連翹提取物對小鼠T淋巴細(xì)胞體外活化與增殖的影響

1、連翹提取物對小鼠T淋巴細(xì)胞體外活化與增殖的影響         11-01-31 15:49:00     編輯：studa20                  作者：尹樂樂, 曾耀英*, 黃秀艷, 侯會(huì)娜【摘要】  目的: 分析連翹(FS)提取物對小鼠淋巴結(jié)T細(xì)胞的體外活化與增殖的影響, 初步探

2、討其免疫抑制作用機(jī)制。方法: 無菌分離小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞, 加入多克隆刺激劑刀豆蛋白A(ConA)進(jìn)行刺激, 利用熒光標(biāo)記的單克隆抗體(mAb)染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)(FCM), 檢測小鼠T淋巴細(xì)胞的表達(dá)的活化抗原CD69、 CD25、 CD71的表達(dá)情況; 以羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯（CFDASE）染色, 以FCM分析FS對淋巴細(xì)胞體外增殖的影響。結(jié)果: 終濃度為40、 80、 160 mg/L的FS均對ConA刺激誘導(dǎo)的T細(xì)胞CD69、 CD25和CD71的表達(dá)有降低作用(P<0.05)。CFDASE染色分析顯示, 上述濃度的FS對ConA誘導(dǎo)的小鼠T淋巴細(xì)胞增殖具有抑制作用(P<

3、;0.05)。結(jié)論: FS對ConA誘導(dǎo)的T細(xì)胞早、 中、 后期活化和體外增殖有抑制作用。 【關(guān)鍵詞】  連翹提取物 T 淋巴細(xì)胞 活化 增殖Abstract  AIM: To investigate the effect of Forsythia suspensa (FS) extract on the activation and proliferation of the mouse T lymphocytes in vitro as well as its immunosuppressive effect. METHODS: The lymphocytes were

4、isolated from the lymphoid nodes of BALB/c mice. Fluorescence conjugated monoclonal antibodies and flow cytometry were used to detect the expression of CD69, CD25 and CD 71 of the activated T lymphocytes in vitro in response to Concanavalin A (ConA). Stained with CFDASE, the mouse lymphocytes were s

5、timulated by ConA. The effect of FS extract on cell proliferation in vitro was analyzed by flow cytometry. RESULTS: FS extract decreased the expression of CD69, CD25 and CD71 at the final concentration of 40, 80 and 160 mg/L, respectively（P<0.05）. CFDASE staining showed that FS extract at differe

6、nt concentration significantly inhibited the proliferation of lymphocytes induced by ConA (P<0.05). CONCLUSION: FS extract can inhibit the activation and proliferation of T lymphocytes in response to ConA. KeywordsForsythia suspensa extract; T lymphocytes; activation; proliferation連翹(Forsythia su

7、spensa, FS )又名旱蓮子、 大翹子、 落翹等, 為木犀科植物連翹的果實(shí)。它作為傳統(tǒng)中藥廣泛應(yīng)用于對炎癥、    發(fā)熱和潰瘍等方面的治療1。同時(shí), FS的主要活性成分連翹苷在抗氧化、 抗菌、 抗病毒和解熱抗炎等方面2也起著重要的作用。兩者在藥理作用上的一致表現(xiàn)均可提示FS對機(jī)體免疫系統(tǒng)可能具有一定的調(diào)節(jié)作用。本研究中采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測了FS對刀豆蛋白A(ConA)刺激的小鼠T細(xì)胞體外活化和增殖影響, 研究其免疫學(xué)效應(yīng)并初步探討其免疫作用機(jī)制。1  材料和方法1.1  材料  清潔級BALB/c近交系小鼠(雄性, 81

8、0周齡, 體質(zhì)量1822 g), 購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。FS購自四川廣汗市維康植化有限公司, 為木犀植物連翹的干燥果實(shí)提取而成, 按干燥品計(jì)算含連翹苷不得少于0.15%。FS臨用前用RPMI1640液稀釋至所需濃度。L谷氨酰胺、 巰基乙醇、 刀豆蛋白A(ConA)購自Sigma公司。PE抗CD3單克隆抗體(mAb）、  FITC抗CD69 mAb、 PE抗CD25 mAb和PE抗CD71 mAb購自PharMingen公司。羧基熒光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFDASE)購自美國Molecular

9、Probes公司。RPMI1640培養(yǎng)基、 胎牛血清(FBS)為美國GibcoBRL公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀(FACS Calibur)為美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品。1.2  方法1.2.1  淋巴細(xì)胞懸液的制備  斷頸處死BALB/c小鼠, 無菌分離小鼠雙側(cè)頜下、 鎖骨下、 腋窩、 腹股溝和腸系膜淋巴結(jié), 去掉被膜, 于200目金屬網(wǎng)上研磨過濾, 收集細(xì)胞, 冷PBS洗滌2次（250 g, 5 min）。用RPMI1640完全培養(yǎng)液(含100 mL/L的FBS)重懸, 調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 g/L臺(tái)盼藍(lán)染色判斷活細(xì)

10、胞百分率達(dá)97%。1.2.2  淋巴細(xì)胞培養(yǎng)  將細(xì)胞密度為1×109/L淋巴細(xì)胞懸液接種于96孔板, 分別加入不同濃度的FS(終濃度為160、 80、 40 mg/L）, 每孔終體積為200 L, 然后在37、 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中預(yù)孵育4 h后加入ConA(終濃度為5 mg/L), 置于37、 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。1.2.3  CD69、 CD25和CD71表達(dá)情況檢測  采用直接免疫熒光標(biāo)記法染色。設(shè)5個(gè)實(shí)驗(yàn)組: 對照組（未加ConA和藥物刺激）, ConA組, (ConA+FS 40mg/L), (C

11、onA+FS 80mg/L), (ConA+FS 160 mg/L), 且每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。分別于細(xì)胞培養(yǎng)6、 24、 48 h后取出各孔細(xì)胞懸液離心濃縮后, 對應(yīng)上述時(shí)間點(diǎn)分別加入PE抗CD3 mAb和FITC抗CD69 mAb(6 h 檢測)或PE抗CD25 mAb(24 h檢測)或PE抗CD71 mAb (48 h檢測) 1 g/106細(xì)胞, 混勻后, 4避光作用30 min, PBS洗滌細(xì)胞2次(250 g, 5 min), 300 L PBS重懸細(xì)胞,   進(jìn)行FCM檢測。1.2.4  T淋巴細(xì)胞增殖CFDASE染色檢測  得到的淋巴細(xì)胞重懸于

12、PBS中, 按參考文獻(xiàn)3進(jìn)行CFDASE染色。CFDASE用二甲基亞砜(DMSO)溶解成10 mmol/L的儲(chǔ)存液, -20 保存。臨用前, 取適量用PBS稀釋成1 mmol/L的工作液, 備用。PBS調(diào)整淋巴細(xì)胞懸液密度為1×1010/L, 加入CFDASE工作液(終濃度為1 mol/L), 充分混勻后在37條件下輕輕振蕩10 min。然后用RPMI1640培養(yǎng)液洗滌2次(250 g, 5 min), 計(jì)數(shù), 重懸于RPMI1640完全培養(yǎng)基中, 并調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L, 接種于96孔板。設(shè)與上述相同的5個(gè)實(shí)驗(yàn)組, 每組6個(gè)復(fù)孔, 置于37、 50 mL/L CO

13、2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng), 于48 h收獲培養(yǎng)的細(xì)胞, 用PBS洗滌細(xì)胞2次, 離心濃縮后按每1×106細(xì)胞加入1 g PE抗 CD3 mAb, 混勻后室溫下避光放置30 min, PBS洗滌細(xì)胞2次, 300 L PBS重懸細(xì)胞, FCM檢測。1.2.5  FCM檢測及分析  所有樣品經(jīng)FACSCalibur流式細(xì)胞儀和CELLQuest軟件獲取。先在前散射(FSC)對側(cè)散射(SSC)二維散點(diǎn)圖中, 劃出淋巴細(xì)胞區(qū)R1, 在橫坐標(biāo)為PE抗CD3 mAb, 縱坐標(biāo)為SSC的圖中, 劃出CD3+細(xì)胞區(qū)R2, 然后對淋巴細(xì)胞上的CD69FITC等mAb及CFDASE的熒光強(qiáng)度

14、進(jìn)行檢測。其中CFDASE、 FITC為熒光1(FL1), PE為熒光2(FL2)。每管細(xì)胞懸液樣品檢測10000個(gè)細(xì)胞, 獲得的數(shù)據(jù)用CELLQuest進(jìn)行分析。1.2.6  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  統(tǒng)計(jì)分析用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS10.0進(jìn)行處理, 數(shù)據(jù)以x±s表示, 多組間比較采用方差分析, 兩兩間比較用LSDt檢驗(yàn)。2  結(jié)果2.1  FS對CD69、 CD25和CD71表達(dá)情況的影響  小鼠淋巴結(jié)T細(xì)胞在靜息狀態(tài)下很少表達(dá)CD69、 CD25和CD71。單純FS對其表達(dá)無任何上調(diào)作用。單純ConA刺激活化6 h, ConA組的CD69表達(dá)

15、明顯增加, 其百分率上升到(63.05±0.76)%。T細(xì)胞在單純ConA誘導(dǎo)活化至24 h時(shí), 組中的CD25百分率上調(diào)至(63.22±0.55)%。培養(yǎng)至48 h, 發(fā)現(xiàn)ConA組T細(xì)胞表面CD71表達(dá)百分率為(89.06±0.19)%。不同終濃度的FS加藥各組均可降低ConA介導(dǎo)的上述標(biāo)記的分子表達(dá) (P<0.05）。其中, 160 mg/L的FS的抑制率最強(qiáng), 它影響表達(dá)的各標(biāo)記分子比率分別檢測為CD69(38.85±0.33)%、 CD25(41.80±1.23)%和CD71(71.30±0.89)%, 與ConA組相

16、比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01, 表1）。T細(xì)胞早期活化表達(dá)CD69的一次代表性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。表1  FS對ConA激活的T細(xì)胞表達(dá)CD69、 CD25及CD71的影響（略）Tab 1  Influence of FS  on the expression percentage of CD69, CD25 and CD71 on activated T cells in response to ConA stimulusbP<0.01 vs ConA group.圖1  ConA激活的T細(xì)胞CD69的表達(dá)（略）Fig 1  The expression percentage of CD69 on activated T cells in response to ConA stimulus2.2  FS