肝細胞移植的臨床應用

1、肝細胞移植的臨床應用         【摘要】  50多年前Sorrentino第一次用機械的方法把新鮮肝組織制成勻漿，并在體外進行藥物實驗，開創(chuàng)了肝臟功能的體外人工支持時代。Berry和Friend 等在1969年用自己配置成的消化液進行大鼠肝灌注第一次完整分離肝細胞。幾十年來，肝細胞的分離培養(yǎng)及保存技術不斷優(yōu)化并為相關的肝臟研究和肝臟疾病的治療提供了極為寶貴的途徑。尤其是近年來肝細胞移植的實驗和臨床應用不斷取得進展，為肝臟疾病的治療展現了誘人的前景。優(yōu)化和完善肝細胞的分離，培養(yǎng)和保存，仍然是關系到肝細

2、胞移植效果的前提。近年來，不少的研究者正致力于臨床的應用研究。根據所收集到的文獻報道，世界各大醫(yī)學中心目前已有近80例肝細胞移植的臨床應用，其結果令人鼓舞?？梢灶A測，肝細胞移植作為整體器官移植的“橋梁”或替代治療，將給眾多肝病患者帶來福音。本文就近年來肝細胞移植的臨床應用研究進展作一綜述。 【關鍵詞】  肝細胞 分離 細胞培養(yǎng) 移植 臨床應用   肝臟是機體最重要的器官之一，在生理和病理狀態(tài)下，它是能量代謝、解毒以及血漿蛋白合成的中心。當發(fā)生急性肝功能衰竭時，只有15%25%的病人得以生存1。許多慢性肝臟疾病如肝硬化、肝癌等也最終導致肝臟功能的衰竭。長期以來，國內

3、外學者注重于肝器官移植的研究, 因為肝移植療效顯著，1年存活率可達70%以上。但肝移植對技術條件、適應證及組織相容性等要求較高, 加之肝供體的短缺，使肝移植的臨床應用嚴重受限。因此，臨床上急需其他方法，作為“橋梁”來緩解和改善肝功能，延長患者的生存時間，而等待肝移植，甚至取代肝移植。由此，肝細胞移植及生物人工肝的研究成為熱點2,3。不管是肝細胞移植或生物人工肝，肝細胞的分離、培養(yǎng)和保存是肝細胞臨床應用的基石。就肝細胞分離培養(yǎng)和保存尤其是肝細胞移植的臨床應用研究進展現綜述如下。   1  肝細胞分離培養(yǎng)與保存   1.1  肝細胞的來源

4、   11.1  人肝細胞  人類肝臟細胞是最好的供體，因為肝臟細胞分化較高，有較好的合成和代謝功能4 ，因此肝細胞移植首選人肝細胞。但由于供體的嚴重短缺，目前用于肝細胞移植的供體多為不適于肝移植供體（untransplantable liver），如脂肪肝、纖維化肝、受外傷肝等，這些細胞體外培養(yǎng)增殖困難，肝細胞功能效果不理想。胎肝細胞（fetal liver cell，FLC）在體外可以擴增，在刺激下可分化，免疫原性弱。取自妊娠26周和34周引產的胎肝細胞, 檢測其活性為95%, 代謝能力為成人的75%5 。但其來源也很受限，且存在倫理問題。 

5、;  11.2  動物肝細胞  為解決供體缺乏的問題，多年來研究者正致力于異種肝細胞移植的研究。動物肝細胞來源廣泛，分離簡便，效果可靠，Donato等6測定了人肝細胞、豬肝細胞、犬肝細胞、兔肝細胞、鼠肝細胞等釓細胞中細胞色素P450的含量及代謝能力，豬肝細胞和人肝細胞的代謝功能最接近。然而異種移植用于臨床仍有許多問題待解決。其一，豬肝細胞的內源性逆轉錄病毒感染受體，其安全性須進一步研究。其二，動物肝細胞不可能替代人類血漿蛋白合成酶活性，并存在有種間的特異性差異,并且異基因蛋白和酶進入到血循環(huán)中也能產生副作用7；為避免這種差異反應，病人血液和動物肝細胞之間必須有安全

6、屏障,即半透膜的存在。故目前動物肝細胞多作為生物人工肝的生物成分而起作用8。   11.3  肝干細胞  1958年Wilson和Leduc9提出肝干細胞的概念。近年來，研究發(fā)現肝干細胞移植對急慢性肝臟疾病有一定的治療作用，使之成為肝臟領域的研究熱點10 。根據肝臟干細胞起源的不同，可將其分為肝源性肝臟干細胞和非肝源性肝臟干細胞，前者包括卵圓細胞、分化的肝細胞、胚胎肝細胞和膽管上皮細胞，后者則為源于胚胎干細胞、骨髓造血干細胞及胰腺上皮干細胞等不同來源的肝臟干細胞。在特定條件下，造血干細胞和骨髓間充質細胞均可轉化成肝細胞。   動物實驗

7、證實, 肝干細胞在急性肝損傷時參與了肝臟肝細胞的再生和修復，并發(fā)揮了至關重要的作用，這樣使肝干細胞移植用于臨床治療急性肝衰竭及肝代謝性疾病成為可能11。但肝干細胞用于臨床還有許多問題待解決，諸如肝干細胞在體外的鑒別、分離、培養(yǎng)及篩選，干細胞的多向分化潛能及可塑性這一生物學現象的發(fā)生和調控機制仍不清楚，干細胞移植的數量，移植后在體內的歸巢及定位等。相信隨著研究的深入，肝干細胞希望能代替肝細胞的作用并應用于臨床治療。   1.2  肝細胞的分離和培養(yǎng)   1.2.1  肝細胞的分離  1969年，Berry和Friend 等人用

8、無鈣的平衡鹽、膠原酶和透明質酸酶配置成的消化液進行大鼠肝灌注，獲得到肝細胞。之后，Seglen 創(chuàng)立了兩步灌流法，即首先灌注預熱的無鈣的平衡鹽溶液去除肝血竇內的血細胞及部分非實質細胞，然后再灌注含有膠原酶的平衡鹽溶液，進行體外消化后，分離提純而獲得肝細胞。目前，國內外動物和人類肝細胞的分離方法都是在此基礎上改良的。   1.2.2  肝細胞的培養(yǎng)   肝細胞屬高度分化類上皮細胞，對生存環(huán)境有著極高的要求，如培養(yǎng)液的溫度、pH值、滲透壓、CO2含量、促肝細胞生長物質及血清濃度等，是影響肝細胞活性的重要因素；肝細胞與基質、肝細胞與非實質細胞的接觸對

9、肝細胞的生長和活性也起著極為重要的作用13。肝細胞的培養(yǎng)須考慮到這些方面的問題。   隨著臨床肝細胞移植及生物人工肝技術的研究和應用，需對肝細胞進行大量培養(yǎng)。在培養(yǎng)的容器中加入細胞外基質或載體，以盡可能模擬肝細胞生長的三維環(huán)境，對維持細胞形態(tài)、功能和活性有著重要作用。目前培養(yǎng)的方法主要有：（1）單層膠培養(yǎng)（monolay）；（2）膠原凝膠三明治結構（collagen gel sandwich configuraton）；（3）微載體粘附培養(yǎng)（microcarrier culture），通過載體，使肝細胞成球形，擴大了細胞的交換面積，有利于肝細胞結構和功能的穩(wěn)定；（4）微囊培

10、養(yǎng) （microcapsule culture） ，于微囊膜阻止了大分子物質（抗體、病毒）的通過，既保證了細胞營養(yǎng)，又起到免疫隔離作用；（5）中空纖維管培養(yǎng)（hollow fiber culture），肝細胞借助管壁上的微孔與培養(yǎng)液相通，用于生物人工肝的治療14。   1.3  肝細胞的凍存   為緩解供體器官的嚴重短缺，建立用于急診肝細胞移植治療所需的“肝細胞庫”，肝細胞凍存技術是關鍵。一般認為，低溫凍存細胞的效果，取決于冷凍保護液、降溫升溫的速度和方式、貯存溫度和貯存時間的長短等15  。Jamal等16 通過對鼠肝細胞的凍存及復

11、蘇研究發(fā)現，凍存肝細胞活性較新鮮細胞明顯下降（50%對70%），但凍存的鼠肝細胞在體內仍保持著增殖活性。Makowka 等17用-70低溫冰箱保存肝細胞，保存120天活性保持在50%60%。最近，Koizumi 等18 利用包膠囊法深低溫保存鼠肝細胞，發(fā)現能夠長期保持鼠肝細胞的藥物代謝功能。任何凍存方法的最終目的是最小化可以損傷細胞亞結構的細胞內冰晶形成,從而保持解凍后細胞活性、粘附能力及代謝活性。人肝細胞的凍存目前尚沒有一個標準的方法，國內外研究者積極致力于此領域的探索；溫度的控制目前主要有計算機控制型冷凍儀實現的階梯式降溫法和普通的- 20然后- 80 兩步降溫法；Guillouzo等19

12、報道兩者并無差異。國內郭躍虎等20報道用苦參堿與保護基劑二甲亞砜（DMSO）聯(lián)合使用取得較好效果。相信隨著科研的深入，肝細胞凍存技術不斷提高，一定能建立起理想的“肝細胞庫”，用于臨床肝細胞移植及生物人工肝治療急性肝功能衰竭。   2  肝細胞移植的臨床應用    2.1  肝細胞移植途徑   與肝移植相比，肝細胞移植簡單易行，可通過微創(chuàng)手術或介入置管完成。目前主要的移植部位有：（1）門脈或肝內移植：從生理環(huán)境到細胞環(huán)境，肝臟是肝細胞的最佳生活空間。肝臟的組織結構，門脈血供的營養(yǎng)物質和生長因子以及激素，使得移植的肝細

13、胞在不改變微結構的情況下與受體肝組織融合，肝功能能得到代償。使用本途徑較為安全，是較為常用的方法21，但偶會出現門脈高壓及肺栓塞的風險。（2）脾內移植：脾內網狀組織有俘獲和保護移植肝細胞不被吞噬細胞吞噬的作用，有利于細胞著床。同時脾內豐富的血供也為肝細胞的長期存活、增殖提供了有利條件。進一步的研究還發(fā)現, 肝細胞脾內移植可誘導特異性異體蛋白耐受。 在肝硬化成年患者，其脾臟較大約8001200g, 而急性肝衰患者脾臟約100150g。故對于慢性肝衰患者，脾內植入6億60億肝細胞途徑相對安全和容易操作22。但脾臟移植細胞也有引起門靜脈高壓癥及右心房壓力升高并發(fā)癥的可能性。（3）其他途徑：如腹腔、腸

14、細膜、皮下等。通過微創(chuàng)腹腔內肝細胞移植，肝細胞可存活10天以上。但腹腔移植可引起炎癥反應及腹腔感染，且移植細胞的血管化需較長時間?？傊瑤追N移植途徑各有優(yōu)缺點，目前的臨床試驗主要采用門脈肝內移植及脾內移植途徑。   2.2  肝細胞移植的臨床效果   肝細胞移植目前主要應用于爆發(fā)型肝功能衰竭以及肝相關性代謝性疾病，能有效地提供近期或者遠期肝功能支持23,24。研究表明25，移植后，肝細胞仍能維持正常的光鏡和電鏡結構，并能表達多種肝細胞功能，如白蛋白合成分泌、氨代謝、糖原儲存和酵解、膽紅素結合及細胞色素P450酶基因表達等。Soriano等35用

15、real-time PCR的方法檢測了供肝肝細胞的數量，同時通過對急性肝衰病人移植后的肝活檢，證實移植肝細胞在肝板及膽小管的浸潤，這說明門脈內移植的肝細胞不僅可增殖分化，而且利用縫隙連接同受體肝細胞相連，通過毛細膽管分泌膽汁。   作為整體器官移植的橋梁或替代治療，肝細胞移植顯示出很大價值和應用前景。結合文獻報道，現將收集到的臨床人肝細胞移植效果作一總結。   2.2.1  治療遺傳性肝臟代謝性疾病   臨床研究證明，肝細胞移植用于治療遺傳性肝臟代謝性疾病具有較好的效果。Grossman等對21例遺傳性肝臟代謝性疾病患者行肝

16、細胞移植治療2632，見表1。5 例接受治療的家族性高膽固醇血癥患者行肝左外葉切除后，體外分離肝細胞，利用反轉錄技術導入LDL蛋白受體基因，再由門脈移植入肝臟，移植56 天后發(fā)現移植肝細胞增殖，2周時達到峰值。隨訪2年，平均血清膽固醇下降20%，移植肝細胞及轉基因的功能存在，無1例腫瘤和感染發(fā)生。表1  肝細胞移植用于治療遺傳性肝臟代謝性疾病Hughes等對4例Crgler-Najjar綜合征患兒按整肝細胞量的5%輸入新鮮和深低溫保存的肝細胞，移植后高膽紅素平均下降了30%50%，降低了核黃疸的發(fā)生，隨訪顯示結合膽紅素水平保持穩(wěn)定水平達3年以上。   患有凝血因子

17、缺乏癥的兩兄弟，在接受整肝細胞量5%新鮮肝細胞及凍肝細胞移植（10億新鮮肝細胞，22 億凍肝細胞），結果顯示凝血功能明顯改善，對外源性因子的依賴性減少了80%, 由于靜脈通路產生的并發(fā)癥（兩位患者均發(fā)生了導管相關性敗學癥）以及肝細胞移植長期療效的不確定性穩(wěn)定性，半年后所需外源性因子的量增加，提示移植肝細胞功能喪失，接受了肝臟移植。2例1A型糖原儲存障礙兒童患者，經肝細胞移植治療后（第1周輸入30億，1個月后再次輸入30億肝細胞）開始正常飲食而血糖水平穩(wěn)定。其中1例患兒葡萄糖6-磷酸激酶活性在移植后3周恢復到正常水平，并一直保持到7個月。     

18、;       1例患先天性Refsum 綜合征的4歲患兒，經門脈行肝細胞移植（1 周內分8次輸入總量20億新鮮及凍存肝細胞），檢測發(fā)現總膽酸下降，肝內膽汁淤積癥狀緩解，穩(wěn)定到18個月后活檢證實移植的肝細胞仍保持活性。   4例患有鳥氨酸缺陷癥兒童分多次分別輸入總量達10億、40億及19億的肝細胞，其中2例移植后血氨保持正常至11天時行肝臟移植術；另1例移植后進蛋白質飲食血氨仍保持正常水平，7個月時行肝臟移植。1例5歲患兒，移植后28天活檢時鳥氨酸氨甲酰轉移酶仍有活性，但42天時死于敗血癥。   然而，在

19、對2例患有家族性膽汁淤積癥的兒童行肝細胞移植后沒有取得療效，分別在5個月和14個月后行肝移植術。分析原因可能與肝硬化程度較嚴重及輸入細胞量不足有關。   結合以上病例可看出，肝細胞移植用于治療肝相關性代謝性疾病的臨床研究取得了樂觀效果，但長期穩(wěn)定可靠的效果尚待進一步的觀察和研究。    2.2.2  治療慢性肝臟疾病肝衰  實驗證明33，肝細胞移植可明顯改善慢性肝病肝衰所致的膽汁淤積高血氨并改善肝性腦病。從以下20例（17例成人，3例兒童）接受肝細胞移植的慢性肝病肝衰患者的治療效果也得到證實3438，見表2。 &#

20、160; 3例原發(fā)性肝纖維化肝衰的患兒，分別由股動脈和門靜脈輸入肝細胞后（移植量分別為7億、5億及5千萬），血氨水平及肝性腦病得到臨床控制達6周。其中2例成功過渡到肝移植而治愈，而另1例因顱內出血而于移植后7天死亡。   7例肝硬化（Childs C級）肝性腦病級患者行同種異體肝細胞脾內移植（6億），其中2例移植后2天檢查發(fā)現肝細胞在脾內形成肝樣微結構，即“肝脾化”，患者臨床癥狀得到明顯緩解 。另5例酒精性肝硬化肝衰患者，行肝細胞脾內移植，5例生化指標改善，肝性腦病得到控制；其中1例移植后50天因多器官功能衰竭死亡，這可能和細胞移植的時機有關。   然而

21、，10例慢性肝?。–hilds AC級）患者經自體肝細胞（切除肝硬化的左肝外葉分離獲得）移植入脾內（2千萬2億不等），從第1個月到第6月檢測放射性核素Tc99m標記發(fā)現脾內肝細胞生長，但并未改善患者的肝性腦病，這可能與供體質量有關。 表2  肝細胞移植用于治療慢性肝臟疾病   2.2.3  治療急性肝功能衰竭   印度的Habibullah39等首次報道了7例急性肝功能衰竭患者行腹腔內胎肝細胞移植后存活率得到改善。十多年來又有30余例急性肝衰患者接受了肝細胞移植4042。目前已報道的37例急性肝衰患者見表3，年齡從3.5個月69歲，其

22、中，藥物性急性肝衰患者20例，分別接受了14次肝內、脾內及腹腔內肝細胞移植，所有患者移植后血氨及總膽紅素等生化指標明顯改善，肝性腦病等臨床癥狀改善，其中3例完全恢復而未進行肝移植術，3例行原位肝移植而治愈，其他患者在首次移植后8h35天死亡。從預后看肝細胞移植用于治療藥物性急性肝衰結果并不令人滿意，這可能與患者年齡結構（5例未成年人中4例死亡）、移植細胞數量、移植時機及原發(fā)疾病嚴重程度等因素有關，見表3。   Soriano等對6例原發(fā)性肝衰患者經門脈（4例）、腹膜內（1例）及脾臟（1例）行肝細胞移植，2例治愈而未行肝移植，2例在移植后第1天及第4天行原位肝移植術而康復；2

23、例死亡病例中，1例經脾內2次肝細胞移植后（2億，1.5億），第5天行肝移植術，在第13天因敗血癥和多器官功能衰竭而死亡；1例Reyes綜合征患者經門脈移植7億肝細胞，1天后腦死亡，這可能與原發(fā)腦水腫較重而移植較晚及移植細胞量不足有關。   9例病毒性肝炎急性肝衰和多器官功能衰竭的患者，分別行門脈、脾內及腹膜內肝細胞移植后，2例成功橋接到肝移植，而1例僅行肝細胞移植而最終治愈。   1例64歲婦女因嚴重的蘑菇中毒經門脈輸入49億肝細胞1天后血氨等各項生化指標明顯改善，肝性腦病由原來的4級轉為3級，從12周開始停止了免疫抑制治療，最終完全康復。 &

24、#160; Strom等報道，1例70歲患者肝三段切除后急性肝衰，分兩次經脾動脈行肝細胞移植術（3.6億1.7億），生化指標有改善，因原發(fā)病較重及年齡等因素，移植2天后死亡。   在以上臨床試驗的病例中，1例出現脾靜脈栓塞、2例肺栓塞以及1例腸細膜靜脈栓塞，但未見門靜脈高壓癥及右心房壓力升高等并發(fā)癥的報道。從以上臨床資料來看，預后不甚理想有多種原因，諸如病例選擇、細胞移植時機等；但肝細胞移植作為急性肝衰的治療手段之一，不僅可改善急性期肝功能的狀況，起到較好的支持作用，而且可刺激病肝細胞的恢復及肝小葉結構的重建，展現出廣闊的前景。  表3  肝細胞移植用于

25、治療急性肝功能衰竭   綜合以上78例臨床試驗可看出，肝細胞移植對遺傳性肝臟代謝性疾病可通過新分離的肝細胞或基因修飾的肝細胞做肝臟直接的基因治療，有望取代整肝移植，具有美好前景；而對于慢性和急性肝病肝衰患者，肝細胞移植可修復和重建肝功能或橋梁治療等待行原位肝移植，不失為肝衰的治療手段之一。近年來，國內楊永平等43給7例重型肝炎患者行體內肝細胞移植術，取得較好效果，令人鼓舞。誠然，肝細胞移植的臨床運用仍存在許多問題，諸如供肝的嚴重缺乏、肝細胞的分離純化技術（特別是不適用于肝移植肝的分離純化）、肝細胞的保存、肝細胞移植的移植途徑、數量、方式及免疫抑制治療，移植后的一些并發(fā)癥，如

26、血管栓塞、病毒感染、藥物及全胃腸外營養(yǎng)時的肝毒性44，倫理學因素及患者對此技術的接受程度等，很大程度上限制了肝細胞移植的廣泛開展。世界各國學者目前正致力于此領域的研究，如永生化肝細胞或肝細胞系、異種肝細胞、胎肝細胞等。近年來對肝干細胞的研究和應用，為細胞治療開辟了新的領域。相信，隨著研究的深入及存在問題的解決，肝細胞移植與肝臟移植一樣，必將給世界肝病的治療開創(chuàng)新的紀元?！緟⒖嘉墨I】  1 Renner EL.How to decide when to list a patient with acute liver failure for liver transplantation? Clichy or Kings College criteria, or something else . J Hepatol, 2007,46（4）:554-557.2 Rozga J.Liver support technology-an update .Xenotransplantation, 2006, 13:380-389.3 Robe