RhoA基因在肝細胞肝癌中的表達及其意義

1、RhoA基因在肝細胞肝癌中的表達及其意義*                     作者：王德盛，竇科峰，項紅軍，李 郁，宋振順，趙青川【摘要】  目的  探討RhoA基因與肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉移的關系。方法  采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）在半定量水平檢測42例肝細胞癌及其相對應的癌旁肝組織中RhoA mRNA的表達，同時采用PCR產(chǎn)物單鏈構象多態(tài)

2、性（PCR-SSCP）銀染法檢測RhoA基因的突變情況。結果  本組42例肝癌組織中RhoA mRNA光密度相對值明顯高于癌旁肝組織（P<0.01）；有門靜脈癌栓者其癌組織中RhoA mRNA光密度相對值明顯高于無癌栓者（P<0.05）。經(jīng)PCR-SSCP銀染法分析未發(fā)現(xiàn)異常泳動條帶。結論  RhoA基因在肝細胞肝癌進展中起重要作用，并可能與肝癌轉移相關。        【關鍵詞】  肝癌；RhoA；基因表達；RT-PCR      

3、      【Abstract】  Objective  To investigate the expression of RhoA gene in hepatocellular carcinoma and to evaluate the relationship between RhoA gene expression and invasion of hepatocellular carcinoma.Methods  The mRNA expression of RhoA gene was examined by

4、 RT-PCR in 42 cases of hepatocellular carcinoma and adjacent non-cancerous tissue.In addition，the mutation of RhoA gene was examined by PCR-SSCP.Results  The opacity density (OD) of RhoA mRNA expression in hepatocellular carcinoma tissues was significantly higher than that in adjacent non-cance

5、rous tissues (P<0.01）.The OD of RhoA mRNA expression in hepatocellular carcinoma with intrahepatic metastasis was significantly higher than that without intrahepatic metastasis (P<0.05）.Mutation was not found in RhoA gene by PCR-SSCP examination.Conclusion  The RhoA gene may be related to

6、 malignant transformation and development of hepatocellular carcinoma probably by overexpression.        【Key words】  hepatocellular carcinoma；RhoA；gene expression；RT-PCR        原發(fā)性肝癌發(fā)生率高，手術切除是目前最主要的治療方法。盡管隨著影像診斷和外科技術的進步，尤其是肝移植在肝癌中的運用，

7、肝癌的預后已經(jīng)有所改善，但肝臟的特殊解剖結構和功能決定著肝癌術后復發(fā)率高，術后復發(fā)已成為影響患者預后的主要問題。肝癌侵襲轉移是主要的影響因素之一，深入研究肝癌侵襲轉移機制對于改善肝癌患者的總體預后有重要作用。Rho蛋白和腫瘤發(fā)生有密切的關系，參與腫瘤的浸潤和轉移過程。Rho家族屬于Ras超家族，是重要的細胞內信號分子，在細胞的許多基礎生命活動中起關鍵的作用1。目前研究證實，Rho蛋白特別是RhoA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，在結腸癌、乳腺癌、肺癌、頭頸癌等均報道有RhoA表達的異常增高2。本研究利用RT-PCR技術及分子定量成像系統(tǒng)分析42例肝細胞肝癌（HCC）病人的肝癌組織及癌旁肝組織中R

8、hoA mRNA的表達，并探討其臨床意義。        1  材料與方法        1.1  材料        1.1.1  主要試劑及儀器  RT-PCR試劑盒購自MBI公司；dNTP及DNAmarker購自Promega公司；瓊脂糖、TRIzol試劑及DEPC購于Gibco公司。凝膠成像系統(tǒng)購自美國Genesis公司；UV-3000型紫外分析儀購自上海天能科技有限公

9、司；PE-2400TMPCR儀購自美國Perkin。        1.1.2  標本來源  42例患者的原發(fā)性肝癌組織及相對應的癌旁肝組織來自第四軍醫(yī)大學附屬第一醫(yī)院2004年8月2005年3月的新鮮手術標本，離體后30min內分裝保存于液氮罐中，所有病例均附癌旁肝組織作為對照，分別伴有慢性炎癥、纖維化和肝硬化，全部標本均經(jīng)病理科醫(yī)師切片確診。        1.2  方法       

10、; 1.2.1  擴增引物設計  以GenBank中人RhoA基因全長序列為模板，按引物設計原則予以設計，采用Primer premier 5.0軟件設計，其序列如下（U，D分別表示上游和下游引物）：RhoA U1 5CTGGTGATTGTTGTTGGTGATGG3，U2 5GATTCGTTGCCTGAGCAATG3，D 5GCGATCATAATCTT-CCTGCC3。Bactin引物序列：上游引物，5CGGGAAATC-GTGAT3；下游引物，5GAACTTTGGGGG ATGCTCGC3。其中U1、U2為RhoA上游引物，分別用于定量RT-PCR和PCR-SSCP，D為

11、下游引物。RhoA產(chǎn)物分別為183bp和221bp。        1.2.2  總RNA提取  組織總RNA的抽提取：0.5g組織塊，加入Trizol試劑1ml，在電動玻璃勻漿器中，充分勻漿。將全部勻漿液轉入1ml離心管中，加0.25ml氯仿，充分振蕩混勻，冰浴15min。低溫 13000r/min離心15min。小心吸取上層水相至另一1.5ml離心管中，注意不要吸到蛋白層或有機相，加等體積異丙醇，搖勻，室溫放置10min，低溫13000r/min離心15min，沉淀RNA。加70%酒精漂洗沉淀，5000r/min，離心10min，小心棄去酒精，空氣中干燥10min。經(jīng)電泳證實有兩條明顯的18S及28S條帶，用紫外可見分光光度儀檢測RNA的純度及含量。        1.2.3  RT-PCR擴增RhoA mRNA及鑒定  cDNA制備：應用逆轉錄試劑盒，總RNA投入量為2g，使用隨機引物。第一鏈cDNA合成后終體積10m，具體方法按說明操作。RhoA與Bactin反應同管進行，反應終體積為50l，反應條件為94 30s，