慢性排斥反應(yīng)移植體動(dòng)脈硬化與增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)

1、    慢性排斥反應(yīng)移植體動(dòng)脈硬化與增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)        【摘要】目的探討慢性排斥反應(yīng)移植動(dòng)脈硬化與增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)的關(guān)系。方法采用免疫組化SP法研究61只大鼠的移植動(dòng)脈，10例慢性排斥反應(yīng)移植腎動(dòng)脈組織中的PCNA表達(dá)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組：在大鼠移植動(dòng)脈中層PCNA術(shù)后7天達(dá)最高峰，內(nèi)膜層術(shù)后20天達(dá)最高峰，且細(xì)胞數(shù)明顯增多，兩者呈正相關(guān)。臨床組：移植腎動(dòng)脈PCNA表達(dá)主要集中在內(nèi)膜，其次為中層，外膜極少。結(jié)論移植動(dòng)脈硬化過(guò)程中細(xì)胞增殖與PCNA表達(dá)關(guān)系密

2、切。慢性排斥的移植腎動(dòng)脈PCNA呈高表達(dá)。且與術(shù)后早期急性排斥反應(yīng)的發(fā)生頻率及程度密切相關(guān)。【關(guān)鍵詞】移植物排斥動(dòng)脈硬化動(dòng)物，實(shí)驗(yàn) Expression of PCNA in the transplant arteriosclerosis of chronic rejectionLI Qiansheng,QIAO Zhuoyi,FANG Yuhuan,et al.(Renal Transplantation Center,Daping Hospital,the Third Military Medical University,Chongqing 400042,China)【Abstract】

3、ObjectiveTo investigated the relationship between the expression of PCNA and transplant arteriosclerosis of chronic rejection.MethodsThe expression of PCNA in the allograft arteriosclerosis of 61 rats and the transplant renal artery in 10 patients of chronic rejection were studied with immunohistoch

4、emistry SP method.ResultsIn the experiment group,the expression of PCNA in the media of transplant aorta showed a peak at 7 days postoperative,the intimal PCNA showed a peak at 20 days and the cell numbers increased.The expression of PCNA and the cell numbers showed a positive correlation.In the cli

5、nical group,the expression of PCNA was mainly found in the intimal membrane of transplant renal artery,the next was in the media,where as the exomembrane showed a few.ConclusionsThere was a close relationship between the increase of expression of PCNA and the cell proliferation.The expression of PCN

6、A in the transplant artery of chronic rejection increased.It had significant relationship with the frequency or the degree of acute rejection.【Key words】Graft rejectionArteriosclerosisAnimals,laboratery移植體動(dòng)脈硬化是慢性排斥反應(yīng)的主要病理學(xué)特征之一。目前，在移植動(dòng)脈硬化過(guò)程中細(xì)胞增殖進(jìn)程與原癌基因的表達(dá)尚缺乏了解。為明確血管細(xì)胞增殖DNA復(fù)制與增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)的相互關(guān)系，我們?cè)诮?/p>

7、立標(biāo)準(zhǔn)慢性排斥反應(yīng)動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，對(duì)移植體動(dòng)脈硬化與PCNA表達(dá)作了實(shí)驗(yàn)與臨床觀察。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)分組雄性Wistar及SD系大鼠，月齡24個(gè)月，體重120250g。同系移植對(duì)照組(Wistar-Wistar)22只，異系移植實(shí)驗(yàn)組(SD-Wistar)39只。所有動(dòng)物購(gòu)買時(shí)均證實(shí)健康未攜帶病毒，術(shù)前一周單籠飼養(yǎng)，飼料不含膽固醇及脂質(zhì)。二、血管移植取供鼠腹主動(dòng)脈1.01.5cm，肝素鹽水沖洗后置腎保存液中4冰箱保存。于受鼠腎動(dòng)脈分支下方至髂動(dòng)脈分支上方解剖斷離該段腹主動(dòng)脈，將供鼠動(dòng)脈原位對(duì)端吻合于受鼠腹主動(dòng)脈。三、材料與方法腎保存液為上海中心輸血站產(chǎn)品，鼠抗人PCNA單克隆抗體由丹麥DAKO

8、公司提供。取移植動(dòng)脈各時(shí)相點(diǎn)為術(shù)后3、7、14、20、30及60天。用SP法對(duì)各點(diǎn)標(biāo)本分別進(jìn)行PCNA檢測(cè)，計(jì)算其陽(yáng)性率。陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：PCNA陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒，除核內(nèi)有染色外，胞漿也有擴(kuò)散。每只動(dòng)物取三張切片，鏡下分別計(jì)數(shù)血管中層及內(nèi)膜著色的細(xì)胞數(shù)和未著色的細(xì)胞數(shù)，取平均值。即陽(yáng)性率=(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù))×100%。四、統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)用<"0 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100312170610846" 12 14>±s表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用t檢驗(yàn)

9、，方差分析及相關(guān)分析用Microexcel數(shù)據(jù)軟件。五、結(jié)果1.對(duì)照組：由于無(wú)明顯的內(nèi)膜增生，各時(shí)相點(diǎn)PCNA表達(dá)均為陰性。2.實(shí)驗(yàn)組：血管中層，術(shù)后3天即出現(xiàn)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞，術(shù)后7天達(dá)高峰，在靠近內(nèi)膜下區(qū)域分布較多，術(shù)后14天開(kāi)始下降，此時(shí)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞不再局限于內(nèi)膜下，而是廣泛分布于中層各處。術(shù)后30及60天，中層僅存少量散在的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞。內(nèi)膜：當(dāng)術(shù)后14天內(nèi)膜出現(xiàn)增生時(shí)，PCNA在內(nèi)膜表達(dá)相當(dāng)突出，術(shù)后20天達(dá)頂峰，說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞在內(nèi)膜的增殖達(dá)高峰。PCNA陽(yáng)性細(xì)胞在內(nèi)膜分布不均，細(xì)胞成分較多處，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞較多。術(shù)后30天開(kāi)始下降，且多分布于內(nèi)膜層近腔面區(qū)域。術(shù)后60天細(xì)胞

10、數(shù)急劇下降并僅少量殘存。PCNA表達(dá)與內(nèi)膜細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.85(表1)。表1大鼠動(dòng)脈異系移植PCNA陽(yáng)性率表達(dá)變化(<"0 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100312170610846" 12 14>±s，%)時(shí)相點(diǎn)(術(shù)后，天)內(nèi)膜中層3051±157063±461425±927±222073±2412±103036±217±5609±70    

11、 與同組前一時(shí)相點(diǎn)比較，差別有顯著性意義，P0.05臨床研究一、研究對(duì)象收集10例同種腎移植術(shù)后19年移植腎失功病理診斷為慢性排斥反應(yīng)并行腎切除的移植腎標(biāo)本。男8例，女2例。年齡2355歲。腎移植術(shù)后3個(gè)月內(nèi)發(fā)生急性排斥反應(yīng)1次3例，2次4例，3次1例，不詳2例。5例正常腎組織為對(duì)照組。二、材料與方法與實(shí)驗(yàn)組相同，即取移植腎動(dòng)脈12級(jí)分支，采用SP法行PCNA免疫組化檢測(cè)。三、結(jié)果1.PCNA表達(dá)形式：在光鏡下顯示移植腎動(dòng)脈硬化血管中PCNA陽(yáng)性細(xì)胞染色呈棕黃色顆粒，呈彌散狀或混合狀分布，不規(guī)律地表達(dá)于胞漿、胞核及胞膜，胞漿內(nèi)以混合型多見(jiàn)，核內(nèi)分布以彌散狀顆粒為主。血管壁各層均可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞

12、，其中以內(nèi)膜占相當(dāng)大的比例，包括單核、巨噬細(xì)胞及T細(xì)胞。對(duì)照組未見(jiàn)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞。2.PCNA表達(dá)部位及其陽(yáng)性率：血管壁內(nèi)膜、中層及外膜PCNA陽(yáng)性表達(dá)率分別為90%、50%及10%。表明排斥反應(yīng)時(shí)血管PCNA表達(dá)主要集中在內(nèi)膜，其次為中層，外膜極少，差別有顯著性意義，P0.05。3.PCNA表達(dá)強(qiáng)度與急性排斥發(fā)生頻率關(guān)系：腎移植術(shù)后發(fā)生急性排斥1次3例，血管內(nèi)皮細(xì)胞PCNA陽(yáng)性表達(dá)率為31%，2次4例，陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率63%，3次1例，陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率80%。即急性排斥發(fā)生頻率越高，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率越明顯，P0.05。討論一、PCNA來(lái)源、表達(dá)形式及部位PCNA作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的一個(gè)

13、重要指標(biāo)，近年來(lái)已廣泛開(kāi)展。本實(shí)驗(yàn)在異系移植動(dòng)脈硬化研究中發(fā)現(xiàn)，PCNA在血管的內(nèi)、中、外層均有不同程度的表達(dá)，且主要集中在內(nèi)膜及中層，染色呈棕黃色顆粒，彌散狀或混合狀分布，不規(guī)律地表達(dá)于胞漿、胞核及胞膜。胞漿內(nèi)以混合型顆粒為主，核內(nèi)以彌散狀顆粒為主。外膜有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，PCNA有不均勻少量的表達(dá)。因外膜中不存在平滑肌細(xì)胞增生，故推測(cè)PCNA來(lái)源于內(nèi)皮細(xì)胞、單核及巨噬細(xì)胞1。二、PCNA表達(dá)與動(dòng)脈硬化的關(guān)系本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)移植后14天，內(nèi)膜出現(xiàn)增生層，內(nèi)膜細(xì)胞PCNA陽(yáng)性表達(dá)率為25%±9%，術(shù)后20天達(dá)最高峰為73%±24%，且伴隨平滑肌細(xì)胞由中層向內(nèi)膜遷移以及遷移后細(xì)胞增

14、生。此后PCNA表達(dá)陽(yáng)性率逐漸下降。而在血管中層術(shù)后7天PCNA陽(yáng)性率達(dá)最高峰63%±24%。以后逐漸下降，反映出術(shù)后2周出現(xiàn)的“中層壞死”現(xiàn)象。由此推測(cè)，中層PCNA陽(yáng)性表達(dá)多為平滑肌細(xì)胞。有人認(rèn)為，移植動(dòng)脈中層壞死與內(nèi)膜增生其主要因素與中層平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移有關(guān)2。某些細(xì)胞因子如IGF-1，PDGF及TGF-b，或白介素及炎癥脂質(zhì)介質(zhì)等可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的遷移3。本組10例移植腎慢性排斥的動(dòng)脈硬化標(biāo)本中可見(jiàn)血管各層均有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。如單核、巨噬細(xì)胞及T細(xì)胞，尤以內(nèi)膜更為顯著。PCNA表達(dá)也主要集中在內(nèi)膜，其次為中層。雖然由于人類腎移植術(shù)后免疫抑制劑的應(yīng)用，中層壞死炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度

15、、PCNA表達(dá)程度均較動(dòng)物實(shí)驗(yàn)低，但炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)與內(nèi)膜PCNA表達(dá)及細(xì)胞增生導(dǎo)致動(dòng)脈硬化的關(guān)系密切。三、PCNA高表達(dá)與急性排斥之間的關(guān)系腎移植術(shù)后急性排斥發(fā)生頻率及強(qiáng)度是導(dǎo)致慢性排斥的主要危險(xiǎn)因素4。在移植動(dòng)脈硬化的過(guò)程中，當(dāng)給予免疫抑制劑抑制急性排斥的發(fā)生，內(nèi)膜增生可明顯受到抑制。Almond等5報(bào)告術(shù)后早期使用MMF，內(nèi)膜增生較對(duì)照組低76.3%。本組急性排斥8例移植腎動(dòng)脈標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)，急性排斥發(fā)生的頻率越高，內(nèi)膜增生越顯著。增生形式有半月?tīng)罨蛲膱A狀，嚴(yán)重者管腔完全閉塞。因此，我們認(rèn)為，腎移植術(shù)后急性排斥是導(dǎo)致移植腎動(dòng)脈硬化的重要因素。一旦發(fā)生，其改變不可逆轉(zhuǎn)。四、PCNA表達(dá)的啟動(dòng)因

16、素與增生的關(guān)系1.炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)：炎性細(xì)胞通過(guò)不相容MHC抗原識(shí)別，釋放淋巴因子(IL-1等)，通過(guò)其免疫介導(dǎo)，使其產(chǎn)生PCGF，TGF-等生長(zhǎng)因子，PCNA表達(dá)增強(qiáng)，DNA大量復(fù)制合成，出現(xiàn)細(xì)胞增生6。2.缺血與再灌注損傷：一般認(rèn)為，在冷缺血時(shí)間較短的情況下，缺血/再灌注損傷對(duì)移植動(dòng)脈硬化影響不大。相反，供體長(zhǎng)時(shí)間缺血，或再灌注性損傷，均可導(dǎo)致氧自由基的活化降低。脂蛋白氧化7，刺激細(xì)胞及生長(zhǎng)因子，促使內(nèi)膜增生及動(dòng)脈硬化。3.感染：術(shù)后早期感染，血管外膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可使內(nèi)膜增生程度加倍。而術(shù)后晚期的CMV感染可通過(guò)增強(qiáng)PDGF-BB及TGF- mRNA的表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)膜增生8。我們認(rèn)為，移植體

17、動(dòng)脈硬化過(guò)程中細(xì)胞增殖是多因素作用的結(jié)果，而PCNA的表達(dá)乃是細(xì)胞增殖的主要分子病理學(xué)基礎(chǔ)。因腎移植術(shù)后使用免疫抑制劑，使PCNA的表達(dá)強(qiáng)度較實(shí)驗(yàn)動(dòng)物弱。作者單位：李黔生(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科洗腎移植中心重慶，400042)喬著意(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科洗腎移植中心重慶，400042)方玉華(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科洗腎移植中心重慶，400042)徐序廣(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科洗腎移植中心重慶，400042)靳風(fēng)爍(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科洗腎移植中心重慶，400042)朱方強(qiáng)(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)

18、院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科洗腎移植中心重慶，400042)萬(wàn)江華(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科洗腎移植中心重慶，400042)姜慶(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科洗腎移植中心重慶，400042)吳剛(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科洗腎移植中心重慶，400042)靳文生(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科洗腎移植中心重慶，400042)參考文獻(xiàn)1，Alprs CE,Davis CL,Barr D,et al.Identification of platelet-derived growth factor:a and b chains in human

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