黃芪湯對(duì)糖尿病腎病小鼠信號(hào)通路的影響_圖文

1、實(shí)驗(yàn)中醫(yī)DOI :1016306/j1008-861x201605012黃芪湯對(duì)糖尿病腎病小鼠AMPK-Camkk (LKB1信號(hào)通路的影響陳霞1,彭文1,曹愛麗21上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院腎內(nèi)科(上海2000622上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院腎內(nèi)科專科實(shí)驗(yàn)室(上海200062【摘要】目的:探討黃芪湯改善糖尿病腎病的作用及可能的機(jī)制。方法:40只6周齡db /db 小鼠隨機(jī)分為模型組及黃芪湯高、中、低劑量組,每組10只,10只6周齡db /m 小鼠作為正常對(duì)照組。模型組、正常組均予05%羧甲基纖維素鈉灌胃;各藥物組分別予黃芪湯108g /kg 、036g /kg 、012g /kg 灌胃。1次

2、/d ,灌胃14周后進(jìn)行生化指標(biāo)、腎組織病理學(xué)檢測(cè),Western blot 檢測(cè)各組腎皮質(zhì)中AMPK-Camkk (LKB1信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量。結(jié)果:與模型組比較,黃芪湯能降低db /db 小鼠的體質(zhì)量、腎質(zhì)量、血清三酰甘油(TG 、膽固醇(TC 、低密度脂蛋白(LDL-C 濃度,降低血清谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT 、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST 濃度,升高腎質(zhì)量/體質(zhì)量指數(shù)(P 005,改善腎臟病理情況;上調(diào)腎皮質(zhì)中p-AMPK 、p-Camkk 、p-LKB1、p-ACC 蛋白表達(dá)量(P 005。結(jié)論:黃芪湯通過有效活化AMPK-Camkk (LKB1信號(hào)通路改善糖尿病腎病?！娟P(guān)鍵詞】黃芪湯;AM

3、PK-Camkk (LKB1信號(hào)通路;db /db 小鼠;糖尿病腎病基金項(xiàng)目國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81473480;國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81400728作者簡(jiǎn)介陳霞,女,在讀博士生,主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治慢性腎病的臨床與基礎(chǔ)研究通訊作者彭文,教授,博士生導(dǎo)師;E-mail :pengwen_011sinacom2型糖尿病常伴有脂代謝紊亂,而脂代謝異常與糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)1。血脂升高加速活性氧自由基的產(chǎn)生,誘導(dǎo)腎小球硬化癥和小管間質(zhì)性損傷。越來越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)脂代謝紊亂與糖尿病腎病關(guān)系密切,但脂類物質(zhì)在加重2型糖尿病腎病損傷方面的具體作用及機(jī)制目前尚不清楚2。黃芪湯出

4、自北宋楊士嬴仁齋直指方論卷十七,由黃芪、茯苓、瓜蔞根、麥門冬、北五味子、炙甘草及生地黃七味藥組成,有補(bǔ)氣養(yǎng)陰之功效。本研究通過糖尿病腎病動(dòng)物模型,從AMPK-Camkk (LKB1信號(hào)通路入手,觀察黃芪湯對(duì)2型糖尿病腎病小鼠生理生化指標(biāo)、腎臟病理及腎皮質(zhì)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的作用,為黃芪湯治療糖尿病腎病提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。1材料與方法11實(shí)驗(yàn)材料111動(dòng)物6周齡雄性db /db 小鼠40只,體質(zhì)量(352g ;db /m 小鼠10只,體質(zhì)量(232g 。均購于南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK 滬2003-0002,SPF 級(jí)飼養(yǎng)。112藥品和試劑黃芪湯所有生藥均購自上海華宇藥業(yè)有

5、限公司,其中黃芪(批號(hào)H20130318062kg 、茯苓(批號(hào)H20120820012kg 、瓜蔞根(批號(hào)H20110117062kg 、麥門冬(批號(hào)H20121016042kg 、北五味子(批號(hào)H20130503031kg 、炙甘草(批號(hào)H20130529011kg 、生干地黃(批號(hào)H20120918013kg ,共計(jì)13kg ,濃縮干燥,得干浸膏1730g ,檢測(cè)浸膏得率為133%。抗體AMPK 、p-AMPK 、LKB1、p-LKB1購于Abcam (Cambridge ,MA ,USA ;ACC 、p-ACC 、p-Camkk 、Camkk 、GAPDH 以及羊抗兔、羊抗鼠二抗購自C

6、ell Signaling Technology (Danvers ,MA ,USA 。三酰甘油(TG 檢測(cè)試劑盒、谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT 、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST 檢測(cè)試劑盒購于Sigma-Aldrich (St Louis ,MO ;低密度脂蛋白(LDL-C /VLDL 試劑盒購于Abcam (Cambridge ,MA,USA。113實(shí)驗(yàn)儀器血糖儀及其配套試紙購于德國Bayer公司(sn2751665,酶標(biāo)儀購于美國Bio-ad 公司(VAIOSKAN FLASH,全自動(dòng)生化檢測(cè)儀購于瑞士Cobas公司,Image Lab TM圖像采集和分析軟件購于美國Bio-ad公司。12動(dòng)物分組和干預(yù)40

7、只6周齡db/db小鼠隨機(jī)分為模型組,黃芪湯高、中、低劑量組,每組10只。分別給予05%羧甲基纖維素鈉和黃芪湯108g/kg、036g/kg、012g/kg灌胃,1次/d。10只6周齡db/m小鼠作為正常對(duì)照組,給予05%羧甲基纖維素鈉灌胃,1次/d。均連續(xù)干預(yù)14周。13標(biāo)本處理及檢測(cè)方法干預(yù)結(jié)束后次日早晨空腹先行眼球取血;后取左側(cè)腎臟,剝?nèi)グ?由矢狀面切開分成兩部分,第一部分用10%福爾馬林浸泡用于病理檢測(cè),第二部分于80低溫保存用于檢測(cè)蛋白。131生化指標(biāo)檢測(cè)用試紙法檢測(cè)小鼠血糖,并稱量小鼠體質(zhì)量和腎質(zhì)量,小鼠血清TG、膽固醇(TC、LDL-C、ALT、AST分別用試劑盒檢測(cè)。24h

8、尿蛋白定量用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)。132組織學(xué)檢測(cè)10%中性福爾馬林中固定腎臟組織,石蠟包埋,切片,行PAS染色。400倍光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變。PAS染色由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀區(qū)中心醫(yī)院病理科協(xié)助完成。133Western blot檢測(cè)組織蛋白樣本(上樣量為20g采用SDS-PAGE膠分離,5%BSA封閉,加入一抗AMPK(11000稀釋,Camkk(11000稀釋,LKB1(11000稀釋,ACC(11000稀釋,p-AMPK(11000稀釋,p-Camkk(11000稀釋, p-LKB1(11000稀釋,p-ACC(1800稀釋, GAPDH(11000稀釋,4孵育過夜,洗膜,加入

9、二抗孵育1h,TBST洗膜,滴加ECL顯影液顯影。目的條帶采用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。14統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用GraphPad Prism50Software (GraphPad Prism Software Inc,San Diego,Calif, USA軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn),多組之間的比較采用One-Way ANOVA單因素方差分析;P005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果21對(duì)db/db小鼠腎質(zhì)量、體質(zhì)量、腎質(zhì)量/體質(zhì)量指數(shù)的影響模型組小鼠腎質(zhì)量、體質(zhì)量明顯高于正常組(P001,黃芪湯各劑量組腎質(zhì)量、體質(zhì)量較模型組明顯降低(P005,P001,且呈濃度依賴性。模型組小

10、鼠腎質(zhì)量/體質(zhì)量指數(shù)明顯低于正常組,黃芪湯各劑量組較模型組明顯升高(P005,P001。見表1。表1各組小鼠體質(zhì)量、腎質(zhì)量、腎質(zhì)量/體質(zhì)量指數(shù)比較(xs組別n體質(zhì)量(g腎質(zhì)量(g腎質(zhì)量/體質(zhì)量正常組102636167016001685008模型組104718547*023001*407008*黃芪湯高劑量組103854473#017002#570046#黃芪湯中劑量組104216295#018002#551128#黃芪湯低劑量組104380527#020002#461049#注:與正常組比較,*P001;與模型組比較,#P005,#P00122對(duì)小鼠血糖及24h尿蛋白濃度的影響模型組小鼠血糖及

11、24h尿蛋白濃度明顯高于正常組(P001,黃芪湯各劑量組血糖及24h尿蛋白濃度較模型組明顯降低(P001。見表2。表2各組小鼠血糖、24h尿蛋白比較(xs組別n血糖(mmol/L24h尿蛋白(g/L正常組10710122119107模型組103210305*2933153*黃芪湯高劑量組101066361#1056138#黃芪湯中劑量組101474358#1567351#黃芪湯低劑量組102034724#2067451#注:與正常組比較,*P001;與模型組比較,#P00123對(duì)小鼠血清血脂水平的影響結(jié)果顯示,模型組小鼠TC、TG、ALT、AST明顯高于正常組(P001, LDL-C則明顯低于

12、正常組(P001;黃芪湯各劑量組TC、TG、ALT、AST較模型組明顯降低(P005, P001,LDL-C明顯高于模型組(P005, P001。見表3。24對(duì)小鼠腎臟病理學(xué)的影響經(jīng)PAS染色觀察,db/db小鼠腎小球囊內(nèi)有充滿均質(zhì)紅染的糖原物質(zhì),毛細(xì)血管基底膜增厚,系膜區(qū)明顯增寬,內(nèi)有紅色的糖原物質(zhì),同時(shí)系膜基質(zhì)增加;腎小管官腔內(nèi)有紅色的糖原物質(zhì)沉積,上皮細(xì)胞腫脹、脫落。黃芪湯高、中、低給藥組腎小球和腎小管有不同程度的改變,表現(xiàn)為腎小球囊內(nèi)和系膜區(qū)糖原物質(zhì)色淡,沉積減少。見圖1。表3各組小鼠血清TC 、TG 、LDL-C 、ALT 、AST 水平比較(x s 組別n TG (mmol /L

13、TC (mmol /L LDL-C (mmol /L ALT (U /L AST (U /L 正常組1008902601600168500723663065203523模型組10367096*023001*407007*7333551*25400001*黃芪湯高劑量組10126073#017002#570046#4267473#9400200#黃芪湯中劑量組10161052#018002#551127#5466416#122003182#黃芪湯低劑量組10198042#020002#461049#6567153#165001277#注:與正常組比較,*P 001;與模型組比較,#P 005,#

14、P 0 01圖1小鼠腎臟病理(PAS 染色,40025對(duì)小鼠腎皮質(zhì)AMPK-Camkk (LKB1信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響Western blot 檢測(cè)結(jié)果提示, 模型組p-AMPK 、p-Camkk 、p-LKB1、p-ACC 蛋白表達(dá)顯著低于正常組。黃芪湯各劑量組p-AMPK 、p-Camkk 、p-LKB1、p-ACC 蛋白表達(dá)量呈濃度依賴性增加(P 005,P 001。見圖2,表4。3討論2型糖尿病是由于胰島素分泌相對(duì)不足(胰島素抵抗所引起,在臨床上主要表現(xiàn)為多飲、多尿、多食及肥胖,糖尿病高血糖狀態(tài)下,以腎組織中糖代謝紊亂為主的多種因素綜合造成腎組織中活性氧簇(OS 產(chǎn)生過多,破壞腎組織

15、正常的清除能力,過多不穩(wěn)定的OS 將與脂質(zhì)、蛋白等分子相互作用,激活一系列細(xì)胞信號(hào)通路3。脂代謝紊亂是2型糖尿病最常見的病理改變之一,是各種并發(fā)癥產(chǎn)生的重要危險(xiǎn)因素。2型糖尿病中脂代謝異常對(duì)1:正常組;2:模型組;3:黃芪湯高劑量組;4:黃芪湯中劑量組;5:黃芪湯低劑量組圖2各組小鼠AMPK-Camkk (LKB1信號(hào)通路蛋白表達(dá)電泳圖(Western blot 表4各組小鼠AMPK-Camkk (LKB1信號(hào)通路蛋白表達(dá)的比較(n =7,x s 組別p-ACC p-AMPK p-Camkk p-LKB1正常組067026089020081012065017模型組036019*047016*0

16、39025*040012*黃芪湯高劑量組065016#076013#078011#060025#黃芪湯中劑量組057014#061012#070021#057027#黃芪湯低劑量組043021#050021051014#045019#注:與正常組比較,*P 001;與模型組比較,#P 005,#P 001糖代謝有重要影響4,長期糖脂代謝紊亂可以引起腎臟病理改變5。糖尿病腎病血糖升高的病理狀態(tài)下能促使膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SEBP表達(dá)增加,同時(shí)SEBP引起TG、TC升高,進(jìn)而TGF-1和VEGF不斷增加,最終導(dǎo)致腎小球基質(zhì)蛋白增多、腎小球硬化和腎小管纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)黃芪湯可降低db/db小鼠

17、的血清TG、TC、LDL-C濃度,改善腎臟病理情況。血清ALT濃度增高是反映肝臟損害的重要指標(biāo),糖尿病病變一般伴隨肝臟的氧化損傷6。糖尿病肝臟損傷具體病理機(jī)制可能為在高糖環(huán)境下,糖尿病小鼠肝組織中的超氧化物歧化酶(SOD活性降低或失去活性,發(fā)生了非酶糖基化反應(yīng)。不飽和脂肪酸受到氧自由基影響,造成肝細(xì)胞膜中磷脂發(fā)生過氧化分解7。肝細(xì)胞膜的通透性、流動(dòng)性和膜蛋白變性、細(xì)胞膜受損、胞內(nèi)酶外漏,導(dǎo)致血清ALT 和AST水平升高。大量研究報(bào)道,小鼠長期處于高血糖狀態(tài)下,血清ALT的水平明顯增高,最終將造成肝臟功能的損傷。因此ALT水平可反映肝功能受損的程度8。本研究發(fā)現(xiàn)黃芪湯可劑量依賴性的降低db/db

18、小鼠血清ALT、AST濃度,改善db/db 小鼠肝功能受損程度。糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制之一是脂代謝的紊亂。研究已表明,AMPK-Camkk(LKB1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在脂代謝中起著非常重要的作用9-10。糖尿病是一種以胰島素抵抗和細(xì)胞功能障礙為病機(jī)、以慢性高血糖為特征的代謝。其中TG和游離脂肪酸(FFA的升高,既造成胰島素抵抗又造成細(xì)胞功能損害。糖尿病和脂代謝紊亂關(guān)系極其密切11。LKB1是腺苷酸激酶(AMPK上游的激酶,LKB1缺失可使AMPK功能下降。LKB1能在多種細(xì)胞內(nèi)磷酸化和活化AMPK,調(diào)節(jié)機(jī)體代謝和細(xì)胞增殖。AMPK是動(dòng)物細(xì)胞能量平衡的重要感受器,AMPK-亞基上存在一個(gè)特殊的蘇氨酸殘基

19、(Thr-1720,該位點(diǎn)可被LKB1磷酸化。AMPK蛋白被認(rèn)為是脂肪代謝關(guān)鍵酶乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC的一個(gè)上游調(diào)節(jié)因子。ACC是一種促進(jìn)脂肪酸合成的酶,其處于脂肪和糖代謝的一個(gè)交匯點(diǎn),在脂肪和碳水化合物代謝中有重要作用12。Camkk是一種激活鈣調(diào)素依賴蛋白激酶的激酶(Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase kinase,屬于眾多鈣調(diào)蛋白激酶中的一員,可以激活A(yù)MPK。Camkk參與外周組織營養(yǎng)過剩時(shí)的代謝調(diào)節(jié),在脂肪形成和肝細(xì)胞糖代謝中發(fā)揮重要作用13。AMPK是“細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器”,在調(diào)節(jié)糖、脂代謝方

20、面起重要作用。AMPK作為一個(gè)重要的信號(hào)通路,通過參與細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、機(jī)體炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激等過程,在延緩糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用14。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)通過黃芪湯作用于db/db小鼠,可以改善脂代謝紊亂,上調(diào)p-AMPK、p-Camkk、p-LKB1、p-ACC蛋白的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)黃芪湯可降低db/db小鼠的體質(zhì)量、腎質(zhì)量,降低血清TG、TC、LDL-C濃度,降低血清ALT、AST濃度,升高腎質(zhì)量/體質(zhì)量指數(shù),改善腎臟病理情況,可上調(diào)腎皮質(zhì)足細(xì)胞中p-AMPK、p-Camkk、p-LKB1、p-ACC蛋白表達(dá)水平,從而激活2型糖尿病腎病誘導(dǎo)的AMPK-Camkk(LKB1信號(hào)通路。

21、提示黃芪湯能通過激活A(yù)MPK-Camkk(LKB1表達(dá)而延緩糖尿病腎病的進(jìn)展,為黃芪湯應(yīng)用于臨床治療糖尿病腎病提供科學(xué)的理論依據(jù)。參考文獻(xiàn):1Siddiqui S,Ahsan H,Khan M,et alProtective effects oftocotrienols against lipid-induced nephropathy in experimental type-2 diabetic rats by modulation in TGF-beta expressionJToxicol Appl Pharmacol,2013,273(2:314-3242Wesson DEMovin

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30、en1,CAO Ai-li21Department of Nephrology,Putuo Hospital Affiliated to Shanghai Universityof Traditional Chinese Medicine,Shanghai,2000622Specialized Laboratory of Nephrology Department,Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai,200062ABSTACT Objective:To investigate the effect and possible mechanism of Huangqi Decoction(HQDon diabetic nephropathyMethods:Forty db/db mice of6weeks old were randomly divided into the model group treated with05% sodium carboxymethyl and HQD groups treated wi