環(huán)境微生物學(xué)第七章1節(jié)微生物生長

1、1第七章 微生物的生長和遺傳變異第一節(jié) 微生物的生長及其特性第二節(jié) 微生物的遺傳第三節(jié) 微生物的變異第四節(jié) 遺傳工程第五節(jié) 微生物的馴化與保藏2第一節(jié) 微生物的生長及其特性一、生長與繁殖的基本概念二、微生物生長的測定方法三、微生物的生長特性四、微生物膜的生長特性3一、生長與繁殖的基本概念何謂生長？同化作用大于異化作用時，細(xì)胞質(zhì)的量增加，表現(xiàn)在細(xì)胞體積或重量的不斷增加，這種現(xiàn)象稱生長。何謂繁殖？生長一定程度后細(xì)胞分裂，這就是細(xì)菌的繁殖。個體的生長和繁殖體現(xiàn)為群體的生長。（微生物重量或數(shù)目的增加）。 群體生長個體生長個體繁殖群體生長個體生長個體繁殖在微生物學(xué)中“只有群體的重復(fù)”才更有意義，因此“生

2、長”一般指群體生長。第一節(jié) 微生物的生長及其特性4二、微生物生長的測定方法第一節(jié) 微生物的生長及其特性生理指標(biāo)法計數(shù)法生物量法定量測定方法直接計數(shù)法（顯微鏡）間接計數(shù)法（關(guān)注：活細(xì)胞染色法、特定細(xì)胞計數(shù)法）體積法重量法（濕重法、干重法）組分法元素法呼吸強度耗氧量酶活性生物熱51. 計數(shù)法（1）直接計數(shù)法（顯微鏡）涂片染色法： 一定量樣品涂布在載玻片上，染色后計數(shù)。濾膜染色法： 一定量樣品過濾到濾膜上，然后染色計數(shù)。計數(shù)之前都需把樣品預(yù)處理分散分散第一節(jié) 微生物的生長及其特性6Measurement of total cell counts全細(xì)胞染色法（死活不分）：DAPI染色，染色，DTAF染

3、色染色第一節(jié) 微生物的生長及其特性DNADAPI:46-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride2Cl-H2N+NH2CNHH2N -C NH2DAPI染色染色7DNA5-DTAF : 5-(4,6-dichlorotriazinyl) aminofluoresceinOOHOOHOOHNHNNClNClDTAF染色法染色法第一節(jié) 微生物的生長及其特性8計數(shù)器法: 如血球計數(shù)板法比例計數(shù)法： 將已知顆粒濃度的液體與待測菌液按一定比例混合后在顯微鏡下，測各自的數(shù)目。（特點：不需測量體積）第一節(jié) 微生物的生長及其特性9美藍染色法（酵母活細(xì)胞計數(shù)）活細(xì)胞：無色

4、死細(xì)胞：藍色口丫啶橙染色法（在紫外顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光）活細(xì)胞：橙色熒光死細(xì)胞：綠色熒光 活細(xì)胞染色法第一節(jié) 微生物的生長及其特性10Tetrazolium salt reduction methodFormazanNHRNNRNRCH甲撍化合物Tetrazolium chlorideNRRNNNCl-+R四氮唑化合物（染料）四氮唑化合物（染料）染色法第一節(jié) 微生物的生長及其特性11TTC：2,3,5-氯化三苯基四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride）CNNNN+Cl-無色；被還原后生成紅色的2,3,5-三苯基甲撍（TF）：Triphenyl formazanC

5、NNHNN2H+HCl第一節(jié) 微生物的生長及其特性常用的四氮唑化合物（染料）12CTC : 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chlorideCTCCl-NNNNCNCN3+CN3H第一節(jié) 微生物的生長及其特性CTCFNHNNNCCNCN3CN3CTCF : CTC-formazane13雙重染色法DTAF和CTC雙重染色法10m第一節(jié) 微生物的生長及其特性14 低活性細(xì)胞的計數(shù)（細(xì)胞增大技術(shù)） DVC(Direct Viable Count) methodNNH3CNalidixic acid （萘啶酮酸）(1-ethyl-1,4,dihydro-7-methy

6、l-4-oxo-1,8-aphthyridine-3-carboxylic acid)30C, 18 hour incubatedNalidixic acid Yeast extract第一節(jié) 微生物的生長及其特性15（2）間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）平板計數(shù)法：測定菌落數(shù)，（注意：可培養(yǎng)的微生物很少） 描述：CFU（colony formation unit） 液體計數(shù)法（MPN法，most probable number法）： 最可能數(shù)法 主要用于在平板培養(yǎng)基上不易形成菌落的菌 （硝化菌、反硝化菌、硫酸還原菌）液膜法：過濾到濾膜上（把膜放在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)）第一節(jié) 微生物的生長及其特性1617

7、（3）特定微生物計數(shù)法平板法液體法e.g. Cr6+耐性微生物抗生素抗性菌亞硝酸菌、硝酸菌的計數(shù)FISH（熒光雜交法）Fluoreseuce In situ hybridization 16sRNA的堿基組成設(shè)計特異的探針（probe） 選擇性培養(yǎng)基法第一節(jié) 微生物的生長及其特性18Principle of fluorescent in situ hybridization (FISH)rRNAOligonucleotide probeFluorescence第一節(jié) 微生物的生長及其特性19FISH法的步驟法的步驟螢光標(biāo)示探針(Probe)滲透rRNA細(xì)胞Hybridization螢光顯微鏡觀

8、察、計數(shù)第一節(jié) 微生物的生長及其特性2010mFISH法法DTAF染色染色土壤中微生物的測定(例子)微生物微生物同視野第一節(jié) 微生物的生長及其特性212. 生物量法（1）測體積：離心或自然沉降后觀察體積(粗放的方法)（2）測細(xì)胞干重：離心法、過濾法兩種 105110C下干燥后稱重（干重約為濕重的1020%）活性污泥濃度測定方法：MLSS（mixed liquid suspended solid）混合懸浮固體MLVSS（mixed liquid volatile suspended solid） 550C、2h、馬福爐（3）比濁法/光密度法 OD（optical density）450660nm

9、, 可見光第一節(jié) 微生物的生長及其特性22（5）細(xì)胞含氮量 細(xì)菌含氮量12.5%、酵母為7.5% 粗蛋白量6.25N量（6）DNA、蛋白質(zhì) 同一微生物的DNA和蛋白質(zhì)含量相對穩(wěn)定， 所以可以通過測量DNA、蛋白質(zhì)的量評價生物量。（7）ATP、RNA可以反映活性微生物的量（8）微生物呼吸醌類 1g含活性污泥平均約含1mol呼吸醌類。（4）測細(xì)胞含碳量POC（particulate organic carbon）POC12X mg/l特點：快、低濃度也可測TOC（total organic carbon）：總有機碳DOC（dissolved organic carbon）：溶解性有機碳第一節(jié) 微生

10、物的生長及其特性23三、微生物的生長特性1、間歇培養(yǎng)（Batch cultivation）和生長曲線（growth curve）接種第一節(jié) 微生物的生長及其特性間歇培養(yǎng)：將少量微生物接種于一定量的液體培養(yǎng)基內(nèi)，在一定條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)過程不投加或取出任何東西。這種培養(yǎng)方式叫間歇培養(yǎng)。生長曲線：細(xì)胞量隨時間的變化曲線稱生長曲線。24總細(xì)胞數(shù)微生物的典型生長曲線活細(xì)胞數(shù)III培養(yǎng)時間細(xì)胞個數(shù)第一節(jié) 微生物的生長及其特性2500時間微生物數(shù)生長速度緩慢期對數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期活菌數(shù)總菌數(shù)微生物生長曲線（按微生物數(shù)目的對數(shù)繪制）26時間活微生物重量生長率上升階段生長率下降階段內(nèi)源呼吸階段微生物生長曲線（按微

11、生物重量繪制）微生物生長曲線（按微生物重量繪制）第一節(jié) 微生物的生長及其特性27緩慢期(亦稱延滯期, lag phase）影響緩慢期長短的因素： 接種齡：種子（inoculum）處于什么生長期。 、 接種量：特別是X0/S0，即初期微生物濃度與基質(zhì)濃度的比。 培養(yǎng)基成分產(chǎn)生緩慢期的原因：缺乏分解有關(guān)基質(zhì)的酶； 缺乏充足的代謝中間產(chǎn)物 總細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞數(shù)III培養(yǎng)時間細(xì)胞個數(shù)特點：生長速率常數(shù)近于零 細(xì)胞形態(tài)變大 rRNA含量增高 合成代謝較活躍第一節(jié) 微生物的生長及其特性282）對數(shù)期（stationary phase） 亦稱指數(shù)期（exponential phase）最短總細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞數(shù)III

12、培養(yǎng)時間細(xì)胞個數(shù)細(xì)胞數(shù)（量）以指數(shù)形式增加的時間段。 特點：生長速率最大，世代時間（generation time） 倍加時間（doubling time）酶系活躍、代謝旺盛細(xì)胞進行平衡生長，體內(nèi)各成分最為均勻 第一節(jié) 微生物的生長及其特性29指數(shù)期的數(shù)學(xué)描述1dxrkXdt10lnXKtX10KtXXe世代時間0t tGnn 世代數(shù)02nXX0lglglg2XXn第一節(jié) 微生物的生長及其特性303）穩(wěn)定期（stationary phase）： 亦稱恒定期、最高生長期、生長速率下降期等特點：凈增長速度接近零繁殖與死亡速度幾乎相等正生長與負(fù)生長幾乎相等生長速率下降階段 S很低，其濃度對微生物影響

13、大2dsk Sdt即有機物分解速率與其濃度成正比出現(xiàn)穩(wěn)定期的原因： 營養(yǎng)物尤其是生長因子耗盡 營養(yǎng)物比例失調(diào)代謝物的積累 pH、DO、氧化還原電位的變化第一節(jié) 微生物的生長及其特性314）衰亡期（decline phase, death phase）內(nèi)源呼吸期（endogenous respiration phase）內(nèi)源呼吸：體內(nèi)貯藏物質(zhì)酶等一部分細(xì)胞物質(zhì)的氧化。特點： 細(xì)胞形態(tài)多型化 細(xì)胞會發(fā)生自溶現(xiàn)象（autolysis），蛋白質(zhì)水解酶活力 往往產(chǎn)生芽孢出現(xiàn)衰亡期的原因： 營養(yǎng)物不足（代謝產(chǎn)物的積累） 外界條件惡化總細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞數(shù)III培養(yǎng)時間細(xì)胞個數(shù)第一節(jié) 微生物的生長及其特性322、

14、間歇培養(yǎng)時微生物生長的數(shù)學(xué)描述（1）生長與基質(zhì)濃度的關(guān)系微生物比增長速度：1dxdtx單位時間，單位微生物量的增加量max基質(zhì)濃度s第一節(jié) 微生物的生長及其特性33maxssksKs: 飽和常數(shù)，與max12的s值相等KsS時maxmaxssSk SkkSmaxsKsMonod公式（莫諾特公式）經(jīng)驗公式（微生物增長）第一節(jié) 微生物的生長及其特性34()d xd sad td td sk xd t1d xkxd t1)對數(shù)期：b x 項忽略不計(2)細(xì)胞濃度變化：()d xd sab xd td ta: 合成系數(shù)/菌體收率 污染物轉(zhuǎn)化系數(shù)b: 內(nèi)源呼吸常數(shù)總細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞數(shù)III培養(yǎng)時間細(xì)胞個數(shù)第

15、一節(jié) 微生物的生長及其特性因為S濃度很高S ks352）穩(wěn)定期（生長下降期 ）：ssk2d sksd tX 變化不大;xconstd xb xd t3）衰亡期（內(nèi)源呼吸期）：()d sad t項可忽略總細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞數(shù)III培養(yǎng)時間細(xì)胞個數(shù)第一節(jié) 微生物的生長及其特性36微生物生長期與廢水生物處理：（活性污泥等的混合微生物群，也有類似的生長曲線。) 水處理中如何避免緩慢期接種對數(shù)期或代謝旺盛的污泥增加接種量污泥馴化（以后詳細(xì)講）微生物維持在對數(shù)期可獲得高的處理能力，即分解速率，但處理效果 不一定好菌活力大，不易凝聚和沉淀需要充足的營養(yǎng)物，故得不到好的水質(zhì)第一節(jié) 微生物的生長及其特性37處于穩(wěn)定期

16、污泥雖然生長速度有所下降，但有一定的代謝活性，絮凝沉降性能好。 故傳統(tǒng)的活性污泥法常運行在這個范圍。 衰亡期只出現(xiàn)在某些特殊的水處理場合， 如延時曝氣及污泥消化。第一節(jié) 微生物的生長及其特性38食料/微生物比代謝速率內(nèi)源呼吸階段生長率下降階段生長率上升階段（沉降性能好）（沉降性能差）大多數(shù)活性污泥處理系統(tǒng)運行范圍延時曝氣，污泥消化注意：各個階段的食物/菌量比(F/M)發(fā)生變化，相當(dāng)于活性污泥系統(tǒng)的污泥負(fù)荷。第一節(jié) 微生物的生長及其特性微生物代謝速率與食料/微生物比的關(guān)系393、連續(xù)培養(yǎng)（continuous cultivation）是一種連續(xù)進料又連續(xù)出料的培養(yǎng)方式根據(jù)控制因素的不同分為恒濁連

17、續(xù)培養(yǎng)（turbidostat）恒化連續(xù)培養(yǎng)（chemostat）進料速度保持一定4. 半連續(xù)培養(yǎng)（semi-batch cultivation）、半間歇式Fill and draw第一節(jié) 微生物的生長及其特性405. 分批補料式培養(yǎng)（fed batch）以低速把高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)連續(xù)加入培養(yǎng)器中，但不排出物料。體積是隨時間變化的特點：能任意控制培養(yǎng)液中的底物濃度，所以沒有流出。供應(yīng)速度與微生物消費速度達到平衡，所以能保持一定的濃度。主要用于： 有抑制作用的底物 生長因子添加 高濃度菌體培養(yǎng)添加方法定速添加指數(shù)添加dvdt=constant第一節(jié) 微生物的生長及其特性41四 、 微生物膜的生長特

18、性1. 生物膜的生長液體培養(yǎng)基中加入固體物質(zhì)(載體)，微生物在其表面吸附、生長、繁殖形成形成膜，這種膜叫微生物膜。第一節(jié) 微生物的生長及其特性42從單位固體表面積上的微生物量(mg/cm2)上看可分為6個階段a. 延滯期b. 加速增長期c. 恒速增長期d. 減速增長期e. 安定期f. 脫落期第一節(jié) 微生物的生長及其特性微生物膜的生長模式圖43微生物膜的生長過程中密度的變化隨著膜厚的增加，密度也發(fā)生變化第一節(jié) 微生物的生長及其特性44第一節(jié) 微生物的生長及其特性微生物膜內(nèi)部的密度變化45（1）延滯期：細(xì)胞吸附在固體表面上的過程（沉降）影響吸附速度的因子：材質(zhì)、表面性質(zhì)、形狀、細(xì)胞的性質(zhì)、操作條件

19、（2）加速增長期：還沒有形成完整的膜（3）恒速增長期： 活性細(xì)胞量達到最大，形成完整的膜。膜表面凹凸不平。第一節(jié) 微生物的生長及其特性46（4）減速增長期： 恒速增長期與安定期的過渡期，持續(xù)時間短。（5）安定期： 增長速度與脫落速度相平衡，膜量及膜厚達到最大值。（6）脫落期： 外因：流體的剪切力 內(nèi)因：微生物的死亡、氣泡的形成，細(xì)胞外高分子量的變化。第一節(jié) 微生物的生長及其特性472. 生物膜的特性（1）有效膜厚生物膜并不是全部有活性基質(zhì)的擴散細(xì)胞的死亡70200m（平均100 m），并不是越厚越好。第一節(jié) 微生物的生長及其特性48生物膜菌群的空間分布的測定 試驗方法 熒光原位雜交技術(shù)（FISH） 激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）用途：熒光信號的定位檢測和定量分析。熒光信號的定位檢測和定量分析。名稱EUB338NONNso190NIT3序列序列5-35-3GCT GCC TCC CGT AGG AGTACT CCT ACG GGA GGC AGCCGA TCC CCT GCT TTT CTC CCCT GTG CTC CAT GCT CCG特異性大部分細(xì)菌大部分細(xì)菌(Domain bacteria）不和任何細(xì)菌雜交氨氧化細(xì)菌氨氧化細(xì)菌（-subgroup ammonia oxidizing bacteria）硝化細(xì)菌