變形鏈球菌表面粘結素與唾液受體結合特異性的初步研究

1、    變形鏈球菌表面粘結素與唾液受體結合 特異性的初步研究        【摘要】目的研究變形鏈球菌表面粘結素與唾液受體間的對應結合關系。方法采用3H標記的變形鏈球菌（簡稱變鏈）競爭性粘附抑制實驗及自行設計的間接酶聯免疫受體結合實驗，檢測純化唾液受體與純化變鏈表面粘結素間的結合特異性及其強度。結果唾液IgA降解片段和相對分子質量為13 000的酸性蛋白僅促進變鏈粘附，唾液淀粉酶具有促進粘附及抗粘附雙重作用。相對分子質量為127 000的變鏈表面粘結素及GTF組分分

2、別可競爭抑制變鏈對IgA降解片段及淀粉酶的粘附，蛋白質P1和相對分子質量為117 000的粘結素可同時競爭抑制變鏈對此二種唾液組分的粘附；間接酶聯免疫受體結合實驗表明各變鏈粘結素不與IgA降解片段有效結合。結論變鏈在牙面的粘附是多種粘結素與唾液受體共同作用的結果?！娟P鍵詞】鏈球菌，變異受體，免疫 A study on the conjugation of Streptococcusmutans adhesins and its salivary receptorsZHAN Ling,LIU Tianjia，FU Mingde, et al.School of Stomatology, West

3、 China University of Medical Sciences, Chengdu 610041【Abstract】ObjectiveTo investigate the conjugation specificity of Streptococcus mutans' adhesins and their salivary receptors. MethodsInclude purified salivary receptor or adhesin competitive bacteria adhesion inhibition test and enzyme linked

4、immuno-receptor assay (ELIRA) on S. mutans WD9463A. ResultsSalivary amylases can both enhance and competitively inhibit the adhesion of the strain to HA, while IgA degraded fragments and MW=13 000 protein only promote its adhesion. P1 and a 117 000 surface protein of WD9463A both inhibit adhesion of

5、 the strain to IgA degraded fragments and salivary amylases. An 127 000 protein of WD9463A and a kind of GTFase inhibit its adhesion to IgA degraded fragments and salivary amylases respectively. No conjugation was found between IgA degraded fragments and the adhesins, while reaction between amylases

6、 and the adhesins had basically accordance with adhesion inhibition test. ConclusionThe adhesion of S. mutans is a result of reaction between multireceptors and multiadhesins.【Key words】Streptococus，mutans Receptors，immunologic變形鏈球菌（血清型C，以下簡稱變鏈)對牙面的粘附是其表面粘結素與牙面唾液獲得性膜(salivary acquried pellicle, SAP)

7、受體的特異性結合，了解其結合的特異性，可為特異性地抑制該菌在牙面的粘附、控制菌斑形成及防治齲病的發(fā)生提供理論基礎。目前，對變鏈牙面粘附機理的研究已成為國內外齲病研究的熱點，但有關粘附受體配體結合特異性的研究卻很少1，2。我們通過對純化變鏈表面粘結素及其SAP受體對變鏈粘附的競爭抑制實驗和酶聯免疫受體粘附實驗，探討了變鏈粘附受體配體結合的特異性，以期深入認識變鏈在牙面粘附初始階段的分子機理。材料和方法一、變鏈SAP受體、表面粘結素的來源及鑒定變鏈SAP受體從實驗性SAP中純化，變鏈表面粘結素從細菌培養(yǎng)上清中純化，二者分別經PAGE、SDS-PAGE、IEP-PAGE確認為單一蛋白質組分。此外還采

8、用淀粉酶活性測定、GTF活性測定、免疫雙擴散實驗、氨基酸組分分析以及細菌粘附或粘附競爭抑制實驗鑒定、篩選受體或粘結素。我們選用了8種變鏈SAP受體和4種變鏈粘結素成分3進行研究，其組分名稱及成分見表1、2。表1游離SAP組分對細菌粘附的競爭抑制實驗結果(，cpm)包被成分包被成分組成陰性對照陽性對照實驗組抑制率(%)SAG1D1非糖酰化淀粉酶6842 0411 37149SAG2糖?；矸勖?842 1681 07473SAG3糖?；矸勖?842 627637100SBG1D1IgA降解片段5011 2881 08925SBG2D1IgA降解片段5011 4061 3635SBG3D1糖?；?/p>

9、淀粉酶6842 0401 06672SBG4糖?；矸勖?841 264601100*SBG3D2酸性蛋白（13 000）5019339600*注：SAP：唾液獲得性膜；抑制率（%）=1-（實驗組-陰性對照組）/（陽性對照組-陰性對照組）×100%；*當實驗組<陰性對照組時，抑制率為100%；*當實驗組>陽性對照組時，抑制率為0 表2變鏈表面粘結素對其與SAP受體粘附的競爭抑制實驗抑制成分抑制成分組成粘附抑制率（%）SBG1D1SBG2D1SBG3D1SAG1D1SAG3SBG4陽性對照組人血清白蛋白000000MD3S1127 000糖蛋白73694432435MD3S

10、2P1757791998181MD3S3GTF475994756134MD5S1117 000蛋白875095915370二、細菌粘附實驗 1. 細菌的培養(yǎng)及標記：將變鏈(C)地方株WD9463A接種于含370 MBq/L3H-胸腺嘧啶核苷的TPY培養(yǎng)基中，微需氧(80%N2、10%CO2、10%H2)37培養(yǎng)18小時，離心收集菌細胞，KCl緩沖液洗3次，將菌細胞懸浮于含5 g/L人血清白蛋白的KCl緩沖液中，550nm調A=0.62。2 純SAP組分對細菌粘附的競爭抑制實驗：用純化的SAP組分(0.1 g/L)包被HA，洗3次，加人血清白蛋白封閉，后加入80 l菌懸液和20 l純化SAP組分

11、(0.5 g/L)，陽性對照組則加入菌液和20 l 人血清白蛋白 (0.5g/L)37旋轉1小時，洗3次后進行液閃計數，陰性對照組用KCl緩沖液包被HA，其余步驟同陽性對照組。實驗均用雙孔法。3 變鏈表面粘結素對細菌粘附的競爭抑制實驗：用純化SAP組分包被HA，人血清白蛋白封閉后加入純化變鏈表面粘結素100 l(0.5 g/L)，37旋轉1小時，對照組加100 l 人血清白蛋白，洗3次，加菌懸液100 l，處理1小時，洗滌后進行液閃計數。陽性對照及陰性對照分別用全唾液和KCl緩沖液包被HA。實驗均用雙孔法。三、間接酶聯免疫受體結合實驗（ELIRA）此方法根據ELISA實驗原理建立，用于直接測定

12、變鏈表面蛋白與唾液受體間的結合。實驗組、陰性和陽性對照組分別用100 l 純化SAP組分（2.5 mg/L）、包被緩沖液或純化變鏈表面粘結素（10 mg/L），4過夜，洗3次，1%牛血清白蛋白37封閉1小時，洗3次，前兩組加入100 l與陽性對照組一致的純化變鏈表面粘結素，陽性對照組加入洗滌液，37保溫1小時，洗3次后加入100 l兔抗變鏈表面蛋白粗純品血清（1:200）37保溫2小時，洗滌, 加入100 l HRP-羊抗兔IgG(1:5 000) 37保溫2小時，洗5次, 加入底物液反應30 min，2 mol/L硫酸終止反應，以波長492 nm進行比色。結果一、純SAP組分對變鏈粘附的競爭

13、抑制實驗結果由表1可見，游離唾液淀粉酶組分可不同程度抑制變鏈粘附，其中SAG3和SBG4幾乎可完全阻斷變鏈粘附；而IgA降解片段及相對分子質量為13 000的酸性蛋白的作用很弱。二、變鏈表面粘結素對變鏈粘附的競爭抑制實驗結果由表2可見，相對分子質量為127 000的表面蛋白可強烈抑制變鏈對IgA降解片段的粘附；蛋白P1對細菌及5種唾液成分的粘附均有較強抑制作用；GTF組分主要競爭抑制細菌與淀粉酶的粘附；相對分子質量為117 000的蛋白可強烈抑制細菌對一IgA片段及2種淀粉酶的粘附。三、酶聯免疫受體粘附實驗結果由表3可見，4種變鏈粘結素組份均不與SBG1D1，SBG2D1發(fā)生有效結合；MD3S

14、2，MD3S3，MD5S1可與4種淀粉酶組份有效結合。表3粘附相關蛋白ELIRA測定結果包被成分SBG1D1SBG2D1SBG3D1SBG4SAG1D1SAG3MD3S11.20.71.71.41.31.5MD3S22.01.85.44.93.07.2MD3S31.31.04.23.72.24.2MD5S11.81.84.04.33.03.4注：此表中的測定結果為陽性對照組與陰性對照組的光吸收值之比，當比值>2.1時為陽性 討論一、變鏈粘附隱匿受體的存在及唾液淀粉酶組分在其粘附中的雙重作用本研究發(fā)現，IgA降解片段及相對分子質量為13 000的酸性蛋白在吸附于HA上時可促進變鏈的粘附，但

15、不競爭抑制其粘附；在直接測定變鏈表面蛋白與各種唾液受體間的結合關系的ELIRA實驗中，它們也不與任何一種測試的變鏈表面粘結素成分有效結合，提示它們?yōu)樽冩溤谘烂娴碾[匿受體，IgA片段的促粘附作用也許不是通過抗原抗體反應進行的，它具有高度的特異性。作者在過去的研究中還發(fā)現唾液中的IgA成分呈現出多型性，而不同表型的IgA在變鏈粘附中的作用亦不同，IgA降解片段SBG1D1及SBG2D1可促進變鏈粘附，而其它IgA組分則作用很弱3，提示口腔內細菌產生的IgA酶的降解作用可減少SIgA的抗粘附作用，并增強它對粘附的促進作用。由于這類受體不誘導細菌凝集，故不利于細菌的清除，因此在細菌對牙面的粘附中有十分

16、重要的作用。本實驗中還發(fā)現幾種唾液淀粉酶組分既能明顯促進變鏈對HA的粘附，又可有效地競爭抑制其粘附，說明它們在變鏈粘附中具有雙重作用。其中兩種酶組分在低濃度時即可完全阻斷細菌粘附，提示其抗粘附作用更為重要。二、變鏈表面粘結素與其唾液受體結合特異性的初步研究我們通過純化變鏈表面粘結素對該菌與純化SAP組分包被HA粘附的競爭抑制實驗發(fā)現：變鏈表面相對分子質量為127 000粘結素可有效抑制該菌對唾液IgA降解片段的粘附，提示其以IgA降解片段為受體；P1和相對分子質量為117 000的表面蛋白則可同時有效抑制細菌對IgA降解片段和唾液淀粉酶組分的粘附，提示它們可能有兩類受體；而GTF酶組分MD353主要抑制細菌與淀粉酶的粘附，故主要以淀粉酶為受體。這一結果提示變鏈在牙面的粘附是多種粘結素與多種受體共同作用的結果。作者單位：詹玲劉天佳岳松齡周學東（610041 成都，華西醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院），傅明德（基礎醫(yī)學生化教研室）參考文獻1Russell MW, Mansso-Rahemtulla B. Interaction between surface protein antigens of Str