腸缺血再灌注大鼠肺損傷時(shí)NOS及肺泡巨噬細(xì)胞分泌NO的變化

1、    腸缺血再灌注大鼠肺損傷時(shí)NOS及肺泡巨噬細(xì)胞分泌NO的變化        摘要本實(shí)驗(yàn)通過對大鼠腸缺血再灌注后巨噬細(xì)胞活化分泌NO及肺組織內(nèi)NOS的變化進(jìn)行觀察，顯示腸缺血再灌注組肺泡巨噬細(xì)胞分泌NO的水平及肺內(nèi)NOS的水平均顯著高于假手術(shù)對照組，表明腸缺血再灌注后肺內(nèi)巨噬細(xì)胞的iNOS被激活，大量合成并釋放NO，其作用一方面可增強(qiáng)殺菌功能，另一方面導(dǎo)致肺組織損傷。關(guān)鍵詞缺血再灌注，一氧化氮，一氧化氮合酶，肺泡巨噬細(xì)胞The Change of NOS Activity

2、 in Lung Tissue and no Secreted by Alveolar Phagocyte after the Inchemia-reperfusions in Rats small IntestineZhang Shilin， Yu Keli，Bi ping（Biology department，Tianjin Normal university）（Tianjin Friditional Chinese Medicinal Reserch Institute)AbstractThis study was to evaluate the level of nitric oxid

3、e （NO）of secreted by alveolar macrophage and the activity of nitric oxide synthase （NOS）in lung tissue after the ischemia-reperfusions in rat small intestine.The results showed that，comparing with the control group，the level of NO and activity of NOS were obviously enhanced in mould group.It is sugg

4、ested that，after the ischemia-reperfusions in rats small intestine，the induced nitric oxide synthase（iNOS）were activated in alveolar macrophage，plenty of NO were synthesized and released，which can sause bactericidal power enhance and the lung tissue damages.Key wordsIschemia-reperfusions，Nitric oxid

5、e，Nitric oxide synthase， Alveolar macrophage休克后常會(huì)引起多器官衰竭（MOF），其中肺是最早受損的靶器官之一。有研究表明，腸道缺血和再灌注能造成全身自由基損傷、炎癥細(xì)胞的活化、腸粘膜PLA2過度活化以及腸粘膜屏障衰竭與腸源性感染，因此推斷腸道可能是創(chuàng)傷休克后MOF的始動(dòng)器官1。本實(shí)驗(yàn)對大鼠腸缺血再灌注后巨噬細(xì)胞活化分泌一氧化氮（NO）及肺組織內(nèi)一氧化氮合酶（NOS）的變化進(jìn)行了觀察，并對NO在肺損傷過程中的作用進(jìn)行了探討。1材料與方法1.1試劑NO和NOS測定試劑盒為北京邦定生物公司產(chǎn)品；MRPI-1640培基（簡稱1640）為Gibco公司產(chǎn)品，胎

6、牛血清（NCS）為中國科學(xué)院血液病研究所產(chǎn)品。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組健康Wistar大鼠（購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）52只，體重250g270g，雌雄各半，隨機(jī)分成對照組（24例）和模型組（28例）。1.3動(dòng)物處理方法模型組大鼠動(dòng)物在禁食不禁水12 h后，用1戊巴比妥鹽經(jīng)腹腔注射麻醉（3mlkg1），無菌條件下進(jìn)入腹腔。用動(dòng)脈夾夾閉腸系膜上動(dòng)脈根部45 min后松夾，縫合腹壁，于再灌注后6 h取材。假手術(shù)對照組大鼠只鈍性分離腸系膜上動(dòng)脈根部周圍組織，不做其它處理。1.4大鼠肺巨噬細(xì)胞的分離與培養(yǎng)4的水合氯醛（7.5 mgkg-1）經(jīng)腹腔注射麻醉，于胸骨柄上緣用套管針穿刺至支氣管分叉水平。用

7、生理鹽水4 ml，注入肺臟后，輕輕按摩胸部，回抽沖洗液，如此反復(fù)沖洗4次。沖洗液每分鐘1700 轉(zhuǎn)離心10 min，棄掉上清液，用Hanks液反復(fù)洗滌3次。甲紫和瑞氏染色證實(shí)為巨噬細(xì)胞，純度90，臺盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活率為95。將上述細(xì)胞懸液離心棄上清，將沉淀的細(xì)胞用適量的1640培基混勻后置37、5CO2孵箱內(nèi)12 h，棄掉非貼壁細(xì)胞即可獲得高純度的大鼠肺巨噬細(xì)胞。調(diào)細(xì)胞至1×106/ml，分別加入24孔板內(nèi)，置37，5CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)上清液，存放于20待測。1.5觀察指標(biāo)1.5.1一氧化氮（NO）測定：取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，應(yīng)用Griess法2參照試劑盒說明書進(jìn)行NO

8、2測定，以NO2代表NO的變化，結(jié)果以M表示。1.5.2肺組織內(nèi)一氧化氮合酶（NOS）活性測定：取各組動(dòng)物肺組織，加入40 mM，pH7.2的磷酸鉀緩沖液10（WV），勻漿器勻漿，每分鐘10000轉(zhuǎn)離心20min，取上清。應(yīng)用分光光度法3參照試劑盒說明書進(jìn)行測定，結(jié)果以每克組織每分鐘產(chǎn)生NO的量來表示，即molmin1每克組織。1.5.3左心室抽抗凝血，測PaO2和PaCO2。1.5.4斷頭放血，取肺稱重，計(jì)算肺系數(shù)（肺重量/體重×100）。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用計(jì)算機(jī)SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包對所得結(jié)果進(jìn)行方差分析。2結(jié)果2.1模型組肺泡巨噬細(xì)胞分泌NO的水平（3.60±0.15）

9、顯著高于假手術(shù)對照組（P0.001），模型組肺內(nèi)NOS的水平（2.01±0.13）顯著高于假手術(shù)對照組（P0.05），（見表1）。表1各組動(dòng)物肺內(nèi)NOS及肺泡巨噬細(xì)胞分泌NO的變化情況（±S）組別NOS（molming）NO2（M）PaO2PaCO2肺系數(shù)對照組0.32±0.071.15±0.1112.19±0.294.02±0.150.65±0.07造模組2.01±0.13b3.60±0.15a9.10±0.35b4.64±0.22b0.97±0.10bVS 對照組a-P0

10、.001b-P0.05 2.2模型組動(dòng)脈血PaO2值明顯低于對照組，而PaCO2值均高于對照組。模型組肺系數(shù)0.97±0.10，高于對照組的0.65±0.07（P0.05）。（見表1）。3討論NO是一氧化氮合酶（NOS）在NHDPH、FAD和四氫化物蝶呤等輔助因子的作用下，以精氨酸（L-Arg）為底物，使其N端胍基脫氨氧化，生成的氮氧化物，是一種簡單的自由基性的氣體，溶于水（20及1個(gè)大氣壓下，高達(dá)2 mmolL-1）和脂質(zhì)中，故可自由地彌散于細(xì)胞外，發(fā)揮其活性作用，而不存留于其形成部位4，5。NO的生理效應(yīng)眾多，包括調(diào)節(jié)血管張力和血壓，抑制血小板和白細(xì)胞聚集粘附的作用，抑

11、制血管平滑肌細(xì)胞增殖，神經(jīng)細(xì)胞間的信息傳遞，調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附分子的表達(dá)以及參與機(jī)體防御機(jī)能6，7。近年的研究揭示巨噬細(xì)胞對多種病源體和腫瘤細(xì)胞的殺傷是通過NO完成的。巨噬細(xì)胞中含有誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS），激活（IFN-，TNF-等）后可合成大量NO。近年研究已證實(shí)NO具有明顯毒性作用8，9，其機(jī)制包括：（1）NO作用于Fe蛋白，影響細(xì)胞呼吸及能量代謝；使ADP核糖化；抑制DNA合成。（2）NO與的反應(yīng)生成ONOO和OH。其中OH作為氧自由基中一種極強(qiáng)的細(xì)胞毒，是機(jī)體細(xì)胞損傷的重要途徑；ONOO是一種強(qiáng)氧化劑，可迅速細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，并抑制上皮細(xì)胞離了通道，這與急性感染時(shí)肺內(nèi)液體及其平衡紊亂

12、有關(guān)。肺泡巨噬細(xì)胞為經(jīng)管壁溢出之游離單核細(xì)胞定植于肺泡腔內(nèi)所形成，生理狀況下承擔(dān)免疫監(jiān)視、抗原呈遞及吞噬入侵的病原微生物和灰塵等作用。腸缺血再灌注后可引起腸道細(xì)菌內(nèi)毒素的移位，已經(jīng)證實(shí)血中內(nèi)毒素水平異常升高，使巨噬細(xì)胞活化并釋放多種致?lián)p介質(zhì)，介導(dǎo)組織損傷過程的發(fā)生10。我們發(fā)現(xiàn)，腸缺血再灌注組大鼠肺泡巨噬分泌NO的水平顯著高于假手術(shù)對照組，同時(shí)腸缺血再灌注組大鼠肺內(nèi)NOS明顯高于假手術(shù)對照組?？梢姡藭r(shí)定居于肺內(nèi)的巨噬細(xì)胞內(nèi)的iNOS被IFN-、TNF-及LPS等激活，大量合成并釋放NO，一方面可增強(qiáng)殺菌功能，另一方面導(dǎo)致肺組織損傷。張世林（天津中醫(yī)研究所300193）宇克莉（天津師范大學(xué)生物

13、系300193）畢平（天津師范大學(xué)生物系300193）參考文獻(xiàn)1胡森：創(chuàng)傷后多系統(tǒng)器官衰竭（MSOF）動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究中華整形燒傷外科雜志1992；8（1）：22Ding AH，et al：Release of reactive nitrogen intermediates and reactive oxygen intermediates from mouse peritoneal macrophages.J Immunol1988；141：24073Knowles RG，et al：Anti-inflammatory glucocorticoids inhibit the inducti

14、on by endotoxin of nitric oxide synthaso in the lung liver and aorta of the rat.Biochem Biophys Res Commun 1990；172（3）：10424Barnes PJ，et al：Nitric oxide and lung disease.Thorax 1993；48：1034.5Moncada S：The L-arginine-nitric oxide pathway.The New Engl J Med 1993；329：20026Anggard E.：Nitric oxide：mediator，murdereer，and medicine.Lancet 1994；343：11997Gaston B，et al：The bilogy of nitrogen oxides in the airways.Am J Respir crit care Med 1994；149：5388Freeman B.Free radical chemistry of nitric oxide.Chest 1994；1