果鑒定1）觀察菌落2）取部分菌落的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色并觀察五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. 咽部正常菌群的采樣、培養(yǎng)結(jié)果：在羊血培養(yǎng)皿上出現(xiàn)四種菌落：（1） 數(shù)目多，劃線沿線都有；針尖大小；無(wú)色、光滑、濕潤(rùn)、透明、圓形。周?chē)霈F(xiàn)草綠色溶血環(huán)，發(fā)生了不完全溶血即溶血。（2） 數(shù)目較多，劃線沿線都有；較?。蝗榘咨?、光滑、濕潤(rùn)、半透明、圓形。（3） 少，只出現(xiàn)在四個(gè)點(diǎn)；中型；乳黃色、光滑、半

14、濕潤(rùn)、不透明、形狀不規(guī)則。在此種菌落下方的培養(yǎng)基出現(xiàn)了透明溶血環(huán)，發(fā)生了完全溶血即溶血。（4） 1個(gè)菌落；較大；乳白色、光滑、濕潤(rùn)、半透明、圓形。粘稠。?。?）、（2）、（3）進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果如下;（1） G+，鏈球菌，根據(jù)不完全溶血推斷，為甲型鏈球菌。（2） G-，球菌，細(xì)胞個(gè)體小，形狀像金黃色葡萄球菌，但是染色為陰性。（3） G-，球菌。2. 手指消毒前后細(xì)菌的采樣培養(yǎng)結(jié)果：1）消毒前：僅出現(xiàn)2個(gè)菌落，較?。蝗榘咨⒐饣?、濕潤(rùn)、有光澤、圓形。革蘭氏染色結(jié)果：G-，桿菌2）消毒后：無(wú)菌落出現(xiàn)。3. 硬幣正反面的細(xì)菌采樣培養(yǎng)結(jié)果：1）正面三種菌落：（1）13個(gè)菌落；較小；乳白色、光滑、濕潤(rùn)

15、、有光澤、圓形。和手指消毒前的菌落一樣。（2）1個(gè)菌落；較大；白色、光滑、濕潤(rùn)、近似圓形。（3）5個(gè)菌落；較大；中央乳黃色邊緣顏色變淺、光滑、濕潤(rùn)、中間凸、不規(guī)則、邊緣光滑取其中（2）、（3）進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果如下：（2）G-，桿菌。和手指消毒前的細(xì)菌一樣（3）G-，鏈桿菌。形態(tài)較大，形狀像炭疽芽胞桿菌，但是沒(méi)有芽孢且染色為陰性。2）反面兩種菌落：（1）2個(gè)；較大，乳白色、光滑、濕潤(rùn)、有光澤、圓形。（2）多個(gè)，沿硬幣邊緣線連成一片；針尖大小、無(wú)色、光滑、濕潤(rùn)、透明。4. 空氣培養(yǎng)結(jié)果平皿敞開(kāi)在實(shí)驗(yàn)室的窗臺(tái)上放置了約20分鐘，當(dāng)時(shí)陽(yáng)光照在上面：平皿出現(xiàn)了五種菌落：（1）11個(gè)；中等大??；白色、

16、光滑、濕潤(rùn)、半透明、圓形（2）2個(gè)；較大；周?chē)咨虚g有一個(gè)透明圈，光滑、濕潤(rùn)、中間凹的圓餅狀（3）1個(gè)；較大；周?chē)S色，中間有一個(gè)透明的圓形區(qū)域，半濕潤(rùn)、沒(méi)有光澤（4）1個(gè)；較大；邊緣橘黃色，中央偏白、明顯凸起、干燥、形狀不規(guī)則（5）1個(gè)；較大；邊緣透明，中央乳黃色，光滑、濕潤(rùn)、半透明、圓形取其中（3）、（4）進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果如下：（3）G-，桿菌。和手指消毒前、硬幣正面菌落（2）的細(xì)菌一樣（4）出現(xiàn)三種細(xì)菌：G-，雙球菌G+，雙球菌G-，梭菌5 八個(gè)取樣染色結(jié)果取樣細(xì)菌來(lái)源染色結(jié)果細(xì)菌形態(tài)1咽部G+鏈球菌2咽部G-球菌3咽部G-球菌4手指（消毒前）G-桿菌5硬幣正面G-桿菌6硬幣正面

17、G-鏈桿菌7空氣（實(shí)驗(yàn)室窗臺(tái)）G-桿菌8空氣（實(shí)驗(yàn)室窗臺(tái)）G-雙球菌G+雙球菌G-梭菌六、思考與討論1 巴氏消毒法的利用巴氏消毒法是一種低溫消毒法，包括：低溫維持法：62.8攝氏度維持30分鐘；高溫瞬時(shí)法：71.3攝氏度作用15-30秒。該法適用于食品的消毒?，F(xiàn)主要應(yīng)用于乳制品。2 為什么濕熱消毒法的溫度比干熱消毒法低？課堂上講到的干熱消毒法溫度都比濕熱消毒法要高，說(shuō)明濕熱滅菌法可在較低的溫度下達(dá)到的滅菌效果可以與干熱法相同，分析原因如下：（1） 濕熱中蛋白吸收水份，更易凝固變性；（2） 水分子的穿透力比空氣大，更易均勻傳遞熱能，在干熱狀態(tài)下，由于熱穿透力較差，微生物的耐熱性較強(qiáng)，必須長(zhǎng)時(shí)間受高溫的作用才能達(dá)到滅菌的目的（3） 蒸汽潛熱大，每1克水由氣態(tài)變成液態(tài)可釋放出529卡熱能，可迅速提高物體的溫度。3 細(xì)菌分布試驗(yàn)結(jié)果討論咽部正常菌群主要為：溶血和非溶血性鏈球菌、球菌等，不同人由于個(gè)體差異和取樣部位差異，所得菌種也有所不同手的消毒是有效的，消毒后細(xì)菌明顯減少了。同時(shí)手上的菌是很多的，所以需要常洗手。手上較常見(jiàn)的是四聯(lián)球菌。硬幣上的菌也相對(duì)較多，因?yàn)樗?jīng)歷的環(huán)境很多。在咽部、硬幣和未消毒的手上