醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)綜合實驗

1、第五章醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)綜合實驗一、實驗?zāi)康?掌握利用系譜與DNA 檢測所得到的信息相結(jié)合用于產(chǎn)前基因診斷的方法；2了解 DNA 分析技術(shù)在遺傳病產(chǎn)前基因診斷中的應(yīng)。二、實驗原理（一） PCR-RFLP 分析技術(shù)PCR-RFLP 分析技術(shù)是在PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上，根據(jù)限制性內(nèi)切酶識別位點改變而導(dǎo)致的酶切位點增加或消失的特點，對DNA 進行鑒定；利用 PCR 特異擴增的DNA 片斷中包含某個堿基突變，經(jīng)特定限制酶切割后 , 通過凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物大小，比較分析與對照樣本的異同，判斷該DNA 是否存在突變。應(yīng)用PCR-RFLP 分析技術(shù)可以檢測已知的點突變，也可以在家系中連鎖分析進行基因診斷。（二） F基

2、因F基因位于人類染色體 Xq28 ，長 186kb ，由 26 個外顯子及 25 個內(nèi)含子組成。根據(jù) F基因序列，本實驗利用 PCR 結(jié)合 RFLP 設(shè)計了一對特異性引物， 首先擴增出 F基因長度為 142bp 的特異性片段，然后選擇Bcl 限制性核酸內(nèi)切酶對擴增產(chǎn)物進行消化，野生型基因擁有限制性核酸內(nèi)切酶Bcl 的酶切位點， 可被切為99bp 和 43bp 兩個片段；而突變型基因沒有限制性核酸內(nèi)切酶Bcl 的酶切位點，不會被Bcl 切斷，酶解后仍為142bp 的片段；如果酶解后142bp、99bp 和 43bp片段均出現(xiàn)，說明是野生型基因與突變型基因的雜合子（圖5-1 ，圖5-2）。圖 5-

3、1 PCR-RFLP 分析 F基因原理圖圖 5-2PCR-RFLP 分析 F基因結(jié)果示意（三）血友病A 病例姓名：李XX性別：男出生日期： 1979 年 5 月民族：漢現(xiàn)住址： XXXXXX就診日期： 2000 年 7 月（ XX 醫(yī)科大學(xué)XX 臨床學(xué)院血液室）主訴：反復(fù)出血不止、關(guān)節(jié)腫痛15 年，加重1 年現(xiàn)病史： 15 年前，于輕微外傷后出血不止，外用凝血藥止血后未予治療。此后齒齦、舌、口腔、鼻經(jīng)常出血，而膝、踝、肘等部位常于輕微外傷后出現(xiàn)淤斑、關(guān)節(jié)腫痛，癥狀逐年加重。查體：神志清楚，語言流利，貧血貌，膝、踝、肘關(guān)節(jié)僵硬變形，肌肉萎縮。實驗室檢查：凝血時間延長；凝血活酶時間顯著延長；血漿中

4、抗血友病球蛋白減少；出血時間、 凝血酶源時間、 纖維蛋白原含量、毛細(xì)血管脆性及血小板數(shù)均正常?！咀ⅲ貉獫{因子活性的正常均值定為100（范圍 50 200）。甲型血友病血漿因子活性水平低于5，重型 2?！考易迨罚?家系中兩個舅舅曾患類似病死亡，現(xiàn)有一同胞弟弟患有同病，同胞現(xiàn)年7 歲，已出現(xiàn)出血時間延長，出血不止癥狀。三、實驗準(zhǔn)備（材料、試劑、儀器）（一）試劑1模板 DNA （ 50ng/ l ）、引物和（ 20 ）、TaqDNA 聚合酶（ 5u/ l）、10XPCR 反應(yīng)緩沖液、 dNTP（ 2.5mM ）、滅菌蒸餾水、礦物油、限制性內(nèi)切酶Bcl ( 20 / l) 、 10X 酶切緩沖液。2

5、30%非變性聚丙烯酰胺凝膠（29 1）、5XTBE 、2%過硫酸銨、TEMED 、6X 上樣緩沖液、DNA 分子量標(biāo)記、 5mg/ml 溴化乙錠（ EB）染液、無水乙醇（三）儀器和設(shè)備PCR 自動熱循環(huán)儀、紫外透射儀、微量加樣器、槍頭及離心管、容器盒、恒溫水浴箱、制膠玻璃板、制膠架、聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置、 5ml 注射器、 12 號針頭、 25 l 玻璃注射器、燒杯、脫脂棉、保鮮膜、染色盒、微波爐、 250ml 三角燒瓶、透明膠帶、稱藥盤、天平。四、實驗方法與步驟（一） PCR 反應(yīng)PCR 反應(yīng)體系 20 l ，其成分如下：模板 DNA2l10× PCR 緩沖液2 lTaqDNA

6、聚合酶0.2 l2.5mM dNTP1 l20 M Primer 0.5 l20 M Primer 0.5 lddH 2 O13.8 l總體積20 lPCR 反應(yīng)循環(huán)溫度： 95 變性 2min ，9440s；55 30；72 50 ，共 30 個循環(huán)，最后經(jīng) 72延伸 5min ，反應(yīng)結(jié)束后置 4冰箱保存（二） PCR 產(chǎn)物的 Bcl I 酶切反應(yīng)體系 30 l其成分如下：PCR 擴增產(chǎn)物12l10X 酶解緩沖液3 lBcl I 限制酶1 lddH 2O14總體積30l置 50水浴消化 2 小時， 4保存。（三）聚丙烯酰胺凝膠電泳1制備 12%聚丙烯酰胺凝膠5 ml 。加 TEMED5 l

7、和 0.4ml 過硫酸銨， 混勻后灌膠， 插入加樣梳子。 待膠完全凝聚后， 拔出加樣梳子，安裝電泳裝置， 加入電泳緩沖液（ 1XTBE ），緩沖液應(yīng)高于加樣孔上緣，用注射器吸取緩沖液沖洗加樣孔，預(yù)電泳20 分鐘。2每份限制酶切產(chǎn)物取 10ul ，加 2ul 的 6X 載樣緩沖液，混勻后加入到樣品孔中，以 100V 電泳 50 分鐘。3拆下電泳裝置，取出聚丙烯酰胺凝膠，切去左上角，作好標(biāo)記后放到一個朔料盤內(nèi)，加EB染液染色3 分鐘。4 EB染色以后取出凝膠，放在紫外透射儀中觀察PCR-RFLP結(jié)果。五、注意事項1酶類試劑應(yīng)保存在 以下，以免失活，如 TaqDNA 聚合酶、 Bcl I 限制酶。2聚丙烯酰胺和溴化乙錠（EB）是有毒的，需戴手套操作，避免污染。3每組有患者、 患者父母和胎兒DNA樣本，分別進行PCR 擴增六、預(yù)期實驗結(jié)果與分析根據(jù)