黃芪注射液對培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞再灌注損傷的保護(hù)作用

1、黃芪注射液對培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞再灌注損傷的保護(hù)作用         08-08-31 16:27:00     作者：宋光，何蕾，江朝光     編輯：studa20【摘要】  目的 研究黃芪注射液抗培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞再灌注損傷的作用。方法 采用培養(yǎng)的SD乳鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型，實(shí)驗(yàn)分為六組：A正常對照組，B缺氧組，C黃芪20組，D黃芪100組，E黃芪200組，F(xiàn)黃芪400組。黃芪各組缺氧過程中給予不同濃度黃芪，缺氧4 h，復(fù)氧

2、2 h。比較缺氧復(fù)氧前后心肌細(xì)胞存活率，培養(yǎng)液中心肌酶含量。結(jié)果 各組缺氧前后谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)均有差異。復(fù)氧后2 h，B、C、D組培養(yǎng)液中心肌酶含量均有不同程度升高(P0.05)。E、F組GOT值較基礎(chǔ)值降低(P0.05)。與正常組比較，各組細(xì)胞經(jīng)過缺氧復(fù)氧后，存活數(shù)均有不同程度下降(P0.01)。與缺氧復(fù)氧組比較，加入黃芪保護(hù)的黃芪20，黃芪100，黃芪200組均優(yōu)于單純?nèi)毖鯊?fù)氧組。黃芪200組存活率最高(P0.01)。結(jié)論 黃芪能夠減輕培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞再灌注損傷。 【關(guān)鍵詞】  再灌注損傷心肌保護(hù)細(xì)胞培養(yǎng)流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞低氧The Protective Effect of As

3、tragalus Injection on    Abstract: OBJECTIVE   To evaluate the protective effect of astragalus injection on reperfusion injury cardial myocytes. METHODS  Studies were conducted on cultured cells. Rat ventricular myocytes were subjected to hypoxia 4h and reoxygenation 2h

4、. Astragalus injection was applied to cells during ischemia/reoxygenation and the extent of cell death and myocardial enzyme was determined after 120 minutes of reperfusion. RESULTS  In cells, incubation with astragalus during reoxygenation attenuated the extent of cell damage and also reduced

5、the number of apoptotic cells. CONCLUSION  This study shows that astragalus attenuates cardiac myocytes injury during reperfusion.    Key words：  Astragalus; Cardioprotection;Cell culture; Cell hypoxia    提高心肌保護(hù)效果是心血管外科不斷發(fā)展的要求。通過藥物方法進(jìn)行心肌保護(hù)標(biāo)志著其中的一大進(jìn)步。本研究采用培養(yǎng)心肌細(xì)

6、胞探討黃芪注射液的抗再灌注損傷作用，嘗試為中藥在心肌保護(hù)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。    1  材料與方法    1.1  原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)  13 日齡Sprague Dawley大鼠（由解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供），紗巾法培養(yǎng)1。0.25%胰酶消化培養(yǎng)瓶內(nèi)單層細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，按實(shí)驗(yàn)要求的細(xì)胞量獲取原代心肌細(xì)胞。接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板內(nèi)。37，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱（REVCO公司，美國）內(nèi)培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁生長。經(jīng)鑒定90以上為心肌細(xì)胞，90以上為活細(xì)胞即可用于實(shí)驗(yàn)。  

7、60; 1.2  缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞模型制備  制備單細(xì)胞懸液，按實(shí)驗(yàn)要求細(xì)胞數(shù)目接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶內(nèi)。37，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁生長。實(shí)驗(yàn)前更換含1%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。更換相應(yīng)缺氧緩沖液。缺氧緩沖液（NaCl 137 mM,KCl 12 mM,MgCl2 0.49,CaCl2 0.9 mM,HEPES 4 mM,deoxyglucose 10 mM, sodium lactate 20 mM)2為高鉀低pH(pH 6.2）溶液，更好地模擬了心臟中的細(xì)胞暴露于無氧條件的情況。其后將細(xì)胞置于用配氣（95%N2+5%CO2，北京普

8、萊特斯公司）飽和的容器中，向其中持續(xù)充入配氣，燃蠟熄滅后再飽和10 min，充分驅(qū)趕容器中的氧氣后迅即密封容器，放入孵箱37，培養(yǎng)4h。4h后恢復(fù)有氧環(huán)境，傾去缺氧緩沖液，換正常10血清DMEM培養(yǎng)基后將細(xì)胞置于5%CO2孵箱中，于復(fù)氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)2h，造成心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷。    1.3  黃芪濃度對缺氧/復(fù)氧細(xì)胞凋亡影響  六個培養(yǎng)瓶細(xì)胞，每培養(yǎng)瓶細(xì)胞總數(shù)1×106，培養(yǎng)瓶隨機(jī)分為6組，編號為A組，B組，C組，D組，E組，F(xiàn)組。A組正常對照組，不加入黃芪，也不進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理。B組，C組，D組，E組，F(xiàn)組均為缺氧復(fù)氧組，其中

9、黃芪終濃度依次為0 l/ml，20 l/ml，100 l/ml，200 l/ml，400 l/ml黃芪培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)開始時B組，C組，D組，E組，F(xiàn)組更換相應(yīng)缺氧培養(yǎng)液，黃芪注射液終濃度分別為0 l/ml，20 l/ml，100 l/ml，200 l/ml，400 l/ml，37孵育缺氧培養(yǎng)4h。復(fù)氧時各組更換含相應(yīng)濃度黃芪的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液入培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h；正常對照組A組實(shí)驗(yàn)過程中入培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h。    實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，六組細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化制備單細(xì)胞懸液，磷酸鹽緩沖液離心洗滌2次(1000rpm，3 min)。細(xì)胞沉淀加入5 l Annexin-

10、V-FITC染液室溫避光染色10 min。加入5 l PI染液室溫避光染色10 min。加入400 l 緩沖液重懸細(xì)胞沉淀后入流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur，美國）進(jìn)行檢測（凋亡檢測試劑盒Annexin-V-FITC Apoptosis Detection Kit 1：BD Pharmingen BD Biosciences）。    1.4  黃芪對缺氧/復(fù)氧細(xì)胞培養(yǎng)液心肌酶的影響  制備單細(xì)胞懸液接種于24孔板內(nèi)，每孔接種3 ml細(xì)胞懸液（3×104個細(xì)胞/孔）。37，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁生長

11、。更換培養(yǎng)液，每板四組，各復(fù)5孔。黃芪注射液終濃度分別為0 l/ml，20 l/ml，100 l/ml，200 l/ml，400 l/ml培養(yǎng)液。37孵育。于24 h后取培養(yǎng)液0.5 ml在全自動生化分析儀上測定心肌酶。    1.5  統(tǒng)計方法  采用SAS軟件v8.2版本進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。平均值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s )表示，心肌酶缺氧前和缺氧后組間兩兩比較采用單因素方差分析，各組缺氧前后比較采用配對t檢驗(yàn)。組間存活細(xì)胞數(shù)比較采用X2檢驗(yàn)。P0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。    2  結(jié)  果    2.1  培養(yǎng)液心肌酶的變化  單因素方差分析顯示，缺氧前組間兩兩比較結(jié)果顯示，谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)基礎(chǔ)值無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.14270.05)。缺氧后組間兩兩比較結(jié)果顯示，E組,F組與其它各組均有差異，E組和F組之間也有差異。配對t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，各組缺氧前后GOT均有差異。復(fù)氧后2h，B組、C組、D組均有不同程度升高，P0.05。E組、F組GOT值較基礎(chǔ)值降低，P0.05，見表1。 表1  黃芪對復(fù)氧心肌細(xì)胞GOT的影響    2.2  黃芪