放射損傷對(duì)外源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷徙定植的影響

1、放射損傷對(duì)外源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷徙定植的影響    【摘要】  研究機(jī)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)受放射損傷時(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（）的遷徙定植特性的改變，從而為應(yīng)用治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)放射損傷提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 【方法】用周齡大鼠接受線照射制作樞神經(jīng)系統(tǒng)放射損傷模型；從鼠抽取骨髓，分離和擴(kuò)增。中樞神經(jīng)系統(tǒng)受放射損傷的大鼠個(gè)月后予靜脈輸注-。于移植后幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)取腦、骨髓、肝、脾等做冰凍切片，用雙光子共聚焦紅外脈沖激光顯微鏡檢測(cè)-。 【結(jié)果】在最早內(nèi)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的骨髓中檢測(cè)到外源性陽(yáng)性細(xì)胞，至第天后實(shí)驗(yàn)組骨髓中陽(yáng)性細(xì)胞顯著多于對(duì)照組。腦內(nèi)第天未檢測(cè)到外源性陽(yáng)性細(xì)胞

2、，第天后中樞神經(jīng)系統(tǒng)受放射損傷的大鼠，腦組織檢測(cè)到帶綠色熒光的外源性陽(yáng)性細(xì)胞；而對(duì)照組腦內(nèi)一直未檢測(cè)到帶綠色熒光的外源性。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組脾臟在輸注后第天即檢測(cè)到大量陽(yáng)性細(xì)胞，并持續(xù)存在，第天實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組減少?！窘Y(jié)論】在放射損傷條件下外源性可透過(guò)血腦屏障到達(dá)腦組織，中樞神經(jīng)系統(tǒng)放射損傷可誘導(dǎo)外源性向腦組織遷徙定植。 【關(guān)鍵詞】  放射損傷 中樞神經(jīng)系統(tǒng) 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 ： 【】 （） ， （） 【】 - - - （） ， ， ， 【】 ， ， 【】 - ： ； ； 隨著干細(xì)胞工程研究的深入， 細(xì)胞替代治療已成為治療損傷、遺傳缺陷性或退行性疾病的新途徑。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（ ，

3、） 是目前備受關(guān)注的一類來(lái)源于骨髓單個(gè)核細(xì)胞群，具有多向分化潛能的組織干細(xì)胞。特性穩(wěn)定，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能。在體外特定的誘導(dǎo)條件下， 可以分化為骨、軟骨、脂肪、肌腱、韌帶等多種細(xì)胞-。作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞治療的供體細(xì)胞應(yīng)容易獲得，能夠迅速擴(kuò)增，能夠在宿主腦內(nèi)長(zhǎng)期存活，易于外源基因的轉(zhuǎn)染和長(zhǎng)期表達(dá)，。其中骨髓細(xì)胞是可能的來(lái)源之一。有實(shí)驗(yàn)表明，骨髓單個(gè)核細(xì)胞能夠穿過(guò)血腦屏障，而且有助于小膠質(zhì)細(xì)胞的正常轉(zhuǎn)化。而在中樞神經(jīng)受損傷的狀態(tài)下，外源在體內(nèi)的移行和定植特性尚未有研究報(bào)道。本文觀察到機(jī)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)受放射損傷狀態(tài)下的一些遷徙定植特性，可能為應(yīng)用治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)放射損傷和其

4、他損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。   材料與方法   實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑   實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性-大鼠只，平均體質(zhì)量 ，隨機(jī)分放射實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組分個(gè)時(shí)間點(diǎn)。綠色熒光蛋白鼠只，平均體質(zhì)量 ，作供體。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均源自英國(guó)牛津大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。   實(shí)驗(yàn)試劑 含 胎牛血清的（公司）、胰蛋白酶、抗單抗、抗單抗、抗單抗、抗單抗（公司）、碘化丙啶（公司）。   主要儀器 雙光子共聚焦紅外脈沖激光顯微鏡（ - - ）（公司）、 冷凍切片機(jī)（公司）、實(shí)驗(yàn)線照射儀-（公司）、培養(yǎng)箱（公司）。   骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離與誘導(dǎo)   的原代培養(yǎng) 無(wú)菌條件下取綠色

5、熒光蛋白鼠股骨骨髓，加入含有 的肝素液的離心管中，充分混勻。加入適量液混勻，以 （ ） 離心 ，吸凈上液；再用液洗一遍（方法同前），用含胎牛血清的完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，將其接種在 培養(yǎng)瓶中， 、體積分?jǐn)?shù)、飽和濕度的培養(yǎng)箱中原代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下每日觀察次。原代（）約貼壁細(xì)胞接近融合時(shí)，用沖洗次以除去培養(yǎng)瓶中的含血清培養(yǎng)基。以適量 胰蛋白酶-室溫消化 （冬季室溫較低，可放入溫箱 孵育），倒置相差顯微鏡下觀察，見(jiàn)到細(xì)胞變圓、間隙增寬、有部分細(xì)胞懸浮時(shí)即可加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化。并用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞進(jìn)一步脫落。將細(xì)胞懸液移入無(wú)菌離心管中，以 離心 ，棄去上清，加入適量完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)

6、胞，將細(xì)胞懸液以 接種于塑料培養(yǎng)瓶中，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。即為細(xì)胞代。待代細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)時(shí)，可繼續(xù)傳代。   的鑒定 培養(yǎng)至代時(shí)，約貼壁細(xì)胞接近融合時(shí)，用洗次除去培養(yǎng)瓶中含血清的培養(yǎng)基，以適量胰蛋白酶-室溫消化 倒置相差顯微鏡下觀察，見(jiàn)到細(xì)胞變圓、間隙增寬、有部分細(xì)胞懸浮時(shí)即可加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化。并用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞進(jìn)一步脫落。用洗次后送流式細(xì)胞儀室檢測(cè)、。      放射損傷 只雄性鼠在周齡隨機(jī)分成組：實(shí)驗(yàn)組 腦局部接受線照射；對(duì)照組作假照射。在乙醚麻醉下，實(shí)驗(yàn)組以的放射速率，接受 的線照射，線透過(guò)一個(gè)在 厚鉛板上

7、直徑的孔，保證大腦、小腦和腦干均接受線照射，而其他部位免于線照射。該方法可以導(dǎo)致胼胝體、內(nèi)囊等在照射后 周間發(fā)生遲發(fā)性壞死。   間充質(zhì)干細(xì)胞移植與檢測(cè) 取擴(kuò)增第代的，去掉培養(yǎng)液，洗遍，用 的 的胰蛋白酶和 混合液消化，用含 的洗滌后制成濃度為 × 的單細(xì)胞懸液。每只實(shí)驗(yàn)鼠和對(duì)照鼠在周齡時(shí)（即放射處理后周），從尾靜脈注入細(xì)胞懸液 ，細(xì)胞數(shù) × 。 移植后分別在第天、第天、第天、第天、第天將只實(shí)驗(yàn)鼠和對(duì)照鼠處死，取腦、肝、脾、腎、骨髓，標(biāo)本置液氮后作冰凍切片，檢測(cè)-在各組織的分布情況。切片以碘化丙啶染色（），用甘油封片，為減少熒光物質(zhì)的光漂白作用，用雙光子共聚焦紅外

8、脈沖激光顯微鏡（ - ）檢測(cè)。 結(jié) 果   的鑒定結(jié)果 培養(yǎng)至代的 生長(zhǎng)旺盛、貼壁良好、呈均勻一致的旋渦狀，移植前取 細(xì)胞懸液用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志顯示、陽(yáng)性，、陰性。   放射損傷結(jié)果 對(duì)實(shí)驗(yàn)組以 的放射速率進(jìn)行線照射，造成海馬和內(nèi)囊變性。組織學(xué)檢查顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組海馬變性、神經(jīng)元減少。   間充質(zhì)干細(xì)胞移植后遷徙和定植情況 移植后分別在第天、第天、第天、第天、第天，取腦、肝、脾、腎、骨髓，作冰凍切片，用雙光子共聚焦紅外脈沖激光顯微鏡檢測(cè)-在各組織的分布情況，每個(gè)樣本數(shù)個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算其平均值。結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在輸注后第天腦內(nèi)均未檢

9、測(cè)到綠色熒光陽(yáng)性的外源性陽(yáng)性細(xì)胞。移植后第天實(shí)驗(yàn)組海馬出現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，第天最為明顯；而對(duì)照組腦組織中未見(jiàn)有陽(yáng)性細(xì)胞（圖），經(jīng)秩和檢驗(yàn)，兩組差異有顯著性。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在移植后第天脾臟組織中出現(xiàn)大量的陽(yáng)性細(xì)胞，并且一直持續(xù)至，在第天對(duì)照組脾臟陽(yáng)性細(xì)胞明顯高于實(shí)驗(yàn)組，經(jīng)檢驗(yàn)差異有顯著性。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組骨髓均在移植后第天即出現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，但實(shí)驗(yàn)組多于對(duì)照組，經(jīng)檢驗(yàn)，在第天、第天、第天兩組差異有顯著性意義。肝臟在輸注后第天即在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組出現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，之后各時(shí)間點(diǎn)均見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，且實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（?）。腎臟僅在第天時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，且兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（?，表）。 討 論 神經(jīng)元的

10、特性決定了神經(jīng)元在損傷壞死后難以再生。隨著細(xì)胞移植研究的不斷深入和應(yīng)用，細(xì)胞替代治療已成為治療損傷、遺傳缺陷性或退行性疾病的新途徑，使神經(jīng)組織的再生成為可能。以往在神經(jīng)領(lǐng)域的細(xì)胞移植研究多數(shù)用相應(yīng)神經(jīng)部位的直接注射，這種方法在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有較好的可行性，但在臨床應(yīng)用時(shí)有很大的局限性和危險(xiǎn)性。有實(shí)驗(yàn)表明，骨髓單個(gè)核細(xì)胞能夠穿過(guò)血腦屏障。根據(jù)這一特性，應(yīng)用外周移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷存在著可能。本文在原有對(duì)放射性腦損害研究的基礎(chǔ)上，觀察中樞神經(jīng)放射損傷對(duì)外周移植后遷徙定植特性的影響。   外源性的遷徙 本研究顯示在輸注-后內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組骨髓中均檢測(cè)到陽(yáng)性細(xì)胞，推測(cè)性可以直接向骨髓遷徙。比

11、較放射照射組和對(duì)照組腦內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞可反映出外源性在中樞神經(jīng)放射損傷下的遷徙特性。結(jié)果顯示：放射照射組在外周輸注-后第天在海馬區(qū)檢測(cè)到-，第天最為明顯；而未受到放射照射的對(duì)照組，移植后腦內(nèi)一直未檢測(cè)到外源的陽(yáng)性細(xì)胞?？梢?jiàn)，一方面外源性有穿過(guò)血腦屏障的能力，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道相符，但在對(duì)照組未見(jiàn)有外源性穿過(guò)血腦屏障到達(dá)腦組織，這說(shuō)明只有在損傷等因素改變了血腦屏障特性使之一定程度開(kāi)放的前提下，外源性才能穿過(guò)血腦屏障；另一方面，觀察到外源性穿過(guò)血腦屏障后有向病損部位定向遷徙的特性。和把成年雄性小鼠的骨髓或反轉(zhuǎn)錄病毒載體標(biāo)記的骨髓移植給亞致死量放射線照射的雌性小鼠， 后便在受體雌鼠的腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)供體骨髓來(lái)源的神

12、經(jīng)細(xì)胞， 以后供體骨髓來(lái)源的神經(jīng)細(xì)胞逐漸增多。原位雜交和免疫組化法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，供體骨髓來(lái)源的神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志。等研究顯示基質(zhì)源因子-（-）有促進(jìn)向受損組織遷徙的作用。   外源性的定植 外源性在受體內(nèi)的定植很大程度上決定于其在骨髓的定植情況。本研究顯示：與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組骨髓中外源陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多?？梢?jiàn)放射損傷有誘導(dǎo)外源性在骨髓的定植作用，其機(jī)理尚未明了，可能在放射損傷時(shí)存在趨化因子受體（）的高表達(dá)，而后者有促進(jìn)向骨髓中遷徙融合的作用，。此外，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組從移植后第天，脾臟均見(jiàn)大量-，兩組無(wú)差異。這種現(xiàn)象一直持續(xù)至第天，兩組脾臟仍可見(jiàn)大量-?？梢?jiàn)，外源性移植后大量細(xì)胞將在脾臟被清除，而且這一狀態(tài)一直持續(xù)，這關(guān)乎著外源細(xì)胞的永久定植的可能性。比較一致的研究結(jié)果是移植后具有免疫耐受性不會(huì)引起宿主的免疫排斥反應(yīng)。有報(bào)道表明， 和細(xì)胞均表達(dá)組織相容性復(fù)合物而缺乏組織相容性復(fù)合物，免疫原性較弱。但異體在受體內(nèi)的遠(yuǎn)期歸宿仍然沒(méi)有定論。本研究顯示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在各時(shí)間點(diǎn)都有大量-在脾臟持續(xù)存在，這是否是在受體中的歸宿有待進(jìn)一步研究。而在第天實(shí)驗(yàn)組脾臟中-較對(duì)照組顯著減少，這是否提示經(jīng)放射處理的大鼠在輸注后，其后期的廓清減少而有利于定植？這一現(xiàn)象值得關(guān)注。 【參考文獻(xiàn)】  ， ，