環(huán)境微生物學(xué)第七章1節(jié)微生物生長(zhǎng)

1、1第七章 微生物的生長(zhǎng)和遺傳變異第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性第二節(jié) 微生物的遺傳第三節(jié) 微生物的變異第四節(jié) 遺傳工程第五節(jié) 微生物的馴化與保藏2第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性一、生長(zhǎng)與繁殖的基本概念二、微生物生長(zhǎng)的測(cè)定方法三、微生物的生長(zhǎng)特性四、微生物膜的生長(zhǎng)特性3一、生長(zhǎng)與繁殖的基本概念何謂生長(zhǎng)？同化作用大于異化作用時(shí)，細(xì)胞質(zhì)的量增加，表現(xiàn)在細(xì)胞體積或重量的不斷增加，這種現(xiàn)象稱生長(zhǎng)。何謂繁殖？生長(zhǎng)一定程度后細(xì)胞分裂，這就是細(xì)菌的繁殖。個(gè)體的生長(zhǎng)和繁殖體現(xiàn)為群體的生長(zhǎng)。（微生物重量或數(shù)目的增加）。 群體生長(zhǎng)個(gè)體生長(zhǎng)個(gè)體繁殖群體生長(zhǎng)個(gè)體生長(zhǎng)個(gè)體繁殖在微生物學(xué)中“只有群體的重復(fù)”才更有意義，因此“生

2、長(zhǎng)”一般指群體生長(zhǎng)。第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性4二、微生物生長(zhǎng)的測(cè)定方法第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性生理指標(biāo)法計(jì)數(shù)法生物量法定量測(cè)定方法直接計(jì)數(shù)法（顯微鏡）間接計(jì)數(shù)法（關(guān)注：活細(xì)胞染色法、特定細(xì)胞計(jì)數(shù)法）體積法重量法（濕重法、干重法）組分法元素法呼吸強(qiáng)度耗氧量酶活性生物熱51. 計(jì)數(shù)法（1）直接計(jì)數(shù)法（顯微鏡）涂片染色法： 一定量樣品涂布在載玻片上，染色后計(jì)數(shù)。濾膜染色法： 一定量樣品過(guò)濾到濾膜上，然后染色計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)之前都需把樣品預(yù)處理分散分散第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性6Measurement of total cell counts全細(xì)胞染色法（死活不分）：DAPI染色，染色，DTAF染

3、色染色第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性DNADAPI:46-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride2Cl-H2N+NH2CNHH2N -C NH2DAPI染色染色7DNA5-DTAF : 5-(4,6-dichlorotriazinyl) aminofluoresceinOOHOOHOOHNHNNClNClDTAF染色法染色法第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性8計(jì)數(shù)器法: 如血球計(jì)數(shù)板法比例計(jì)數(shù)法： 將已知顆粒濃度的液體與待測(cè)菌液按一定比例混合后在顯微鏡下，測(cè)各自的數(shù)目。（特點(diǎn)：不需測(cè)量體積）第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性9美藍(lán)染色法（酵母活細(xì)胞計(jì)數(shù)）活細(xì)胞：無(wú)色

4、死細(xì)胞：藍(lán)色口丫啶橙染色法（在紫外顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光）活細(xì)胞：橙色熒光死細(xì)胞：綠色熒光 活細(xì)胞染色法第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性10Tetrazolium salt reduction methodFormazanNHRNNRNRCH甲撍化合物Tetrazolium chlorideNRRNNNCl-+R四氮唑化合物（染料）四氮唑化合物（染料）染色法第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性11TTC：2,3,5-氯化三苯基四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride）CNNNN+Cl-無(wú)色；被還原后生成紅色的2,3,5-三苯基甲撍（TF）：Triphenyl formazanC

5、NNHNN2H+HCl第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性常用的四氮唑化合物（染料）12CTC : 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chlorideCTCCl-NNNNCNCN3+CN3H第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性CTCFNHNNNCCNCN3CN3CTCF : CTC-formazane13雙重染色法DTAF和CTC雙重染色法10m第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性14 低活性細(xì)胞的計(jì)數(shù)（細(xì)胞增大技術(shù)） DVC(Direct Viable Count) methodNNH3CNalidixic acid （萘啶酮酸）(1-ethyl-1,4,dihydro-7-methy

6、l-4-oxo-1,8-aphthyridine-3-carboxylic acid)30C, 18 hour incubatedNalidixic acid Yeast extract第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性15（2）間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）平板計(jì)數(shù)法：測(cè)定菌落數(shù)，（注意：可培養(yǎng)的微生物很少） 描述：CFU（colony formation unit） 液體計(jì)數(shù)法（MPN法，most probable number法）： 最可能數(shù)法 主要用于在平板培養(yǎng)基上不易形成菌落的菌 （硝化菌、反硝化菌、硫酸還原菌）液膜法：過(guò)濾到濾膜上（把膜放在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)）第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性1617

7、（3）特定微生物計(jì)數(shù)法平板法液體法e.g. Cr6+耐性微生物抗生素抗性菌亞硝酸菌、硝酸菌的計(jì)數(shù)FISH（熒光雜交法）Fluoreseuce In situ hybridization 16sRNA的堿基組成設(shè)計(jì)特異的探針（probe） 選擇性培養(yǎng)基法第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性18Principle of fluorescent in situ hybridization (FISH)rRNAOligonucleotide probeFluorescence第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性19FISH法的步驟法的步驟螢光標(biāo)示探針(Probe)滲透rRNA細(xì)胞Hybridization螢光顯微鏡觀

8、察、計(jì)數(shù)第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性2010mFISH法法DTAF染色染色土壤中微生物的測(cè)定(例子)微生物微生物同視野第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性212. 生物量法（1）測(cè)體積：離心或自然沉降后觀察體積(粗放的方法)（2）測(cè)細(xì)胞干重：離心法、過(guò)濾法兩種 105110C下干燥后稱重（干重約為濕重的1020%）活性污泥濃度測(cè)定方法：MLSS（mixed liquid suspended solid）混合懸浮固體MLVSS（mixed liquid volatile suspended solid） 550C、2h、馬福爐（3）比濁法/光密度法 OD（optical density）450660nm

9、, 可見光第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性22（5）細(xì)胞含氮量 細(xì)菌含氮量12.5%、酵母為7.5% 粗蛋白量6.25N量（6）DNA、蛋白質(zhì) 同一微生物的DNA和蛋白質(zhì)含量相對(duì)穩(wěn)定， 所以可以通過(guò)測(cè)量DNA、蛋白質(zhì)的量評(píng)價(jià)生物量。（7）ATP、RNA可以反映活性微生物的量（8）微生物呼吸醌類 1g含活性污泥平均約含1mol呼吸醌類。（4）測(cè)細(xì)胞含碳量POC（particulate organic carbon）POC12X mg/l特點(diǎn)：快、低濃度也可測(cè)TOC（total organic carbon）：總有機(jī)碳DOC（dissolved organic carbon）：溶解性有機(jī)碳第一節(jié) 微生

10、物的生長(zhǎng)及其特性23三、微生物的生長(zhǎng)特性1、間歇培養(yǎng)（Batch cultivation）和生長(zhǎng)曲線（growth curve）接種第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性間歇培養(yǎng)：將少量微生物接種于一定量的液體培養(yǎng)基內(nèi)，在一定條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程不投加或取出任何東西。這種培養(yǎng)方式叫間歇培養(yǎng)。生長(zhǎng)曲線：細(xì)胞量隨時(shí)間的變化曲線稱生長(zhǎng)曲線。24總細(xì)胞數(shù)微生物的典型生長(zhǎng)曲線活細(xì)胞數(shù)III培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞個(gè)數(shù)第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性2500時(shí)間微生物數(shù)生長(zhǎng)速度緩慢期對(duì)數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期活菌數(shù)總菌數(shù)微生物生長(zhǎng)曲線（按微生物數(shù)目的對(duì)數(shù)繪制）26時(shí)間活微生物重量生長(zhǎng)率上升階段生長(zhǎng)率下降階段內(nèi)源呼吸階段微生物生長(zhǎng)曲線（按微

11、生物重量繪制）微生物生長(zhǎng)曲線（按微生物重量繪制）第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性27緩慢期(亦稱延滯期, lag phase）影響緩慢期長(zhǎng)短的因素： 接種齡：種子（inoculum）處于什么生長(zhǎng)期。 、 接種量：特別是X0/S0，即初期微生物濃度與基質(zhì)濃度的比。 培養(yǎng)基成分產(chǎn)生緩慢期的原因：缺乏分解有關(guān)基質(zhì)的酶； 缺乏充足的代謝中間產(chǎn)物 總細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞數(shù)III培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞個(gè)數(shù)特點(diǎn)：生長(zhǎng)速率常數(shù)近于零 細(xì)胞形態(tài)變大 rRNA含量增高 合成代謝較活躍第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性282）對(duì)數(shù)期（stationary phase） 亦稱指數(shù)期（exponential phase）最短總細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞數(shù)III

12、培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞個(gè)數(shù)細(xì)胞數(shù)（量）以指數(shù)形式增加的時(shí)間段。 特點(diǎn)：生長(zhǎng)速率最大，世代時(shí)間（generation time） 倍加時(shí)間（doubling time）酶系活躍、代謝旺盛細(xì)胞進(jìn)行平衡生長(zhǎng)，體內(nèi)各成分最為均勻 第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性29指數(shù)期的數(shù)學(xué)描述1dxrkXdt10lnXKtX10KtXXe世代時(shí)間0t tGnn 世代數(shù)02nXX0lglglg2XXn第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性303）穩(wěn)定期（stationary phase）： 亦稱恒定期、最高生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)速率下降期等特點(diǎn)：凈增長(zhǎng)速度接近零繁殖與死亡速度幾乎相等正生長(zhǎng)與負(fù)生長(zhǎng)幾乎相等生長(zhǎng)速率下降階段 S很低，其濃度對(duì)微生物影響

13、大2dsk Sdt即有機(jī)物分解速率與其濃度成正比出現(xiàn)穩(wěn)定期的原因： 營(yíng)養(yǎng)物尤其是生長(zhǎng)因子耗盡 營(yíng)養(yǎng)物比例失調(diào)代謝物的積累 pH、DO、氧化還原電位的變化第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性314）衰亡期（decline phase, death phase）內(nèi)源呼吸期（endogenous respiration phase）內(nèi)源呼吸：體內(nèi)貯藏物質(zhì)酶等一部分細(xì)胞物質(zhì)的氧化。特點(diǎn)： 細(xì)胞形態(tài)多型化 細(xì)胞會(huì)發(fā)生自溶現(xiàn)象（autolysis），蛋白質(zhì)水解酶活力 往往產(chǎn)生芽孢出現(xiàn)衰亡期的原因： 營(yíng)養(yǎng)物不足（代謝產(chǎn)物的積累） 外界條件惡化總細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞數(shù)III培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞個(gè)數(shù)第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性322、

14、間歇培養(yǎng)時(shí)微生物生長(zhǎng)的數(shù)學(xué)描述（1）生長(zhǎng)與基質(zhì)濃度的關(guān)系微生物比增長(zhǎng)速度：1dxdtx單位時(shí)間，單位微生物量的增加量max基質(zhì)濃度s第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性33maxssksKs: 飽和常數(shù)，與max12的s值相等KsS時(shí)maxmaxssSk SkkSmaxsKsMonod公式（莫諾特公式）經(jīng)驗(yàn)公式（微生物增長(zhǎng)）第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性34()d xd sad td td sk xd t1d xkxd t1)對(duì)數(shù)期：b x 項(xiàng)忽略不計(jì)(2)細(xì)胞濃度變化：()d xd sab xd td ta: 合成系數(shù)/菌體收率 污染物轉(zhuǎn)化系數(shù)b: 內(nèi)源呼吸常數(shù)總細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞數(shù)III培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞個(gè)數(shù)第

15、一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性因?yàn)镾濃度很高S ks352）穩(wěn)定期（生長(zhǎng)下降期 ）：ssk2d sksd tX 變化不大;xconstd xb xd t3）衰亡期（內(nèi)源呼吸期）：()d sad t項(xiàng)可忽略總細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞數(shù)III培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞個(gè)數(shù)第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性36微生物生長(zhǎng)期與廢水生物處理：（活性污泥等的混合微生物群，也有類似的生長(zhǎng)曲線。) 水處理中如何避免緩慢期接種對(duì)數(shù)期或代謝旺盛的污泥增加接種量污泥馴化（以后詳細(xì)講）微生物維持在對(duì)數(shù)期可獲得高的處理能力，即分解速率，但處理效果 不一定好菌活力大，不易凝聚和沉淀需要充足的營(yíng)養(yǎng)物，故得不到好的水質(zhì)第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性37處于穩(wěn)定期

16、污泥雖然生長(zhǎng)速度有所下降，但有一定的代謝活性，絮凝沉降性能好。 故傳統(tǒng)的活性污泥法常運(yùn)行在這個(gè)范圍。 衰亡期只出現(xiàn)在某些特殊的水處理場(chǎng)合， 如延時(shí)曝氣及污泥消化。第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性38食料/微生物比代謝速率內(nèi)源呼吸階段生長(zhǎng)率下降階段生長(zhǎng)率上升階段（沉降性能好）（沉降性能差）大多數(shù)活性污泥處理系統(tǒng)運(yùn)行范圍延時(shí)曝氣，污泥消化注意：各個(gè)階段的食物/菌量比(F/M)發(fā)生變化，相當(dāng)于活性污泥系統(tǒng)的污泥負(fù)荷。第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性微生物代謝速率與食料/微生物比的關(guān)系393、連續(xù)培養(yǎng)（continuous cultivation）是一種連續(xù)進(jìn)料又連續(xù)出料的培養(yǎng)方式根據(jù)控制因素的不同分為恒濁連

17、續(xù)培養(yǎng)（turbidostat）恒化連續(xù)培養(yǎng)（chemostat）進(jìn)料速度保持一定4. 半連續(xù)培養(yǎng)（semi-batch cultivation）、半間歇式Fill and draw第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性405. 分批補(bǔ)料式培養(yǎng)（fed batch）以低速把高濃度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)連續(xù)加入培養(yǎng)器中，但不排出物料。體積是隨時(shí)間變化的特點(diǎn)：能任意控制培養(yǎng)液中的底物濃度，所以沒(méi)有流出。供應(yīng)速度與微生物消費(fèi)速度達(dá)到平衡，所以能保持一定的濃度。主要用于： 有抑制作用的底物 生長(zhǎng)因子添加 高濃度菌體培養(yǎng)添加方法定速添加指數(shù)添加dvdt=constant第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性41四 、 微生物膜的生長(zhǎng)特

18、性1. 生物膜的生長(zhǎng)液體培養(yǎng)基中加入固體物質(zhì)(載體)，微生物在其表面吸附、生長(zhǎng)、繁殖形成形成膜，這種膜叫微生物膜。第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性42從單位固體表面積上的微生物量(mg/cm2)上看可分為6個(gè)階段a. 延滯期b. 加速增長(zhǎng)期c. 恒速增長(zhǎng)期d. 減速增長(zhǎng)期e. 安定期f. 脫落期第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性微生物膜的生長(zhǎng)模式圖43微生物膜的生長(zhǎng)過(guò)程中密度的變化隨著膜厚的增加，密度也發(fā)生變化第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性44第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性微生物膜內(nèi)部的密度變化45（1）延滯期：細(xì)胞吸附在固體表面上的過(guò)程（沉降）影響吸附速度的因子：材質(zhì)、表面性質(zhì)、形狀、細(xì)胞的性質(zhì)、操作條件

19、（2）加速增長(zhǎng)期：還沒(méi)有形成完整的膜（3）恒速增長(zhǎng)期： 活性細(xì)胞量達(dá)到最大，形成完整的膜。膜表面凹凸不平。第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性46（4）減速增長(zhǎng)期： 恒速增長(zhǎng)期與安定期的過(guò)渡期，持續(xù)時(shí)間短。（5）安定期： 增長(zhǎng)速度與脫落速度相平衡，膜量及膜厚達(dá)到最大值。（6）脫落期： 外因：流體的剪切力 內(nèi)因：微生物的死亡、氣泡的形成，細(xì)胞外高分子量的變化。第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性472. 生物膜的特性（1）有效膜厚生物膜并不是全部有活性基質(zhì)的擴(kuò)散細(xì)胞的死亡70200m（平均100 m），并不是越厚越好。第一節(jié) 微生物的生長(zhǎng)及其特性48生物膜菌群的空間分布的測(cè)定 試驗(yàn)方法 熒光原位雜交技術(shù)（FISH） 激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）用途：熒光信號(hào)的定位檢測(cè)和定量分析。熒光信號(hào)的定位檢測(cè)和定量分析。名稱EUB338NONNso190NIT3序列序列5-35-3GCT GCC TCC CGT AGG AGTACT CCT ACG GGA GGC AGCCGA TCC CCT GCT TTT CTC CCCT GTG CTC CAT GCT CCG特異性大部分細(xì)菌大部分細(xì)菌(Domain bacteria）不和任何細(xì)菌雜交氨氧化細(xì)菌氨氧化細(xì)菌（-subgroup ammonia oxidizing bacteria）硝化細(xì)菌