牛奶中恩諾沙星和環(huán)丙沙星檢測試紙的研制及性能測定

1、牛奶中恩諾沙星和環(huán)丙沙星檢測試紙的研制及性能測定何丹婷 , 李艷偉 , 師 偉 , 趙 寧 , 徐 飛(北京市維德維康生物技術(shù)有限公司 , 北京 100085收稿日期 20110526文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 10021280(2011 09003604中圖分類號 S85984摘 要 應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)建立了恩諾沙星和環(huán)丙沙星快速檢測試紙 , 并對試紙條的檢測限 、特異性和穩(wěn)定性等參數(shù)進行了確定 。 結(jié)果表明 , 該試紙條對牛奶樣本的檢測限為 50g /L, 能夠特 異性地檢測恩諾沙星和環(huán)丙沙星 , 與液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測的陰性樣本符合率為 978%。 該試 紙條在 2 8 或室溫可

2、保存 12個月 , 可應(yīng)用于恩諾沙星在牛奶中的快速篩查現(xiàn)場檢測 。 關(guān)鍵詞 恩諾沙星 ; 膠體金免疫層析技術(shù) ; 快速檢測試紙基金項目 :農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目 (2010GB2A000009作者簡介 :何丹婷 (1984年 , 碩士 , 從事動物源性食品安全檢測技術(shù)研究 。 E mail :dantinghesinacom 通訊作者 :徐 飛 。 E mail :aaaxufeiyahoocomcnResearch and Trait Identification of Colloidal Gold Strip for RapidDetection of Enrofloxacin and

3、Ciprofloxacin in MilkHE Dan ting , LI Yan wei , SHI Wei , ZHAO Ning , XU Fei(Beijing WDWK Biotechnology Co, Ltd , Beijing 100085, China Abstract :The rapid test strip for detection of enrofloxacin and ciprofloxacin was developed based on colloidal gold immune chromatographic technology ,and its tech

4、nical parameters , such as sensitivity , specificity and stability were tested respectivelyThe results showed that the LOD of the strip was 50g /Land was specific forenrofloxacin and ciprofloxacin detectionThe coincidence rate of negative samples was 978%compared with LC MS /MSThe rapid test strip c

5、an be stored at 2 8 or room temperature for at least 12months and be applied for rapid enrofloxacin screening in milkKey words :enrofloxacin ; gold immune chromatographic assay ; rapid test strip 恩諾沙星 (Enrofloxacin 與環(huán)丙沙星是屬于喹 諾酮類化學(xué)合成的抑菌劑 , 廣泛應(yīng)用于畜禽和水產(chǎn) 養(yǎng)殖中支原體和細(xì)菌性疾病預(yù)防與治療 , 但長期使 用會造成組織中藥物殘留而影響人類健康 , 因此對

6、恩諾沙星和環(huán)丙沙星的檢測分析具有良好的經(jīng)濟效益和重要的社會意義12。 國內(nèi)外已有微生物 法 、 色譜法 、 電化學(xué)法和免疫分析法研究的報道 。本文應(yīng)用制備的恩諾沙星的單克隆抗體 (mAb 和 膠體金免疫層析技術(shù) (GICA 研制出殘留快速檢測膠體金試紙 , 以期為基層大規(guī)模的初篩提供快速 、簡便的檢測方法 。 1材料與方法 11材料 111實驗儀器Biodot 噴膜機 , 美國 Biodot 公司產(chǎn)品 ; 恒溫電磁攪拌器 , 國華電器 ; 切條機 , 上海韓港電子科技 ; 電熱恒溫培養(yǎng)箱 , 天津中環(huán) 。 112試劑和動物氯金酸 、 檸檬酸三鈉等化學(xué) 試劑 , 北京化學(xué)試劑公司 ; 恩諾沙星等

7、各種交叉反應(yīng)藥物為常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)品 , DrEhrenstorfer Gmbh 公司 產(chǎn)品 ; 牛 血 清 白 蛋 白 (BSA 、 卵 清 蛋 白 (OVA , Sigma 公 司 ; 羊 抗 鼠 IgG , 為 美 國 Jackson Immune Research 公司產(chǎn)品 ; 包被原由北京市維德維康生物 技術(shù)有限公司制備 。Balb /c小鼠和新西蘭大白兔 , 國家獸藥安全評 價中心實驗動物房提供 ; 人工抗原 CIF BSA (分子 結(jié)合比為 11 1 、 分泌恩諾沙星特異性抗體細(xì)胞株 (編 號 ENR5F1 、 腹 水 抗 體 (間 接 ELISA 效 價 1 256 105 、 抗體亞

8、型 IgG1, 均為北京市維德維 康生物技術(shù)有限公司制備保存 。12方法 35121膠體金制備和質(zhì)量鑒定 采用檸檬酸三鈉 還原法制備膠體金 , 方法參見文獻 69。122金 標(biāo) 抗 體 的 制 備 和 純 化 01mol /LK 2 CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液 pH 值至 82, 將 10mL 膠體金 溶 液 加 入 50mL 燒 杯 中 , 電 磁 攪 拌 器 250 r /min攪拌 , 逐滴加入 1mL 含 035mg 恩諾沙星抗 體蛋白溶液 。 逐滴加入 3mL 5%BSA , 持續(xù)攪拌 10min 。金標(biāo)抗體溶液常溫低速 (1500r /min 離心 20 min , 棄去由凝聚的金顆粒形

9、成的沉淀 。 紅色上清 溶液 2 8 , 11000r /min離心 40min 。 溶液 分為三層 , 透明上清 、 管底可流動的暗紅色沉淀及 管底壁上黑色致密的金顆粒層 。 將可流動的暗紅 色沉淀轉(zhuǎn)移到另外一個離心管中 , 用含 1%BSA 的 001mol /L磷酸鹽緩沖溶液 (PB 混懸至原量 。 平 衡過夜 , 同上重復(fù)離心 2次 。 最后用 1%BSA 的 001mol /LPB (含 002%疊氮鈉 將沉淀混懸為原 體積的 1/40, 2 8 保存 。123膠體金免疫層析試紙的制備 用玻璃纖維 XYZ3050Biodot 三維噴點平臺系統(tǒng)以 8L /cm將 膠體金標(biāo)記的恩諾沙星單

10、克隆抗體點噴在玻璃纖 維上 , 37 烘干 30min ; 用 XYZ3050三維噴點平臺 系統(tǒng)以 08L /cm將抗原 (05mg /mL 點噴在硝 酸纖維素膜上 , 即為檢測線 ; 在離檢測線 4mm 處噴 上羊抗鼠 IgG (08mg /mL , 即為質(zhì)控線 , 37 干 燥 2h 。 在塑料背板上依次粘貼樣品墊 、 結(jié)合釋放 墊 、 硝酸纖維素膜 、 吸收墊 , 并在樣品墊外面粘貼保 護膜 。124待檢樣品的處理與結(jié)果判定 取新鮮原奶 樣品 600L , 加入樣品稀釋液混勻后 , 80 水浴 2 min 后 , 用滴管取 6 8滴滴于樣品孔中 , 5min 后判 定結(jié)果 。 若樣品為陰

11、性 , 加樣后在 T 區(qū)出現(xiàn)一條紫 紅色條帶 ; 若樣品為陽性 , 則 T 區(qū)不會出現(xiàn)紫紅色 條帶 。 無論樣品中有無恩諾沙星存在 , C 區(qū)都會出 現(xiàn)一條紫紅色條帶 。125膠體金免疫試紙檢測限的測定 用陰性牛 奶配制恩諾沙星和環(huán)丙沙星的標(biāo)準(zhǔn)溶液 , 終濃度分 別為 10、 25、 50、 75、 100g /L, 按要求對樣品處理后 進行檢測 , 每份樣品重復(fù) 5次 , 5min 后目測判斷 結(jié)果 。126膠體金免疫試紙?zhí)禺愋缘臏y定 取恩諾沙 星 、 環(huán)丙沙星 、 氧氟沙星 、 氟甲喹 、 諾氟沙星 、 二氟沙 星 、 達(dá)氟沙星 、 四環(huán)素 、 鏈霉素 、 阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品 , 進 行交叉反

12、應(yīng)率的測定 , 確定試紙條的特異性 。 127膠體金免疫試紙穩(wěn)定性的測定 取三個不 同批次的膠體金試紙 , 分別置于 2 8 和室 溫 , 于保存的第 0、 1、 3、 6、 9、 12個月取出 , 用陰性牛 奶配制恩諾沙星的標(biāo)準(zhǔn)溶液 3份 , 終濃度為 25、 50、 75g /L, 按要求對樣品處理后進行檢測 , 每份樣品 重復(fù) 5次 , 5min 后目測判斷結(jié)果 。128假陽性率的測定 取經(jīng) LC MS /MS確證 的陰性牛奶 50份 , 編號為 1# 50#。 按要求對樣品 處理后進行檢測 , 每份樣品重復(fù) 5次 , 5min 后目測 判斷結(jié)果 。129假陰性率的測定 取經(jīng) LC MS

13、 /MS確證 的陰性牛奶 120份 , 按農(nóng)業(yè)部第 235號公告規(guī)定的 檢測限濃度 (100g /L 添加恩諾沙星和環(huán)丙沙星 各 60份 , 按要求對樣品處理后進行檢測 , 5min 后 目測判斷結(jié)果 。1210儀器比對 取 50份空白牛奶樣品 , 隨機 添加恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品 , 制成 50份盲樣 。 分別采用 膠體金免疫試紙和液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜 (LC MS / MS 兩種手段進行測定 , 依照下面公式計算陰性樣 本的符 合 率 。 儀 器 方 法 參 照 GB /T213122007 動物源性食品中 14種喹諾酮藥物殘留檢測方法 液相色譜 質(zhì)譜 /質(zhì)譜法 所述進行操作 10。 陰性樣本符合率

14、=LC MS /MS陰性樣本檢出數(shù) 100%。 2結(jié) 果21膠體金免疫試紙檢測限 從表 1的結(jié)果可以 看出 , 恩諾沙星及環(huán)丙沙星添加濃度為 50、 75、 100g /L時檢測結(jié)果全為陽性 , 添加濃度為 25g /L時僅有一份恩諾沙星樣品檢測為陽性 , 因此本試紙 條在牛奶中恩諾沙星的檢測限為 50g /L。表 1膠體金免疫試紙檢測限的測定藥物添加濃度 /(g ·L 1 10255075100+恩諾沙星 +環(huán)丙沙星 +22膠體金免疫試紙?zhí)禺愋?試紙條與喹諾酮類 主要藥物及其他類藥物交叉反應(yīng)率的結(jié)果如表 2所示 。 測定的結(jié)果表明 , 膠體金試紙條與喹諾酮類 藥物中除恩諾沙星和環(huán)丙

15、沙星外的其他喹諾酮類 藥物的交叉反應(yīng)率均不到 50%, 與四環(huán)素 、 鏈霉素 和阿維菌素不存在交叉反應(yīng)率 , 因此膠體金免疫試 紙能夠特異性地檢測恩諾沙星和環(huán)丙沙星 。表 2試紙條與喹諾酮類主要藥物的交叉反應(yīng)率 藥物 交叉反應(yīng)率 /%恩諾沙星 1000環(huán)丙沙星 950氧氟沙星 368氟甲喹 296諾氟沙星 156二氟沙星 102達(dá)氟沙星 98四環(huán)素 01鏈霉素 01阿維菌素 0123膠體金免疫試紙穩(wěn)定性 在空白牛奶樣品 中 , 按照 25、 50、 75g /L三個濃度進行添加 , 每個 濃度添加 5份 , 用試紙條進行檢測 , 試驗結(jié)果如表 3所示 。 結(jié)果表明 , 恩諾沙星試紙條在保存于

16、2 8 或者室溫條件下 , 可以穩(wěn)定放置 12個月而不影 響檢測能力 , 說明該試紙條的穩(wěn)定性良好 , 保存期 可以長達(dá) 1年 。表 3膠體金免疫試紙穩(wěn)定性的測定結(jié)果添加濃度2 825g /L50g /L75g /L室溫 (25 2 25g /L50g /L75g /L第 0個月 5份陰性 5份陽性 5份陽性 5份陰性 5份陽性 5份陽性 第 1個月 5份陰性 5份陽性 5份陽性 5份陰性 5份陽性 5份陽性 第 3個月 5份陰性 5份陽性 5份陽性 5份陰性 5份陽性 5份陽性 第 6個月 5份陰性 5份陽性 5份陽性 5份陰性 5份陽性 5份陽性 第 9個月 5份陰性 5份陽性 5份陽性

17、5份陰性 5份陽性 5份陽性 第 12個月 5份陰性 5份陽性 5份陽性 5份陰性 5份陽性 5份陽性24假陽性率 對 50份 LC MS /MS確證的陰性 牛奶用膠體金免疫試紙測定 , 結(jié)果如表 4所示 。 結(jié) 果顯示 50份陰性牛奶中僅有 1份樣本用試紙結(jié)果 檢測為陽性 , 通過計算得出 , 試紙條的假陽性率為 98%。表 4陰性牛奶樣品測定結(jié)果樣品編號 結(jié)果1# 10#11# 20#+21# 30#31# 40#41# 50#25假陰性率 按 100g /L終濃度添加恩諾沙 星至 LC MS /MS確證的 60份陰性牛奶中 , 編號 1 # 60#; 按 100g /L終濃度添加環(huán)丙沙星

18、至 LC MS /MS確證的 60份陰性牛奶中 , 編號 61# 120#, 試紙的檢測結(jié)果如表 5所示 。 結(jié)果表明對 120份 添加的牛奶樣本檢測結(jié)果均為陽性 , 通過計算得 出 , 本試紙條的假陽性率為 0, 能夠準(zhǔn)確地檢測出牛 奶樣本中的恩諾沙星與環(huán)丙沙星 。表 5陰性牛奶樣品測定結(jié)果樣品編號 結(jié)果1# 10#+ 11# 20#+ 21# 30#+ 31# 40#+ 41# 50#+ 51# 60#+ 61# 70#+ 71# 80#+ 81# 90#+ 91# 100#+ 101# 110#+ 111# 120#+26儀器比對 分別采用儀器方法 11和試紙條 方法對 50份盲樣進行測

19、定 , 陰陽性判斷的臨界值為 50g /L。 經(jīng) LC MS /MS測定 , 50份樣品中有 45份為 陰 性 樣 本 , 5份 陽 性 (3#、 21#、 26#、 38#、 41# 。 經(jīng)試紙條測定 , 44份為陰性樣本 , 6份為陽 性樣本 (3#、 5#、 21#、 26#、 38#、 41# 。 試驗結(jié)果表 明 , 本試紙條與 LC MS /MS檢測陰性樣本符合率 為 978%。3討 論恩諾沙星屬于小分子物質(zhì) , 采用競爭抑制法對 其進行檢測 , 在建立方法時應(yīng)特別注意對膠體金顆 粒的吸附量和包被抗原量的摸索 。 恩諾沙星單克 隆抗體在進行金標(biāo)時 , 運用分光光度計測定法和目 測法來

20、選擇膠體金與抗體之間的最適比 , 以減少目 測法時人為因素過多的干涉 , 使膠體金能與抗體最 大限度的結(jié)合 。農(nóng)業(yè)部的 235號公告 12規(guī)定了恩諾沙星在牛 奶中的最高殘留限量為 100g /L, 因此建立方法時 必須考慮設(shè)定合適的檢測限 。 抗原的包被量過高 , 會使試紙條的靈敏度降低 ; 過低 , 會使在合格范圍 內(nèi)的被檢樣品判為不合格 。 通?；鶎邮褂媚z體金 試紙作為初篩 , 篩選為陽性的結(jié)果 , 再用儀器進行 確診 。 如果靈敏度過高 , 不僅增加了檢測機構(gòu)的工 作量 , 同時會造成牛奶生產(chǎn)者的損失 。公告同時也對牛羊的肌肉 、 脂肪和內(nèi)臟組織中 恩諾沙星的最高殘留限量做出了規(guī)定 ,

21、這需要在今 后的工作中摸索動物組織中恩諾沙星的提取方法 , 以使本試紙條有更廣泛的應(yīng)用 。參考文獻 :1姜利英 , 謝小品 , 崔光照 , 等 動物性食品中喹諾酮類藥物殘 留檢測方法的研究進展 J 鄭州輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報 , 2008, 4 (23 :142董志遠(yuǎn) , 趙曉鳳 , 宮秀杰 , 等 牛奶中氟喹諾酮類藥物殘留量 檢測方法的研究 J 中國獸藥雜志 , 2008, 42(10 :14163李忠秋 , 馬 紅 , 郭鎮(zhèn)華 , 等 免疫膠體金技術(shù)基本原理及其在 疾病檢測中的應(yīng)用進展 J 黑龍江畜牧獸醫(yī) , 2006, 9:16184范國英 , 陳永耀 , 王順崗 , 等 鏈霉素快速檢測試紙條的

22、研制 及其性能測定 J 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報 , 2010, 19(2 :40445劉 烜 , 鄭文杰 , 賀 艷 膠體金免疫層析法快速檢測組織樣品 中喹諾酮類藥物殘留 J 食品研究與開發(fā) , 2009, 5:1311346李俊鎖 , 邱月明 , 王 超 獸藥殘留分析 M 上海 :上海科學(xué) 技術(shù)出版社 , 20027吳永寧 , 邵 兵 , 沈建忠 獸藥殘留檢測與監(jiān)控技術(shù) M 北 京 :化學(xué)工業(yè)出版社 , 20078Bassab C , Syamal RManufacturing High Quality Goldsol J IVD Technology , 2001, 8:46549楊利國 , 胡少昶 , 魏平華 , 等 酶免疫測定技術(shù) M 南京 :南 京大學(xué)出版社 , 199810劉秀麗 三種檢測牛奶中氟喹諾酮類藥物殘留方法的比較研 究 D 內(nèi)蒙古 :內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) , 200911GB /T213122007動物源性食品中 14種喹諾酮類藥物殘留 檢測方法液相色譜 質(zhì)譜 /質(zhì)譜法 S 12中華人民共和國農(nóng)業(yè)部第 235號公告 S 檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭