外周血淋巴細胞RNA提取(總結(jié))_第1頁
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文檔簡介

1、一外周血淋巴細胞RNA提取1. 外周血淋巴細胞分離提?。?0ml 人外周血血樣（EDTA-2K抗凝管采集）稀釋血樣：DHanks 以1:1稀釋加入淋巴細胞分離液（稀釋血樣：淋巴細胞分離液=2:1）室溫，2000rpm/min 離心20min吸取單個核細胞層DHanks洗滌細胞1500 rpm/min 離心10minDHanks洗滌細胞1000 rpm/min 離心10min收集淋巴細胞沉淀（細胞計數(shù)：約1×107個細胞）2. 外周血淋巴細胞RNA提?。?×107個淋巴細胞中加入1ml TriZol，4靜置5min，裂解加入200ul氯仿，上下顛倒至溶液出現(xiàn)漿白色，無分相現(xiàn)象

2、置于冰上5min；4，12000rpm/min，離心15 min將上層水相移入另一離心管，加等體積異丙醇，冰上孵育10min4，12000rpm/min，離心10 min棄上清，在沉淀（含RNA）中加1ml 75%乙醇洗滌4，12000 rpm/min，離心5 min，得到RNA沉淀；空氣干燥后，用適量TE或無RNase水溶解備用RNA濃度：1400g/l，OD260/OD280=2.00淋巴細胞分離液：上海華精生物高科技有限公司標準號：Q/GHSB 85-2001 批號：040524二1st-Strand cDNA合成反應(yīng)：1. 在Microtube中配制下列混合液試劑使用量Oligo dT

3、 Primer (50M1ldNTP Mixture (10mM each1l模板RNA Total RNA：5g以下（4l）RNase Free dH2OUp to 10l2. 65保溫5min后，冰上迅速冷卻。3. 在上述Microtube中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，總量為20l。試劑使用量上述變性后反應(yīng)液10l5×PrimerScript Buffer4lRNase Inhibitor (40U/l0.5l (20UPrimerScript RTase (200U/l1l (200URNase Free dH2OUp to 20l4. 緩慢混勻。5. 按下列條件進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42 30-60min，95 5min，冰上冷卻。以PET28a為載體表達產(chǎn)物N端帶有可以被thrombin酶切的組氨酸標簽，上游primer：5-GGAATTCCATATGACCTGCTGCAGTCTACAC -3 (Nde I酶切位點以及保護堿基下游primer：5-CCGC

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