甲型肝炎患者淋巴細胞糖皮質激素受體表達與血清皮質醇相關性研究

1、    甲型肝炎患者淋巴細胞糖皮質激素受體 表達與血清皮質醇相關性研究        【摘要】目的探索甲型病毒性肝炎患者外周血淋巴細胞糖皮質激素受體(GR)的表達與血清中皮質醇激素濃度的相互關系。方法分別對部分正常人和32例急性甲型肝炎患者淋巴細胞內GR表達狀況進行了流式細胞儀測定，同時應用放射免疫分析法測定其血清皮質醇含量。結果甲型肝炎患者在急性期其血清皮質醇含量顯著高于正常對照組，分別為210±76g/L，142±83g/L(患者組與正常人組

2、比較P0.01)；患者淋巴細胞內的GR含量則較正常人群明顯降低。以本研究的實測值為標準，正常人GR陽性淋巴細胞為14.2%±6.88%，而患者組降低至8.5%±4.07%，GR表達與血清皮質醇含量間呈明顯的負相關。結論血清皮質醇水平與GR受體間存在對應關系并可能與患者的免疫狀態(tài)與病情密切相關?！娟P鍵詞】受體，糖皮質激素流式細胞術肝炎，甲型A study on glucocorticoid receptor expression in PBL lymphocyte and its relation with serum glucocorticosteroid contents

3、 in type A hepatitis patientsHan Huanxing, Kong Xiantao, Zhang Guozhi, et al. Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003【Abstract】ObjectiveIn order to study the glucocorticoid receptor (GR) expression in lymphocyte and its relation with serum glucocorticosteroids conten

4、ts in acute hepatitis A patients. MethodsGR expression in lymphocyte was measured with flowcytometer and serum glucocorticosteroids contents were determined with RIA respectively in 32 acute type A hepatitis patients and 30 health persons. ResultsLymphocyte GR expressions in patients in acute stage

5、of the disease are obviously lower than that of control group and the proportion of GR positive lymphocytes decreased from 14.2%±6.88% to 8.5%±4.07%, whereas the serum glucocorticosteroids levels are markedly higher in patients than that of health group (210±76g/L142±83g/L).Concl

6、usionThere is a negative correlation between the two parameters and the abnormal serum glucocorticosteroids contents and GR expression in patients may be related to the course of the disease.【Key words】Receptors glucocorticoidFlow cytometryHepatitis A病毒性肝炎是嗜肝病毒侵入肝細胞復制、增殖，引發(fā)一系列免疫損傷的傳染性疾病。在某種程度上，病原所致的

7、損傷主要是自身免疫性損傷1，2。糖皮質激素(GH)廣泛作用于機體免疫系統(tǒng)，對免疫反應有直接影響，因而，研究肝炎患者淋巴細胞內GR含量、分布變化與血清糖皮質激素水平有助于闡明患者皮質激素系統(tǒng)與免疫性損傷的關系，對免疫治療有一定指導意義。已有眾多學者對不同疾病患者淋巴細胞內的GR含量以及糖皮質激素的治療效應做了探索35，作者尚未見對甲型肝炎(甲肝)患者做相應研究的報道。 材料與方法一、材料來源正常對照血取自健康供血者，標本血系1987年3月至1990年6月間收住長海醫(yī)院傳染科的住院患者，明確診斷為急性甲肝(參照1984年全國肝炎會議修訂的診斷標準)，取晨8點靜脈血。其中正常組，男性17例，女性13

8、例，年齡2140歲之間；患者組男性21例，女性11例，年齡為1748歲，平均年齡26.4歲。熒光素標記GR配體DF(FITC-Dexamethoson)系本室與第二軍醫(yī)大學藥學系合作標記產(chǎn)品6，地塞米松購自上海第十二藥廠。1640培養(yǎng)液為日本制藥株式會社產(chǎn)品，糖皮質激素放免測定試劑盒購自上海生物制劑所，流式細胞儀為美國Coulter公司產(chǎn)品(EPICS-C)。二、方法(一) 血清分離測定取各血樣1ml，凝固后吸出血清用放射免疫分析法做GH測定，操作按說明書進行。(二) 淋巴細胞懸液制備取普通干燥試管列為二排，一排為競爭抑制管，分別標以C1 C2 C3(Competetive)，另一排為測定管，

9、標為D1 D2 D3(Determination)管。用微量移液管取對照及待測抗凝血0.1ml分置上述C、D各管內，各管加紅細胞溶解液4ml，震蕩使血細胞充分懸浮，置5分鐘并待紅細胞完全溶解后以2 000×g離心3分鐘，棄上清。沉淀細胞以含2%小牛血清的PBS液懸浮并洗滌一次，再以1640液4ml懸浮，置37溫箱30分鐘，離心沉淀細胞再以PBS調至0.5ml。(三) 細胞懸液與熒光配體反應于上述C管和D管內，加入2 mol DF 10l，各C管內再單獨加入400倍于DF濃度的地塞米松。用1640液調至1ml，此時，管內DF濃度為1mol。置試管于25溫箱90分鐘，間斷搖動。溫育畢，用

10、4 PBS(含2%小牛血清)終止反應并洗滌3次，最后沉淀細胞以1640液將細胞調至1×106個/ml待測。(四) 流式細胞儀檢測應用測定GR的專用程序，調整散射光參數(shù)劃出淋巴細胞群，調節(jié)激光功率和相關參數(shù)，使對照標本的陽性細胞界定范圍5%，以同樣條件測定各D管，標本的陽性細胞率以測定值減去平均對照值表示。結果一、外周血淋巴細胞內GR的測定見附表。附表GR陽性淋巴細胞和血清GH水平分組例數(shù)GR陽性細胞(%)血清GH(g/L，<"01 (919 bytes)" src="/med/cano/201003/20100315200515864"

11、15 21>±s)正 常 人30 14.20±6.88142±83甲肝患者328.50±4.07*210±76*     *患者與正常人的GR陽性細胞率比較t=3.02，P0.01 *患者與正常人的血清皮質醇含量比較t=2.71，P0.01二、資料的統(tǒng)計學處理對個體而言，淋巴細胞的陽性率是一項相對指標，但對群體而言，可把它看作計量資料。應用非配對資料t檢驗對上述兩組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，t1=3.02(P0.01),t2=2.71(P0.01)。外周血淋巴細胞內的GR測定已有報道，均為同位素標記配體測

12、出的GR平均含量7，8。機體中的皮質醇含量波動很大，且受多種因素影響，因人、時間、狀態(tài)不同而異。本研究統(tǒng)一以晨8點的血標本做血清總皮質醇測定，并排除了妊娠和情緒等其它因素。結果顯示患者組的GH水平明顯高于正常組。三、GR表達與血清皮質醇含量相關性分析比較上述檢測結果，可見在甲肝患者，皮質醇水平升高與GR受體表達量的下降間呈明顯的負相關趨勢。GR是皮質醇激素的效應受體，機體中的皮質激素必須首先與其結合才能發(fā)揮作用，因而激素受體的表達是影響皮質激素生物效應的最基本的因素。已有眾多報道揭示GR表達與細胞或機體生物效應間的相互關系9。討論糖皮質激素對機體免疫系統(tǒng)影響的研究由來已久，有實驗表明，在糖皮質

13、激素的作用下，淋巴細胞對抗原和植物分裂原的刺激反應明顯減弱或出現(xiàn)無反應性，某些患者在接受激素治療時早期即有淋巴細胞減少和血清免疫球蛋白降低。血清中的GH與細胞內的GR間存在互調關系10，11，即血漿皮質激素升高，可使細胞內的GR表達減少。急性肝炎患者血漿皮質醇升高可能是肝功能障礙引起GH轉化及代謝異常、應激等多種因素的綜合結果。細胞對糖皮質激素的反應性與GR含量有關12，因此，細胞內GR 減少會使細胞對皮質激素的反應性降低，表現(xiàn)在對免疫反應的影響上則是免疫抑制作用減弱，從而使患者處于免疫紊亂狀態(tài)，促成了感染繼發(fā)性免疫損傷。鑒于GH在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用，血清GH測定和細胞內GR的

14、研究頗多。以前的研究多應用放射同位素3H標記法，以細胞群為研究對象測定GR的表達情況，所測的GR位點從3326±1387到6617±979個/細胞不等8，11。放射配體研究有其測定精確的特點，但無法了解具體單個細胞的GR表達情況，難以將細胞的GR表達與生物效應直接聯(lián)系起來。本試驗所做GR的熒光標記配體測定是以單個細胞為基礎，觀察GR的表達狀況，GR含量的多少在測定中表現(xiàn)為熒光強度差異(Channal)，這對于進一步的細胞功能研究有重要意義。配合細胞的分選功能(Sorting)，可對細胞的GR表達與免疫效應間的關系進行更細致地探討。此外，糖皮質激素用于肝炎治療一直是臨床上關注

15、的問題。以上研究提示，肝炎患者淋巴細胞內的GR含量不同，可導致對糖皮質激素的反應不同，從而直接影響到用藥效果。如果對反應不佳的患者應用大劑量激素則可能會突出副效應，顯然是弊大于利。綜上所述，有關GR與免疫關系的深入研究，對認識肝病發(fā)病機制，對某些疾病的臨床診斷和治療都有較大的實用價值。作者單位：200003 上海，第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院（韓煥興、孔憲濤、張國治、李石）；第二軍醫(yī)大學藥學系（周廷森）參考文獻1Chisari FV, Ferrari C. Hepatitis B virus immunopathogenesis. Ann Rev Immunol, 1995,13:29-60.2Lem

16、on SM. Type A viral hepatitis: New developments in an old disease. N Engl J Med, 1985,313:1059-1067.3Murakami T, Inakuma S, Ohsawa N, et al. Effect of PHA on concentration of glucocorticoid receptors in lymphocytes from patients with connective tissue diseases. Chin Chem, 1986, 32: 621-623.4Saldiva

17、PHN, Brentani MM, Carvalho CRR, et al. Changes in the pulmonary glucocorticoid receptors in the course of interstetial disease. Chest, 1985, 88:417-419.5Traynor A. Recent advances in hormonal therapy for cancer. Curr Opin Oncol, 1995, 7:572-581.6韓煥興，孔憲濤，張國治，等.流式細胞儀用于熒光素標記糖皮質激素受體的淋巴細胞研究.免疫學雜志，1990，6：

18、265-267.7Steiner AE, Wittliff JL. Concentration of glucocorticoid receptor sites in normal human lymphocytes. Chin Chem, 1986,32:80-83.8Martins VR, Birolli MIA, Duarte AJS, et al. Glucocorticoid receptor in subpopulations of human lymphocytes defined by monoclonal antibodies. Cellular Immunol, 1987,105:443-446.9Jusko WJ. Pharmacokinetics and receptor-mediated pharmacodynamics of corticosteroids. Toxicology, 1995, 102:189-196.10Shimojo M, Hiroi N, Yakushiji F, et al. Differences in down-regulation of glucocorticoid receptor mRNA by cortisol, prednisolone and dexamethasone in HeLa cell